一種蛋白溶液細菌內毒素去除方法
【專利摘要】本發明公開了一種蛋白溶液細菌內毒素去除方法，它包括以下步驟：S1.氫氧化鋁凝膠制備：將2mol/L氫氧化鈉加入到4.5%氯化鋁溶液，pH為7.0～7.5，在2℃～8℃條件下反應1～2小時，用4000rpm離心收集凝膠；S2.去除蛋白溶液中細菌內毒素：將步驟S1制得的氫氧化鋁凝膠加入到蛋白溶液中，在4℃下，100rpm攪拌1.5～2.5小時，用4000rpm離心收集得去除內毒素后的上清液。本發明利用氫氧化鋁凝膠對蛋白質的吸附主要為靜電吸附，在磷酸根和高濃度的NaCl（PB緩沖液中均含有）存在時可以減少或防止氫氧化鋁對蛋白的吸附，緩沖液下可以去除99%的細菌內毒素。
【專利說明】一種蛋白溶液細菌內毒素去除方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種蛋白溶液細菌內毒素去除方法。
【背景技術】
[0002] 細菌內毒素（Endotoxin)是革蘭氏陰性菌細胞壁上的特有結構，內毒素為外源性 致熱原，細菌內毒素的主要化學成分為脂多糖（LPS)，其毒性成分主要為類脂質A，內毒素 耐熱而穩定，180°C 2小時才能破壞其活性。各種細菌的內毒素的毒性作用較弱，大致相同， 可引起發熱、內毒素休克及播散性血管內凝血等。通常LPS以完整的形式存在于細菌細胞 外膜上，當其從菌體上游離下來，其活性是細胞壁上內毒素的50?100倍，具有廣泛的生物 活性，能引起嚴重的炎癥級聯反應。
[0003] 在疫苗生產過程中，特別是采用革蘭氏陰性細菌進行發酵的疫苗制品，在發酵后 期菌體衰亡，有大量細菌內毒素釋放。即使經過純化工藝處理，細菌內毒素有所降低，但細 菌內毒素含量仍然非常高，這也是造成疫苗發熱反應的主要原因。臨床使用的大多數抗生 素在治療細菌感染（主要是革蘭氏陰性細菌感染）時由于殺菌/抑菌的原因而導致大量細 菌內毒素釋放，使得病情惡化。
[0004] 目前對溶液中細菌內毒素的去除方法包括：（1)超濾技術通過目標物質和細菌內 毒素分子大小的差異進行分離，一般要求目標物和細菌內毒素的分子大小的差異有3倍 左右才有效果，適用于小分子物質；（2)酸堿化學處理適用于物品處理，通常不適合蛋白溶 液；（3)層析（即離子交換、疏水）設備昂貴、材料耗損大，操作復雜，并且需要定做專門的 層析介質；(4)正電荷過濾器過濾通常用于小分子物質和水處理，不適合蛋白類物質。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于克服現有技術的缺點，提供一種蛋白溶液細菌內毒素去除 方法，該方法為氫氧化鋁凝膠表面鋁與內毒素中磷酸基團共價結合，在磷酸根和高濃度 NaCl (PB緩沖液中均含有）存在時，可減少或防止氫氧化鋁對蛋白的吸附，緩沖液下可以去 除99%的細菌內毒素，目標蛋白收率達到99%以上，提1? 了藥品或疫苗的安全性。
[0006] 本發明的目的通過以下技術方案來實現：一種蛋白溶液細菌內毒素去除方法，其 特征在于，它包括以下步驟：
[0007] SL氫氧化鋁凝膠制備：將2mol/L氫氧化鈉加入到4. 5 %氯化鋁溶液，pH為7. 0? 7. 5,在2°C?8°C條件下反應1?2小時，用4000rpm離心收集凝膠；
[0008] S2.去除中蛋白溶液細菌內毒素：將步驟Sl制得的氫氧化鋁凝膠加入到蛋白溶液 中，在4°C，IOOrpm攪拌1. 5?2. 5小時，用4000rpm離心收集得去除內毒素后的上清液。
[0009] 進一步地，步驟Sl中所述的氫氧化鋁凝膠濃度為0. 1?0.5%，優選0.2%? 0. 4% ;步驟S2中所述蛋白溶液含百日咳毒素 PT或百日咳絲狀血凝素 FHA，且PT、FHA溶液 均含有10?lOOmmol/L PB，0. 1?l.Omol/L NaCl ;步驟2中蛋白溶液的PH為7.0?9.0。 [0010] 本發明具有以下優點：本發明中氫氧化鋁凝膠作為反應物，采用氫氧化鈉加入 氯化鋁溶液制備，氫氧化鋁凝膠表面鋁與內毒素中磷酸基團共價結合，在磷酸根和高濃度 NaCl (PB緩沖液中均含有）存在時，減少或防止氫氧化鋁對蛋白的吸附，提高了藥品或疫苗 的安全性；本發明提供的利用氫氧化鋁凝膠去除細菌內毒素的方法操作簡單實用。
【具體實施方式】
[0011] 下面結合實施例對本發明做進一步的描述，本發明的保護范圍不局限于以下所 述。
[0012] 實施例I :PT溶液中細菌內毒素去除方法，它包括以下步驟：
[0013] SI.氫氧化鋁凝膠制備：將2mol/L氫氧化鈉加入到4. 5%氯化鋁溶液，在PH為 7. 0,溫度為2°C的條件下反應2小時，用4000rpm離心收集凝膠；
[0014] S2.去除PT溶液中細菌內毒素：將步驟Sl制得的氫氧化鋁凝膠的0. 3%加入到PH 為7. 0的PT溶液中，在溫度為4°C的條件下，IOOrpm攪拌2. 5小時，用4000rpm離心收集得 去除內毒素后的上清液。
[0015] 實施例2 :PT溶液中細菌內毒素去除方法，它包括以下步驟：
[0016] SI.氫氧化鋁凝膠制備：將2mol/L氫氧化鈉加入到4. 5%氯化鋁溶液，在PH為 7. 3,溫度為5°C的條件下反應1. 5小時，用4000rpm離心收集凝膠；
[0017] S2.去除PT溶液中細菌內毒素：將步驟Sl制得的氫氧化鋁凝膠的0. 3%加入到PH 為8. 0的PT溶液中，在溫度為4°C的條件下，IOOrpm攪拌2小時，用4000rpm離心收集得去 除內毒素后的上清液。
[0018] 實施例3 :PT溶液中細菌內毒素去除方法，它包括以下步驟：
[0019] SI.氫氧化鋁凝膠制備：將2mol/L氫氧化鈉加入到4. 5%氯化鋁溶液，在PH為 7. 5,溫度為8°C的條件下反應1小時，用4000rpm離心收集凝膠；
[0020] S2.去除PT溶液中細菌內毒素：將步驟Sl制得的氫氧化鋁凝膠的0. 3%加入到PH 為9. 0的PT溶液中，在溫度為4°C的條件下，IOOrpm攪拌1. 5小時，用4000rpm離心收集得 去除內毒素后的上清液。
[0021] 實施例4 :FHA溶液中細菌內毒素去除方法，它包括以下步驟：
[0022] SI.氫氧化鋁凝膠制備：將2mol/L氫氧化鈉加入到4. 5%氯化鋁溶液，在PH為 7. 0,溫度為2°C的條件下反應2小時，用4000rpm離心收集凝膠；
[0023] S2.去除FHA溶液中細菌內毒素：將步驟Sl制得的氫氧化鋁凝膠的0. 3%加入到 PH為7的FHA溶液中，在溫度為4°C的條件下，IOOrpm攪拌2. 5小時，用4000rpm離心收集 得去除內毒素后的上清液。
[0024] 實施例5 :FHA溶液中細菌內毒素去除方法，它包括以下步驟：
[0025] SI.氫氧化鋁凝膠制備：將2mol/L氫氧化鈉加入到4. 5%氯化鋁溶液，在PH為 7. 3,溫度為5°C的條件下反應1. 5小時，用4000rpm離心收集凝膠；
[0026] S2.去除FHA溶液中細菌內毒素：將步驟Sl制得的氫氧化鋁凝膠的0. 3%加入到 PH為8. 0的FHA溶液中，在溫度為4°C的條件下，IOOrpm攪拌2小時，用4000rpm離心收集 得去除內毒素后的上清液。
[0027] 實施例6 :FHA溶液中細菌內毒素去除方法，它包括以下步驟：
[0028] SI.氫氧化鋁凝膠制備：將2mol/L氫氧化鈉加入到4. 5%氯化鋁溶液，在PH為 7. 5,溫度為8°C的條件下反應1小時，用4000rpm離心收集凝膠；
[0029] S2.去除FHA溶液中細菌內毒素：將步驟Sl制得的氫氧化鋁凝膠的0. 3%加入到 PH為9. 0的FHA溶液中，在溫度為4°C的條件下，IOOrpm攪拌1. 5小時，用4000rpm離心收 集得去除內毒素后的上清液。
[0030] 實施例7 :PT溶液中細菌內毒素去除方法，它包括以下步驟：
[0031] SI.氫氧化鋁凝膠制備：將2mol/L氫氧化鈉加入到4. 5%氯化鋁溶液，在PH為 7. 0,溫度為6°C的條件下反應2小時，用4000rpm離心收集凝膠；
[0032] S2.去除PT溶液中細菌內毒素：將步驟Sl制得的氫氧化鋁凝膠的0. 1%加入到PH 為9. 0的PT溶液中，在溫度為4°C的條件下，IOOrpm攪拌2. 5小時，用4000rpm離心收集得 去除內毒素后的上清液。
[0033] 實施例8 :PT溶液中細菌內毒素去除方法，它包括以下步驟：
[0034] SI.氫氧化鋁凝膠制備：將2mol/L氫氧化鈉加入到4. 5%氯化鋁溶液，在PH為 7. 0,溫度為6°C的條件下反應2小時，用4000rpm離心收集凝膠；
[0035] S2.去除PT溶液中細菌內毒素：將步驟Sl制得的氫氧化鋁凝膠的0. 3%加入到PH 為8. 0的PT溶液中，在溫度為4°C的條件下，IOOrpm攪拌2小時，用4000rpm離心收集得去 除內毒素后的上清液。
[0036] 實施例9 :PT溶液中細菌內毒素去除方法，它包括以下步驟：
[0037] SI.氫氧化鋁凝膠制備：將2mol/L氫氧化鈉加入到4. 5%氯化鋁溶液，在PH為 7. 0,溫度為6°C的條件下反應2小時，用4000rpm離心收集凝膠；
[0038] S2.去除PT溶液中細菌內毒素：將步驟Sl制得的氫氧化鋁凝膠的0. 5%加入到PH 為7. 0的PT溶液中，在溫度為4°C的條件下，IOOrpm攪拌1. 5小時，用4000rpm離心收集得 去除內毒素后的上清液。
[0039] 實施例10 :FHA溶液中細菌內毒素去除方法，它包括以下步驟：
[0040] SI.氫氧化鋁凝膠制備：將2mol/L氫氧化鈉加入到4. 5%氯化鋁溶液，在PH為 7. 0,溫度為6°C的條件下反應2小時，用4000rpm離心收集凝膠；
[0041] S2.去除FHA溶液中細菌內毒素：將步驟Sl制得的氫氧化鋁凝膠的0. 1 %加入到 PH為9. 0的FHA溶液中，在溫度為4°C的條件下，IOOrpm攪拌2. 5小時，用4000rpm離心收 集得去除內毒素后的上清液。
[0042] 實施例11 :FHA溶液中細菌內毒素去除方法，它包括以下步驟：
[0043] SI.氫氧化鋁凝膠制備：將2mol/L氫氧化鈉加入到4. 5%氯化鋁溶液，在PH為 7. 0,溫度為6°C的條件下反應2小時，用4000rpm離心收集凝膠；
[0044] S2.去除FHA溶液中細菌內毒素：將步驟Sl制得的氫氧化鋁凝膠的0. 3%加入到 PH為8. 0的FHA溶液中，在溫度為4°C的條件下，IOOrpm攪拌2小時，用4000rpm離心收集 得去除內毒素后的上清液。
[0045] 實施例12 :FHA溶液中細菌內毒素去除方法，它包括以下步驟：
[0046] SI.氫氧化鋁凝膠制備：將2mol/L氫氧化鈉加入到4. 5%氯化鋁溶液，在PH為 7. 0,溫度為6°C的條件下反應2小時，用4000rpm離心收集凝膠；
[0047] S2.去除FHA溶液中細菌內毒素：將步驟Sl制得的氫氧化鋁凝膠的0. 5%加入到 PH為7. 0的FHA溶液中，在溫度為4°C的條件下，IOOrpm攪拌1. 5小時，用4000rpm離心收 集得去除內毒素后的上清液。
[0048] 以下通過實驗說明本發明的有益效果：
[0049] PH變化時，PT溶液中細菌內毒素去除結果：如表1所示。
[0050] 表I :PT溶液中細菌內毒素去除結果
【權利要求】
1. 一種蛋白溶液細菌內毒素去除方法，其特征在于，它包括以下步驟：
51. 氫氧化鋁凝膠制備：將2mol/L氫氧化鈉加入到4. 5%氯化鋁溶液，pH為7. O?7. 5， 在2°C?8°C條件下反應1?2小時，用4000rpm離心收集得到氫氧化鋁凝膠；
52. 去除蛋白溶液中細菌內毒素：將步驟SI制得的氫氧化鋁凝膠加入到蛋白溶液中， 在4°C下，IOOrpm攪拌1. 5?2. 5小時，用4000rpm離心收集得去除內毒素后的上清液。
2. 根據權利要求1所述的一種蛋白溶液細菌內毒素去除方法，其特征在于，所述氫氧 化鋁凝膠濃度為0. 1%?0. 5%，較好平衡點為0. 2%?0. 4%。
3. 根據權利要求1所述的一種蛋白溶液細菌內毒素去除方法，其特征在于，所述蛋白 溶液含百日咳毒素PT或百日咳絲狀血凝素FHA。
4. 根據權利要求3所述的一種蛋白溶液細菌內毒素去除方法，其特征在于，所述PT溶 液含 10 ?lOOmmol/L PB，0. 1 ?I. Omol/L NaCl。
5. 根據權利要求3所述的一種蛋白溶液細菌內毒素去除方法，其特征在于，所述FHA溶 液含 10 ?lOOmmol/L PB，0. 1 ?I. 0mol/L NaCl。
6. 根據權利要求3所述的一種蛋白溶液細菌內毒素去除方法，其特征在于，所述蛋白 溶液的PH為7.0?9.0。
【文檔編號】C07K14/235GK104311628SQ201410557250
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月17日 優先權日:2014年10月17日
【發明者】陳道遠, 陳元芬, 李靖, 蘇淑 申請人:成都歐林生物科技股份有限公司