中國林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造體B2-N26-V5K及其應用的制作方法
【專利摘要】一種中國林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造體B2-N26-V5K，含有26個氨基酸殘基，分子量2613.21Da，理論等電點10.60，序列為GLLSKFKGVLKTAGKNVAKNVAGSLL。在制備抗大腸桿菌藥物、抗多重耐藥大腸桿菌H1藥物、抗肺炎克雷伯氏菌藥物、抗糞嗜冷桿菌藥物、抗鮑氏不動桿菌藥物、抗痢疾志賀氏菌藥物、抗金黃色葡萄球菌藥物、抗枯草芽孢桿菌藥物、抗藤黃微球菌藥物中的用途。它具有結構簡單、細胞毒性小、人工合成方便等優點。
【專利說明】中國林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造體B2-N26-V5K及其應 用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于多肽【技術領域】，具體涉及到中國林蛙抗菌肽BreVinin-2CE改造體 B2-N26-V5K。
【背景技術】
[0002] Brevinin-2 抗菌膚是 1992 年在JapanesepondfrogR.brevipoda的皮膚分 泌物中首次被分離出來，近年來在娃的胃部組織中也發現了brevinin-2家族抗菌肽。 Brevinin-2具有廣譜的抗菌活性，不僅對革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌、某些真菌具有 非常強的殺菌活性，而且對許多臨床耐藥菌同樣具有作用。除此之外，brevinin-2還具有 刺激胰島素釋放的功能。針對brevinin-2的藥用開發則蘊含著巨大的臨床治療藥物制備 價值。
[0003] 隨著青霉素等傳統抗生素的大規模和不恰當使用，微生物對傳統抗生素產生了越 來越強的耐受性，在臨床上已經出現了大量完全能夠耐受青霉素等傳統抗生素的微生物， 已有的抗生素對這些病原微生物無能為力。抗菌肽是一種新型的抗微生物多肽，大多數抗 菌肽分子量小于l〇〇〇〇Da，帶正電，富含疏水氨基酸殘基，能夠形成兩親性的結構。到目前 為止，人們認為抗菌肽的殺菌機制主要是通過靜電相互作用吸引并結合到帶負電的細菌細 胞膜表面，進一步在細菌細胞膜上形成跨膜的孔洞，導致細菌細胞內容物的外泄，從而導致 細菌細胞的死亡。而傳統抗生素主要是作用于細菌細胞內的一些酶類。正是由于作用方式 的不同，抗菌肽介導的殺菌作用遠遠快于傳統抗生素，并且不易使細菌產生耐受性。除此之 夕卜，越來越多的文獻報道表明抗菌肽還具有其他的殺菌機制，如抑制細菌細胞壁的合成、改 變細菌細胞質膜抑制隔膜形成、激活自溶素、抑制細胞內酶活性、抑制DNA、RNA和蛋白質的 合成。
[0004] 很多兩棲類動物在中國屬于傳統中藥和民族藥物而廣泛應用，如中華蟾蜍（Bufo gargarizans),大暖鈴蟾（Bombianmaxima),黑斑娃（Pelophylaxnigromaculata),沼娃 (Hylaranaguentheri)和澤娃（Euphlyctislimnocharis)等。這些兩棲類動物的皮膚和 內臟具有廣泛的藥理活性和臨床療效。已報道藥理活性有廣譜抗微生物作用、抗腫瘤、鎮 痛、局部麻醉、免疫調節、心血管系統作用等。在國外，兩棲類皮膚特定藥理活性單體化合物 的尋找已是新藥研發的熱點。目前，國外有許多公司正在進行抗菌肽的研發工作，已有多種 抗菌肽進入臨床試驗階段。如來源于多粘桿菌的PolymixinB-Colistin-Colomycin用于 治療革蘭氏陰性菌引起的皮膚感染，已上市。來源于非洲爪蟾magainin的MSI-78對糖尿 病患者的足部潰瘍有顯著療效且副作用小，已進入臨床III期試驗階段。來源于豬protegrin 的IB-367用于治療腫瘤患者口腔潰瘍，已進入臨床I期試驗。來源于人lactoferrin的 hLF-1-l用于治療骨髓干細胞移植相關的感染，已進入臨床II期。除此之外，一些用于傷口 愈合，內毒素感染，腫瘤，病毒感染的抗菌肽也已進入臨床試驗階段。
[0005] 我國對兩棲類藥物的應用有悠久的歷史，但對其活性成分和藥理性質的研究主要 集中于生物堿等有機小分子，對其皮膚活性肽類物質研究不多。
[0006] 發明人將本發明的中國林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造體B2-N26-V5K全序列氨基 酸結構經NCBI蛋白質數據庫進行搜尋比對，未發現有任何相同多肽。
【發明內容】
[0007] 本發明所要解決的技術問題在于提供一種具有的抗菌活性的中國林蛙抗菌肽 fcevinin-2CE改造體B2-N26-V5K。
[0008] 本發明所要解決的另一個技術問題在于為中國林蛙抗菌肽Brevinin_2CE改造體 B2-N26-V5K提供一種新用途。
[0009]解決上述技術問題所采用的技術方案是：中國林娃抗菌肽Brevinin_2CE改造體， 命名為B2-N26-V5K，含有26個氨基酸殘基，分子量2613. 21Da，理論等電點10. 60,序列為 GLLSKFKGVLKTAGKNVAKNVAGSLL〇
[0010] 其合成方法如下：
[0011] (1)設計中國林娃抗菌肽Brevinin-2CE改造體序列
[0012] 中國林娃Brevinin_2CE的蛋白序列號為GenBank:ADD51562. 1，通過截斷 Brevinin-2CE的C端11個氨基酸并將第五位的纈氨酸替換為賴氨酸，設計中國林蛙抗菌肽 fcevinin-2CE改造體，其序列為GLLSKFKGVLKTAGKNVAKNVAGSLL。
[0013] (2)合成中國林蛙抗菌肽fcevinin-2CE改造體B2-N26-V5K
[0014] 采用固相合成法，用自動多肽合成儀合成其全序列，通過HPLC反相柱層析脫鹽純 化，得中國林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造體，確定其純度，應大于95%，用ESI-MS測其分子 量，計算理論等電點。
[0015] 本發明采用截短、替換方法設計Brevinin-2CE的改造體B2-N26-V5K，該抗菌肽 不僅對多種致病菌有非常強的殺滅作用，而且對臨床分離的多重耐藥菌具有很好的抑制作 用，具有結構簡單、細胞毒性小、人工合成方便等有益特點。
【具體實施方式】
[0016] 下面結合實施例對本發明進一步詳細說明，但本發明不限于下述的實施例。
[0017] 實施例1
[0018] 中國林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造體，命名為B2-N26-V5K，含有26個氨基酸殘 基，分子量 2613. 21Da，理論等電點 10. 60,序列為GLLSKFKGVLKTAGKNVAKNVAGSLL。
[0019] 上述中國林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造體B2-N26-V5K的合成方法如下：
[0020] (1)設計中國林娃抗菌肽Brevinin-2CE改造體序列
[0021] 中國林娃Brevinin_2CE的蛋白序列號為GenBank:ADD51562. 1,通過截斷 Brevinin-2CE的C端11個氨基酸并將第五位的纈氨酸替換為賴氨酸，設計中國林蛙抗菌肽 Brevinin-2CE改造體的序列為GLLSKFKGVLKTAGKNVAKNVAGSLL，是一種直鏈多肽，含有26個 氨基酸殘基。
[0022] (2)合成中國林蛙抗菌肽fcevinin-2CE改造體B2-N26-V5K
[0023] 采用固相合成法，用自動多肽合成儀合成其全序列，通過HPLC反相柱層析脫鹽純 化，得中國林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造體B2-N26-V5K，確定其純度，應大于95%。
[0024] (3)測試分子量、計算理論等電點
[0025] 用ESI-MS測其分子量，分子量為2613. 21Da。
[0026] 用網站http://web.expasy.org/protparam/計算理論等電點，測定結果為：理論 等電點為10. 60。
[0027] 實施例2
[0028] 中國林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造體B2-N26-V5K(以下簡稱B2-N26-V5K)在制 備抗大腸桿菌藥物中的用途，其使用方法如下：
[0029] B2-N26-V5K 2000ug
[0030] 注射用水 加至1000mL
[0031] 按藥劑學注射劑的常規方法制備成注射劑，每毫升含活性成分B2-N26-V5K2yg， 成人用量每天肌肉注射一次，每次1瓶2mL。
[0032] 實施例3
[0033] B2-N26-V5K在制備抗多重耐藥大腸桿菌H1藥物中的用途，其使用方法如下：
[0034] B2-N26-V5K 4000ug
[0035] 注射用水 加至1000mL
[0036] 按藥劑學注射劑的常規方法制備成注射劑，每毫升含活性成分B2-N26-V5K4iig， 成人用量每天肌肉注射一次，每次1瓶2mL。
[0037] 實施例4
[0038] B2-N26-V5K在制備抗肺炎克雷伯氏菌藥物中的用途，其使用方法如下：
[0039] B2-N26-V5K 8000 ug
[0040] 注射用水 加至1000mL
[0041] 按藥劑學注射劑的常規方法制備成注射劑，每毫升含活性成分B2-N26-V5K8yg， 成人用量每天肌肉注射一次，每次1瓶2mL。
[0042] 實施例5
[0043] B2-N26-V5K在制備抗糞嗜冷桿菌藥物中的用途，其使用方法如下：
[0044] B2-N26-V5K 8000 ug
[0045] 注射用水 加至1000mL
[0046] 按藥劑學注射劑的常規方法制備成注射劑，每毫升含活性成分B2-N26-V5K8iig， 成人用量每天肌肉注射一次，每次1瓶2mL。
[0047] 實施例6
[0048] B2-N26-V5K在制備抗鮑氏不動桿菌藥物中的用途，其使用方法如下：
[0049] B2-N26-V5K 15000ug
[0050] 注射用水 加至1000mL
[0051] 按藥劑學注射劑的常規方法制備成注射劑，每毫升含活性成分B2-N26-V5K15yg， 成人用量每天肌肉注射一次，每次1瓶2mL。
[0052] 實施例7
[0053] B2-N26-V5K在制備抗痢疾志賀氏菌藥物中的用途，其使用方法如下：
[0054] B2-N26-V5K 4000ug
[0055] 注射用水 加至lOOOmL
[0056] 按藥劑學注射劑的常規方法制備成注射劑，每毫升含活性成分B2-N26-V5K4yg， 成人用量每天肌肉注射一次，每次1瓶2mL。
[0057] 實施例8
[0058] B2-N26-V5K在制備抗金黃色葡萄球菌藥物中的用途，其使用方法如下：
[0059]B2-N26-V5K 16000ug
[0060] 注射用水 加至1000mL
[0061] 按藥劑學注射劑的常規方法制備成注射劑，每毫升含活性成分B2-N26-V5K16yg， 成人用量每天肌肉注射一次，每次1瓶2mL。
[0062] 實施例9
[0063] B2-N26-V5K在制備抗枯草芽孢桿菌藥物中的用途，其使用方法如下：
[0064] B2-N26-V5K 4000ug
[0065] 注射用水 加至1000mL
[0066] 按藥劑學注射劑的常規方法制備成注射劑，每毫升含活性成分B2-N26-V5K4iig， 成人用量每天肌肉注射一次，每次1瓶2mL。
[0067] 實施例10
[0068] B2-N26-V5K在制備抗藤黃微球菌藥物中的用途，其使用方法如下：
[0069]B2-N26-V5K 8000ug
[0070] 注射用水 加至1000mL
[0071] 按藥劑學注射劑的常規方法制備成注射劑，每毫升含活性成分B2-N26-V5K8i!g， 成人用量每天肌肉注射每天一次，每次1瓶2mL。
[0072] 為了驗證活性成分B2-N26-V5K的有益效果，發明人進行了細胞實驗如下：
[0073]1、檢測B2-N26-V5K抑菌活性
[0074] 吸取4iiL保存于甘油中的實驗菌株接種到4mLMH液體培養基中，30°C或 37°C220rpm震蕩培養14-16h至對數生長期，利用稀釋平板計數法對培養物進行計數，再用 新鮮的肉湯液體培養基（MHB)稀釋到106cfu/mL。
[0075] 利用倍比稀釋法配制抗菌肽B2-N26-V5K，取8個離心管，標記為1-8,每管中加入 100iiLMH液體培養基，然后取100iiL200iiM的抗菌肽B2-N26-V5K加入第1管中，混勻后 取100yL加入到第2管中，按照相同方法依次進行倍比稀釋，最后從第8管中吸出100yL 液體棄去。
[0076] 向8管含有100iiL抗菌肽B2-N26-V5K中加入已稀釋好的菌液100iiL，同時設置 對照組100yL菌液+100i!LMH液體培養基以及100i!L菌液+100i!L1 %TritonX-100,混 勻后放置30°C或37°C220rpm震蕩培養18-20h，于595nm波長處測定吸光值。最小抑菌濃 度為看不見細菌生長的最低濃度。結果如表1所示：
[0077] 表 1B2-N26-V5K抗菌活性
[0078]
【權利要求】
1. 一種中國林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造體B2-N26-V5K，其特征在于：它含有26個 氨基酸殘基，分子量2613. 21Da，理論等電點10. 60,序列為GLLSKFKGVLKTAGKNVAKNVAGSLL。
2. -種權利要求1所述的中國林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造體B2-N26-V5K在制備抗 大腸桿菌藥物中的用途。
3. -種權利要求1所述的中國林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造體B2-N26-V5K在制備抗 多重耐藥大腸桿菌H1藥物中的用途。
4. 一種權利要求1所述的中國林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造體B2-N26-V5K在制備抗 肺炎克雷伯氏菌藥物中的用途。
5. -種權利要求1所述的中國林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造體B2-N26-V5K在制備抗 糞嗜冷桿菌藥物中的用途。
6. -種權利要求1所述的中國林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造體B2-N26-V5K在制備抗 鮑氏不動桿菌藥物中的用途。
7. -種權利要求1所述的中國林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造體B2-N26-V5K在制備抗 痢疾志賀氏菌藥物中的用途。
8. -種權利要求1所述的中國林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造體B2-N26-V5K在制備抗 金黃色葡萄球菌藥物中的用途。
9. 一種權利要求1所述的中國林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造體B2-N26-V5K在制備抗 枯草芽孢桿菌藥物中的用途。
10. -種權利要求1所述的中國林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造體B2-N26-V5K在制備 抗藤黃微球菌藥物中的用途。
【文檔編號】C07K14/46GK104387463SQ201410583120
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月27日 優先權日:2014年10月27日
【發明者】孫燕, 王曉艷, 李治 申請人:陜西師范大學