一種沃尼妙林卵黃抗體的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種沃尼妙林卵黃抗體的制備方法。本發明公開一種制備沃尼妙林卵黃抗體的方法，包括如下步驟：通過碳二亞胺將鹽酸沃尼妙林與載體蛋白進行偶聯，得到免疫原；用免疫原免疫蛋雞，得到免疫蛋雞的雞卵；提取雞卵卵黃中的沃尼妙林卵黃抗體。利用本發明公開的方法制備沃尼妙林抗體具有制備過程簡單、經濟，產量高等獨特優點，在獸藥殘留檢測中具有良好的應用前景。
【專利說明】一種沃尼妙林卵黃抗體的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種沃尼妙林抗體的制備方法；特別涉及一種沃尼妙林卵黃抗體的制 備方法，屬于抗體制備領域。
【背景技術】
[0002] 沃尼妙林（Valnemulin，VAL)為新一代截短側耳類（Pleuromutilin)半合成抗生 素，具有安全性較高、抗菌譜廣、抗菌活性強、耐藥性低等特點而受到廣泛關注，目前該藥主 要用于畜禽支原體及腸道螺旋體感染的預防與治療。但是由于應用比較廣泛，其在動物組 織內的殘留現象較為嚴重，可能會引起一些不良反應，此外，沃尼妙林還可以與聚醚類藥物 作用導致動物中毒。因此，歐洲醫藥評價局（EMEA)規定，沃尼妙林在豬組織中的最大殘留 限量（MRL):肌肉，50 iig/kg;肝臟，500 iig/kg;腎臟，IOOii g/kg。
[0003] 卵黃抗體（Egg yolk antibody)是從免疫禽蛋卵黃中提取的特異性抗體，為禽類 所特有，其化學性質穩定，生產制備過程簡單、經濟，產量高，適合大規模生產。制備卵黃抗 體時無需對動物進行采血，便于采集，不會對動物造成損傷，符合現代動物保護要求。但是 目前卵黃抗體在獸藥殘留檢測領域應用較少，并且未見沃尼妙林卵黃抗體制備的報道。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種沃尼妙林卵黃抗體的制備方法。
[0005] 本發明提供一種制備沃尼妙林卵黃抗體的方法，包括如下步驟：通過碳二亞胺將 鹽酸沃尼妙林與載體蛋白進行偶聯，得到免疫原；用免疫原免疫蛋雞，得到免疫蛋雞的雞 卵；提取雞卵卵黃中的沃尼妙林卵黃抗體。
[0006] 上述方法中，所述載體蛋白為牛血清白蛋白。
[0007] 上述任一所述的方法中，所述用免疫原免疫蛋雞的方法如下：將所述免疫原用等 體積的弗氏完全佐劑乳化后首次免疫蛋雞，再將首次免疫中所用的免疫原劑量減半，并用 等體積的弗氏不完全佐劑乳化后對首次免疫的蛋雞進行加強免疫。
[0008] 上述任一所述的方法中，所述免疫的方式為背部多點免疫。
[0009] 上述任一所述的方法中，所述免疫原用PBS溶液溶解；
[0010] 所述PBS溶液的濃度具體為0? 01mol/L。
[0011] 上述任一所述的方法中，所述首次免疫的所述免疫原的劑量為300-400ug ;
[0012] 所述加強免疫的次數為7-8次，具體為7次；
[0013] 所述加強免疫具體為在首次免疫后第15天、29天、43天、55天、79天、91天以及 121天各進行一次加強免疫。
[0014] 上述任一所述的方法中，所述提取雞卵卵黃中的沃尼妙林卵黃抗體的方法為飽和 硫酸銨沉淀法，步驟如下：
[0015] 1)將免疫蛋雞的雞卵中的卵黃與純水混勻，調節pH至5. 0-5. 2,放置，得溶液1 ;
[0016] 2)將溶液1離心，收集上清，加入pH7. 2-7. 4的飽和（NH4) 2S04水溶液，使飽和 (NH4) 2S04水溶液的體積占總體積的30-40%，放置，得溶液2 ;
[0017] 3)將溶液2離心，取沉淀即得。
[0018] 上述任一所述的方法中，所述卵黃和所述純水的體積比為1:5-6,具體為1:6 ;
[0019] 所述放置的條件為4°C -KTC放置12-20h，具體為4°C放置12-20h ;
[0020] 所述飽和（NH4) 2S04水溶液占總體積的體積百分含量為40% ;
[0021] 所述調節pH至5. 0-5. 2所用的試劑為鹽酸。
[0022] 由上述任一所述的方法制備得到的沃尼妙林抗體也屬于本發明的保護范圍。
[0023] 上述沃尼妙林抗體在制備具有結合沃尼妙林的活性的產品中的應用也屬于本發 明的保護范圍；
[0024] 或，
[0025] 上述沃尼妙林抗體在制備檢測沃尼妙林的產品中的應用也屬于本發明的保護范 圍。
[0026] 本發明的有益效果在于，利用本發明提供的方法制備的沃尼妙林抗體產量高，在 整個試驗周期（43周）內收集卵黃抗體的量大約為20g。在免疫后前10周，抗體效價上升 速度較快，然后慢慢趨向穩定，抗體效價可在一個較高的水平維持15周以上，并且抗體的 最高效價達1 :218。抗體靈敏度較高，隨著免疫的進行，各抗體靈敏度不斷提高，所制標準 曲線的IC5tl逐漸下降，并且最低可降至21. 77ng/mL。抗體特異性良好，除與泰妙菌素存在 383. 9%的交叉反應率外，與其它結構相似的抗生素類藥物均不存在顯著的交叉反應。
[0027] 利用本發明提供的方法制備沃尼妙林抗體具有制備過程簡單、經濟，產量高等獨 特優點，在獸藥殘留檢測中具有良好的應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0028] 圖1為沃尼妙林免疫原結構圖。
[0029] 圖2為沃尼妙林卵黃抗體效價變化趨勢圖。
[0030] 圖3為沃尼妙林卵黃抗體靈敏度變化趨勢圖。
【具體實施方式】
[0031] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0032] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0033] 鹽酸沃尼妙林標準品購自歐洲藥典委員會BP907-F67029，產品目錄號為 Y0000584。
[0034] 泰妙菌素標準品購自歐洲藥典委員會BP907-F67029。
[0035] 紅霉素和阿維菌素標準品均購自梯希愛（上海）化成工業發展有限公司。
[0036] 替米考星和泰樂菌素標準品均購自中國獸藥監察所。
[0037] 弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑均購自Sigma公司，產品目錄號分別為F-5881和 F-5506。
[0038] 蛋雞購自北京市西苑農貿市場
[0039] Proclin 300生物防腐劑購自sigma公司
[0040] 〇? 05M的碳酸鹽緩沖液（pH9. 6)的組成成分及含量為：
【權利要求】
1. 一種制備沃尼妙林卵黃抗體的方法，包括如下步驟：通過碳二亞胺將鹽酸沃尼妙林 與載體蛋白進行偶聯，得到免疫原；用免疫原免疫蛋雞，得到免疫蛋雞的雞卵；提取雞卵卵 黃中的沃尼妙林卵黃抗體。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述載體蛋白為牛血清白蛋白。
3. 根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述用免疫原免疫蛋雞的方法如下： 將所述免疫原用等體積的弗氏完全佐劑乳化后首次免疫蛋雞，再將首次免疫中所用的免疫 原劑量減半，并用等體積的弗氏不完全佐劑乳化后對首次免疫的蛋雞進行加強免疫。
4. 根據權利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述免疫的方式為背部多點免疫。
5. 根據權利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述免疫原用PBS溶液溶解； 所述PBS溶液的濃度具體為0. Olmol/L。
6. 根據權利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述首次免疫的所述免疫原的劑 量為 300-400ug ; 所述加強免疫的次數為7-8次，具體為7次。
7. 根據權利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述提取雞卵卵黃中的沃尼妙林 卵黃抗體的方法為飽和硫酸銨沉淀法，步驟如下： 1) 將免疫蛋雞的雞卵中的卵黃與純水混勻，調節pH至5. 0-5. 2,放置，得溶液1 ; 2) 將溶液1離心，收集上清，加入pH 7. 2-7. 4的飽和（NH4) 2S04水溶液，使飽和 (NH4) 2S04水溶液的體積占總體積的30-40%，放置，得溶液2 ; 3) 將溶液2離心，取沉淀即得。
8. 根據權利要求1-7任一所述的方法，其特征在于：所述卵黃和所述純水的體積比為 1:5-6,具體為 1:6 ; 所述放置的條件為4°C -10°C放置12-20h，具體為4°C放置12-20h ; 所述飽和（NH4) 2S04水溶液占總體積的體積百分含量為40%。
9. 由權利要求1-8任一所述的方法制備得到的沃尼妙林抗體。
10. 權利要求9所述的沃尼妙林抗體在制備具有結合沃尼妙林的活性的產品中的應 用； 或， 權利要求9所述的沃尼妙林抗體在制備檢測沃尼妙林的產品中的應用。
【文檔編號】C07K1/30GK104277107SQ201410535384
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年10月11日 優先權日:2014年10月11日
【發明者】王戰輝, 沈建忠, 史為民, 張素霞, 江海洋, 溫凱, 張會艷, 盛雅潔 申請人:中國農業大學