一種1-1型人血漿結合珠蛋白提取液的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種1-1型人血漿結合珠蛋白提取液的制備方法，將低溫保存的含1-1型結合珠蛋白的人血漿離心上清依次進行硫酸銨分級沉淀和聚乙二醇沉淀，以提取1-1型人血漿結合珠蛋白供精細純化使用。本方法制備的提取液中1-1型人血漿結合珠蛋白純度大于50％，低溫操作、方法溫和，非常適合作為從人血漿中大規模純化1-1型結合珠蛋白的粗提取方法。
【專利說明】 一種1-1型人血漿結合珠蛋白提取液的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于蛋白質分離純化工藝【技術領域】，具體地說，涉及蛋白質分離純化工藝中一種1-1型人血漿結合珠蛋白提取液的制備方法。
【背景技術】
[0002]結合珠蛋白(haptoglobin, Hp)又稱觸珠蛋白，是一種廣泛存在于哺乳動物血液等體液的酸性糖蛋白，主要通過肝臟合成和降解，其含量受脂多糖、細胞因子、激素等調節，屬于急性期反應蛋白。結合珠蛋白分子由a、β亞基組成，在多數哺乳動物中以(ai3)2的構型存在，而人結合珠蛋白存在1-1、2-1、2-2三種主要亞型，這主要是由a亞基的多樣性造成的。人結合珠蛋白a亞基由等位基因Hpl、Hp2編碼，Hpl編碼亞基(分子量約9.1kDa)，Hp2編碼a2亞基(分子量約16kDa)。人結合珠蛋白1_1型是由2個亞基、2個β亞基組成的呈啞鈴狀的四聚體分子[(%β)2];人結合珠蛋白2-1型是由ai亞基、a2亞基、β亞基組成的多聚體分子[(%β)2(&2β)η];人結合珠蛋白2-2型是由a2亞基、β亞基組成的多聚體分子[(a2i3)n]。結合珠蛋白與游離血紅蛋白緊密結合形成蛋白復合物，引導血紅蛋白進入降解代謝程序，阻止游離血紅蛋白損傷機體；另外越來越多的研究表明結合珠蛋白亞型與感染、糖尿病、腫瘤、心血管疾病等病理狀態存在相關性，有的亞型具有作為疾病治療蛋白質藥物的潛力。
[0003]進行結合珠蛋白相關研究，尤其是以人血漿結合珠蛋白為材料的藥物開發研究，需要大量高純度人血漿結合珠蛋白，然而人血漿結合珠蛋白的分離提取一直面臨效率低、成本高等問題，一直沒有能夠實現高效率、低成本的大規模純化。最早的人血漿結合珠蛋白純化方法由Jayle、Boussier> Tonnelat等人于1956年建立,他們利用鹽析和制備電泳分離結合珠蛋白，由于制備電泳的產量非常低，此方法制備的結合珠蛋白僅適于研究使用。CBLaurell于1959年建立了包括硫酸銨沉淀、冷丙酮沉淀、冷乙醇沉淀等方法在內的純化方法，該方法提高了產量，但丙酮、乙醇等有機溶劑可能對結合珠蛋白得結構造成破壞，殘留的丙酮、乙醇可能危害人體健康。GE Connell等、Hideo Hamaguchi分別于1961年、1969年建立了以陰離子交換層析為核心的純化方案，包括硫酸銨分級沉淀、分子排阻層析、多次陰離子交換層析等眾多步驟，效率低而耗時長:(I)分子排阻層析樣品處理量小、耗時長，由于人結合珠蛋白分子量分布區間很寬，純化效果不佳且回收率低；(2)多達4-6次陰離子交換層析增加了人力和時間成本，且進一步降低了回收率。抗體親和層析技術的應用，大大提高了結合珠蛋白純化效率，通過不同亞型結合珠蛋白抗體親和填料可實現分型提取，但抗體親和層析填料制備復雜、成本高、使用壽命短，不適于作為大量純化提取方法。
[0004]充分利用粗提取工藝去除雜蛋白，再通過單次陰離子交換層析、疏水層析等效率高、成本低的工藝進行精細純化，是大規模純化人血漿結合珠蛋白的理想方式。選擇粗提取工藝時，應盡量選擇不損傷蛋白質、對人體無毒性、對環境無污染的方法。鹽析是常用的蛋白質粗提取方法，蛋白質在鹽析過程中空間結構、功能基團不受破壞，發生可逆沉淀。硫酸銨沉淀是應用最普遍的鹽析方法，但Jayle、CB Laurell>Hideo Hamaguchi等人的研究已經證實僅僅通過硫酸銨沉淀無法充分去除雜蛋白，必須引入其他的蛋白質粗提取工藝。
[0005]聚乙二醇是經美國食品藥品監督管理局(FDA)批準的蛋白質表面修飾劑，其生物毒性很低，也有將其用于蛋白質粗純化的報道。聚乙二醇沉淀蛋白質的機制尚不明確，沒有特定的規律可循，需要考慮的因素包括溫度、酸堿度、聚乙二醇分子量、聚乙二醇含量等，一般需經精密設計的實驗來確定目的蛋白質能否通過聚乙二醇沉淀進行粗提取。LijingSun等曾報道通過聚乙二醇10000從冷乙醇沉淀的人血漿組分IV中粗提取結合珠蛋白的方法，其主要過程包括:(I)將人血漿冷乙醇沉淀組分用生理鹽水溶解，離心取上清并調節酸度值至6.5 ； (2)邊攪拌邊緩慢加入聚乙二醇10000至質量體積比(m/v) 10%，室溫靜置30min ； (3)高速離心，將沉淀以緩沖液重懸浮。該方法的不足之處在于，冷乙醇沉淀法可能對蛋白質結構、功能基團造成破壞，應盡量避免采用，而上述聚乙二醇10000粗提取方法正是建立在冷乙醇沉淀的基礎上；另外該方法提取前，體系中雜蛋白種類已經很少，不能用于從血漿中直接提取結合珠蛋白，因此應用范圍受到很大限制。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種1-1型人血漿結合珠蛋白提取液的制備方法，該方法利用硫酸銨沉淀、聚乙二醇沉淀依次對含有1-1型人結合珠蛋白的血漿進行分級沉淀，可以滿足陰離子交換層析、疏水層析等大規模精細純化工藝要求，通過該方法制備的1-1型人血漿結合珠蛋白提取液，其結合珠蛋白含量顯著提高，符合大規模精細純化要求。
[0007]為實現上述目的，本發明所述的1-1型人血漿結合珠蛋白提取液的制備方法，在(TC環境條件下按照以下步驟進行:
[0008]I)將一份低溫冷藏的含有1-1型結合珠蛋白的人血漿充分冰浴，高速離心取上清液；
[0009]2)步驟I)所得上清液中加入硫酸銨至0°C時終飽和度35?40%，冰浴20?30min后高速離心，取上清液加入硫酸銨至0°C時終飽和度65%?70%，冰浴20?30min后高速離心，取沉淀；
[0010]3)步驟2)所得沉淀用雙蒸水溶解，加入pH5.0?6.0緩沖鹽溶液使緩沖鹽溶液的最終濃度為50?100毫摩爾，用雙蒸水補足至與步驟I)中離心上清液相同的體積；
[0011]4)步驟3)所得溶液中加入以pH5.0?6.0緩沖鹽溶液溶解的分子量為3000?4500的聚乙二醇，使緩沖鹽溶液最終濃度為50?100毫摩爾，聚乙二醇的最終質量體積比濃度為15?20%，冰浴20?30min后，高速離心取上清液，得到1_1型人血漿結合珠蛋白提取液。
[0012]步驟3)、4)所述的緩沖鹽溶液為磷酸鹽溶液或檸檬酸鹽溶液或醋酸鹽溶液。
[0013]人血漿中含有冷凝蛋白質，低溫冷藏時冷凝蛋白質將從血漿中沉淀析出。將冷藏的人血漿充分冰浴一段時間，可以使血漿中冷凝蛋白質的析出更充分，并在0°c高速離心過程中沉淀到離心管底部而去除。去除的冷凝蛋白質可作為結合珠蛋白純化的副產物，產生更高的經濟效益。
[0014]人結合珠蛋白是酸性蛋白質，其等電點約為4.8-5.3，本發明在選擇的pH5.0-6.0之間的緩沖體系，更容易使人結合珠蛋白在等電點附近析出。另外，同一硫酸銨溶液的飽和度隨著溫度的降低而升高，本發明采用0°c的沉淀溫度，可以減少硫酸銨的用量，提高了經濟效益。
[0015]聚乙二醇沉淀工藝中的影響因素包括蛋白質性質、溫度、酸堿度、聚乙二醇分子量、聚乙二醇含量等。 申請人:對上述影響因素進行研究，發現1-1型結合珠蛋白純化時，聚乙二醇分子量介于3000-4500之間最合適-分子量小的聚乙二醇需要增加用量，分子量大的聚乙二醇粘度大，離心時沉淀的蛋白質不易沉降到離心管底部。溫度下降時，1-1型結合珠蛋白的溶解度降低， 申請人:選擇0°C的沉淀溫度，減少了聚乙二醇的使用量，提高了經濟效益；本發明將體系的PH控制在5-6之間，與1-1型結合珠蛋白的等電點接近，此時更容易發生沉淀，從而減少聚乙二醇的使用量，進一步提高經濟效益。通過硫酸銨沉淀得到的1-1型人結合珠蛋白粗提液中還含有以白蛋白、免疫球蛋白等為主的大量雜蛋白，再以聚乙二醇沉淀工藝進行一次提取，去除了大部分雜蛋白，經SDS-PAGE鑒定1-1型結合珠蛋白純度大于50%，已經滿足陰離子交換層析、疏水層析純化等大規模純化工藝的要求。
[0016]本發明所述的制備方法具備以下優勢:(I)所有操作在低溫下進行，減少結合珠蛋白降解、微生物繁殖的發生率；(2)利用硫酸銨沉淀、聚乙二醇沉淀依次對含有1-1型人結合珠蛋白的血漿進行分級沉淀，提取方法溫和，最大限度的保護1-1型人血漿結合珠蛋白的結構與功能；(3)體系中未引入可能具有毒性的物質。
[0017]本方法適用于從新鮮采集或過期人血漿中直接提取1-1型結合珠蛋白，所制備的人血漿結合珠蛋白提取液中1-1型結合珠蛋白含量得到顯著提高，可以滿足陰離子交換層析、疏水層析等大規模精細純化工藝要求，非常適合作為從人血漿中大規模純化結合珠蛋白的粗提取方法。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1和圖2分別是含1-1型結合珠蛋白的人血漿按照本發明方法制備的硫酸銨分級沉淀提取液的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖和免疫印跡圖；圖中，M為蛋白質分子量標準品；1為sigma公司各型結合珠蛋白混合物標準品；2為1-1型人血漿冰浴離心上清液；3為人血漿冰浴離心沉淀；4為硫酸銨終飽和度40% (0°C )時離心沉淀；5為硫酸銨終飽和度65%(0°C )時離心沉淀；6為硫酸銨終飽和度65% (0°C )時離心上清。
[0019]圖3和圖4分別為對1-1型結合珠蛋白硫酸銨提取液進行聚乙二醇分級沉淀所得組分的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖和免疫印跡圖；圖中，M為蛋白質分子量標準品；1為sigma公司各型結合珠蛋白混合物標準品；2為1-1型結合珠蛋白血漿的硫酸銨終飽和度65%(0°C )時的離心沉淀；3為加入聚乙二醇4500至最終質量體積比濃度為15%后的離心沉淀；4為加入聚乙二醇4500至最終質量體積比濃度為15%后的離心上清。
【具體實施方式】
[0020]人血漿來自血站過期人血漿，采用SDS-PAGE電泳或PCR分型法進行分型，其它試劑均采用市售的分析純產品。
[0021]在0°C環境條件下制備1-1型人血漿結合珠蛋白提取液:
[0022]I)將經鑒定含有1-1型結合珠蛋白的人血漿50毫升充分冰浴，8000轉/分鐘離心10分鐘除去冷凝蛋白質，得到上清液49毫升；
[0023]2)步驟I)所得上清液中加入硫酸銨粉末11.074克，使0°C時硫酸銨終飽和度達到40%，冰浴20?30min后8000轉/分鐘離心10分鐘，得到上清液46毫升，加入硫酸銨粉末7.038克，使(TC時硫酸銨終飽和度達到65 %，冰浴20?30min后8000轉/分鐘離心20分鐘，取沉淀；
[0024]參見圖1和圖2，當1-1型人血漿結合珠蛋白位于硫酸銨終飽和度65% (0°C )時離心沉淀中，經過硫酸銨分級沉淀提取，去除了大量雜蛋白，為后續的聚乙二醇分級沉淀奠定了基礎。
[0025]3)步驟2)所得沉淀用雙蒸水溶解，加入0.4M醋酸鈉-醋酸pH5.0緩沖溶液6.25毫升，使醋酸鹽溶液的最終濃度為50?100毫摩爾，用雙蒸水補足溶液體積至50ml，得到溶解液；
[0026]4)將聚乙二醇4500加入0.4M醋酸鈉-醋酸pH5.0溶液中，配成質量體積比為50%的溶液。取21.43毫升50%聚乙二醇溶液加入步驟3)所得溶解液中，使聚乙二醇的最終質量體積比濃度為15%，冰浴20?30min后，8000轉/分鐘離心10分鐘取上清液，得到1-1型人血漿結合珠蛋白提取液。
[0027]參見圖3和圖4，通過聚乙二醇4500對1_1型結合珠蛋白人血漿硫酸銨沉淀提取物進行再次提純得到的提取液，進一步去除了雜蛋白，使通過陰離子交換層析、疏水層析等精細工藝進行1-1型結合珠蛋白的低成本、高效率大量純化成為現實。
[0028]所得1-1型人血漿結合珠蛋白提取液，經SDS-PAGE檢測其提取液中含1_1型人血衆結合珠蛋白大于50%。參見圖3。
【權利要求】
1.一種1-1型人血漿結合珠蛋白提取液的制備方法，其特征在于，在(TC環境條件下按照以下步驟進行: 1)取低溫冷藏的含有1-1型結合珠蛋白的人血漿充分冰浴，高速離心取上清液； 2)步驟I)所得上清液中加入硫酸銨至(TC時終飽和度35?40%，冰浴20?30min后高速離心，取上清液加入硫酸銨至0°C時終飽和度65%?70%，冰浴20?30min后高速離心，取沉淀； 3)步驟2)所得沉淀用雙蒸水溶解，加入pH5.0?6.0緩沖鹽溶液使緩沖鹽溶液的最終濃度為50?100毫摩爾，用雙蒸水補足至與步驟I)中離心上清液相同的體積； 4)步驟3)所得溶液中加入以pH5.0?6.0緩沖鹽溶液溶解的分子量為3000?4500的聚乙二醇，使緩沖鹽溶液最終濃度為50?100毫摩爾，聚乙二醇的最終質量體積比濃度為15?20%，冰浴20?30min后，高速離心取上清液，得到1_1型人血漿結合珠蛋白提取液。
2.權利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟3)、4)所述的緩沖鹽溶液為磷酸鹽溶液或檸檬酸鹽溶液或醋酸鹽溶液。
【文檔編號】C07K1/30GK104327178SQ201410613876
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年10月31日 優先權日:2014年10月31日
【發明者】劉良明, 臧家濤, 李濤 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學野戰外科研究所