離子交換樹脂法從青蒿素生產廢料中分離精制二氫青蒿酸的制作方法
【專利摘要】一種離子交換樹脂法從青蒿素生產廢料中分離精制二氫青蒿酸，該方法是以干燥的青蒿素生產廢料為原料，先用氫氧化鈉溶液溶解，離心去沉淀，取上清液，慢慢加入經過預處理與平衡處理的陰離子交換樹脂，用去離子水沖洗后，進行解吸附，收集洗脫液，真空濃縮，然后用有機溶劑萃取，最后通過結晶，而獲得高純的二氫青蒿酸產品。本發明首次以青蒿素生產廢料為原料，采用離子交換樹脂法分離純化二氫青蒿酸；通過聯合真空濃縮與有機溶劑萃取技術，降低濃縮時間與能耗，又不需離心或過濾，增加了產品得率并降低了生產成本，產品純度高，達99%以上；回收率高，達80%以上；操作方便，生產量大，容易實現產業規模化生產。
【專利說明】離子交換樹脂法從青蒿素生產廢料中分離精制二氫青蒿酸
【技術領域】
[0001]本發明涉及二氫青蒿酸的制法，具體涉及一種采用離子交換樹脂法從青蒿酸生產廢料中分離精制二氫青蒿酸的方法。
【背景技術】
[0002]黃花蒿是我國國寶級的重要經濟作物，其主要活性成分青蒿素是我國開發的第一個被國際公認并有的自主知識產權的天然藥物，也是我國唯一被WHO認可的按西藥研究標準開發的中藥。我國科學家屠呦呦因在發現青蒿素作出的突出貢獻于2011年獲得了我國首個拉克斯獎。自世界衛生組織將青蒿素認定為目前最安全、有效的抗瘧藥物，并作為治療瘧疾首先用藥后，青蒿素的市場需求急劇增長。目前以青蒿素為原料的藥物在31個國家銷售，市場非常龐大。據WHO推測，僅非洲每年就超過2.5億人次需要這類藥物，青蒿素需求量為700噸以上，每年的市場達20億美元。而市場上的青蒿素90%以上來自我國南方及西南地區的黃花蒿作物，可見黃花蒿產業在我國農業經濟中占有重要地位。此外，現代藥理研究證明，青蒿素、青蒿酸和二氫青蒿素對多種人類和動物腫瘤細胞均具有強效抑制作用，而對正常細胞損傷很小，正被開發成高效、低毒、價廉、譜廣的抗癌新藥，目前已經入了二期臨床試驗，黃花蒿的種植需求將進一步膨脹。
[0003]然而，由于我國青蒿素生產工藝落后、生產安全隱患較大、生產成本高以及資源利用率低導致產品價格過高，消費者無力購買，產品滯銷，國寶級的黃花蒿產業無法得到應有發展。因此，雖然青蒿素需求量達700噸以上，但近幾年我國每年青蒿素銷售量僅150噸左右，約8成的市場尚未開拓，造成了我國青蒿素產品積壓而發展中國家尤其是非洲南部國家陷入青蒿素類藥物嚴重短缺的尷尬局面。由此可見，黃花蒿產業尚有非常廣闊的發展空間，但需降低加工成本、提高資源利用率。
[0004]降低青蒿素生產成本以滿足發展中國家對青蒿素產品的需求，已受到國內外廣泛關注。由于青蒿素分子結構復雜，手性C原子多，未來10-20年時間內，尚未能采用化學合成的方法獲得青蒿素。美國加州大學伯克利分校Keasling教授及其團隊在利用基因工程菌生產青蒿酸的研究取得了突破，該團隊首次將黃花蒿中amorpha-4, 11-diene synthase(ADS)和cytochrome P450 monooxygenase (CYP71AV1)基因轉入酵母菌中表達，在工程酵母菌的發酵產物中獲得了青蒿素前體物質青蒿酸，該成果在《Nature》雜志上發表，在后續研究中該團隊對發酵條件進行了不斷地優化，以提高青蒿酸的含量。雖然目前采用基因工程尚未能獲得青蒿素，但獲得青蒿酸后，通過化學方法可獲得二氫青蒿酸。而二氫青蒿酸被認為可以自發轉化為青蒿素，該過程不需要酶的參與。德國的Seeberger教授等人最近的研究表明，采用流動化學的方法可在一臺特殊的儀器設備中完成二氫青蒿酸向青蒿素的轉變。
[0005]研究表明，利用黃花蒿生產青蒿素較利用工程菌與半合成法生產青蒿素有以下明顯優勢:首先，工程菌的生長需要外界大量的C源，而黃花蒿可利用無窮無盡的太陽能，其生長基本不需要農藥化肥，故生長成本遠低于工程菌；其次，目前工程菌無法實現二氫青蒿酸與青蒿素的生產；此外，黃花蒿中本身含有較青蒿素更多量的青蒿酸和二氫青蒿酸，尤其是二氫青蒿酸的含量較高。有研究表明，有些品種中二氫青蒿酸的含量為青蒿素的6倍左右。這些優勢說明，黃花蒿資源尚有巨大潛力可挖。在青蒿素的生產過程中，二氫青蒿酸也被同時從植物體中提取出來，但在青蒿素的進一步分離純化過程中，二氫青蒿酸被留在生產廢料中，并沒有再加以利用，造成了資源的大量浪費。
[0006]因此，充分利用青蒿素生產廢料，已顯得非常重要，有望有效解決青蒿素生產廢液的污染問題，變廢為寶，為體外轉化青蒿素提供物質基礎，對降低青蒿素生產成本、提高黃花蒿資源利用率、促進我國重要中藥資源和中藥可持續性發展、提高農民收入有重要意義。
【發明內容】
[0007]本發明所要解決的技術問題是:針對上述現有技術的不足，提供一種離子交換樹脂法從青蒿素生產廢料中分離精制二氫青蒿酸，該法是取干燥的青蒿素生產廢料，先用堿性溶液溶解，離心去沉淀，慢慢加入經過預處理與平衡處理的離子交換樹脂，用去離子水沖洗后，進行解吸附，收集流出液，真空濃縮，然后用有機溶劑萃取，最后通過結晶獲得高純的二氫青蒿酸產品。
[0008]為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案是:一種離子交換樹脂法從青蒿素生產廢料中分離精制二氫青蒿酸，該方法步驟如下，請結合參見圖1:
(O樣品處理:按每升未處理的陰離子交換樹脂使用1.0-1.45公斤干燥的青蒿素生產廢料的比例，取干燥的青蒿素生產廢料(生產廢料中含水率〈3%、有機溶劑〈1%。均是指體積質量比)，再按Ig干燥的青蒿素生產廢料加3-4.5ml質量體積濃度為0.3%的氫氧化鈉溶液的比例，于干燥的青蒿素生產廢料中加入氫氧化鈉溶液，將青蒿素生產廢料攪碎，調節pH值至8.0-9.0, 50-60°C下浸泡20_30min，室溫下離心，收集上清液；其中，離心轉速為2500-3000rpm/min，時間為 15min ；
(2)上柱、沖洗、解吸:取上述上清液，打開層析柱下端活塞，以1-1.5BV/h的速度通過裝有717、D201、201 X 4或D209陰離子交換樹脂的層析柱進行上柱，上柱完畢后，關閉層析柱下端活塞，靜態吸附至飽和；打開層析柱下端活塞，采用5-6BV的去離子水沖洗，沖洗速度為4-6BV/h ;再取6-10%質量體積濃度的氯化銨溶液和60-85%體積濃度的食用酒精按1:1的體積比混合的混合液，加入層析柱，以2-3BV/h的速度進行洗脫，收集洗脫液；
(3)濃縮、萃取:35-40°C下，真空濃縮上述洗脫液，濃縮至1/3體積，然后于濃縮液中按I:1的體積比，加入有機溶劑萃取兩次，合并萃取液，真空濃縮至有機溶劑全部揮干，得二氫青蒿酸粗產品；上述有機溶劑為乙酸乙酯、氯仿或二氯甲烷，乙酸乙酯、氯仿和二氯甲烷均為分析純。
[0009](4)結晶:按Ig 二氫青蒿酸粗產品加3_5ml有機溶劑的比例，于上述二氫青蒿酸粗產品中加入有機溶劑，回流加熱至60-70°C，攪拌至完全溶解，過濾，室溫放置，直至晶體完全析出，重結晶一次，獲得二氫青蒿酸產品；上述有機溶劑為乙酸乙酯、丁酮或石油醚，乙酸乙酯、丁酮和石油醚均為分析純。
[0010]本發明方法中，于樣品上柱前，需對717、D201、201X4或D209陰離子交換樹脂進行常規預處理和平衡處理:取陰離子交換樹脂，用3倍體積的去離子水浸泡16-20h，去掉去離子水，用1.5倍體積的lmol/L鹽酸溶液浸泡8-12h，去掉HCl溶液，用去離子水洗至pH值為7.0,再用1.5倍體積的4%氫氧化鈉溶液(W/V)溶液浸泡8h，去掉NaOH溶液，用去離子水洗至PH值為7.0。樹脂處理完畢，用2倍體積去離子水懸浮樹脂，采用濕法裝柱，待樹脂完全沉降后，打開層析柱下端活塞，去掉多余的水，待水層達到樹脂表層時，加入等體積的0.3%氫氧化鈉溶液(W/V)，待氫氧化鈉溶液全部滲入樹脂后，關閉層析柱下端活塞平，等待樣品上柱。
[0011]本發明的有益效果是:本發明首次以青蒿素生產廢料為原料，采用離子交換樹脂法分離純化二氫青蒿酸；本方法通過聯合真空濃縮與有機溶劑萃取技術，降低濃縮時間與能耗，又不需離心或過濾，增加了產品得率并降低了生產成本，產品純度高，純度達99%以上；回收率高，達80%以上；操作方便，生產量大，容易實現產業規模化生產。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1是本發明的制備流程圖。
[0013]圖2是本發明制得的二氫青蒿酸產品含量分析氣相色譜圖。
【具體實施方式】
[0014]下面本發明將以實施例進行進一步地說明，但是本發明并不限于這些實施例的任一個或類似實例。
[0015]離子交換樹脂按前述過程進行處理。
[0016]實施例1
取完全干燥的青蒿素生產廢料100g，加入450mL 0.3%(ff/V)的氫氧化鈉溶液，將青蒿素生產廢料攪碎，調節pH值至8.0, 50°C浸泡30min,室溫下2500rpm離心15min,取上清液。打開層析柱下端活塞，以1.5BV/h的速度上柱(717陰離子交換樹脂的最初處理量為10mL),上柱完畢后，關閉層析柱下端活塞，靜態吸附至飽和。吸附完畢，打開層析柱下端活塞，采用500mL去離子水沖洗，沖洗速度為6BV/h。取10%(W/V)氯化銨溶液和60%(V/V)食用酒精按1:1體積比混合的混合液，加入層析柱，以3BV/h的速度進行洗脫，收集洗脫液共350mL。40°C下，真空濃縮洗脫液，濃縮至1/3體積，然后用與濃縮液相同體積的乙酸乙酯萃取兩次，合并萃取液，真空濃縮至有機溶劑全部揮干，得1.97g 二氫青蒿酸粗產品。取上述二氫青蒿酸粗產品，加入9.85ml分析純丁酮，回流加熱至70°C，攪拌至完全溶解，過濾，室溫放置至晶體完全析出，重結晶一次，獲得二氫青蒿酸產品1.55g。
[0017]產品檢測采用氣相檢測法，具體方法如下:稱取1mg產品，溶解于50mL乙腈中，
0.2 μ m的有機過濾膜過濾，進氣相色譜儀檢測。色譜條件:FID檢測器，HP-5.0彈性石英毛細管柱(30 mX0.32 mmX0.25 μ m)，高純氮氣(99.999%)為載氣，流速3mL/min，高純氮氣40 mL/min尾吹，進樣口溫度235 °C，檢測器溫度285 °C，分流比1: 1，進樣量I μ L，外標法定量。柱升溫程序:初始溫度180°C，以6°C /min升至220°C后，保持3min，以30°C /min升至 280°C，保持 1min。
[0018]檢測結果如圖2所示，二氫青蒿酸含量為99.13%。
[0019]實施例2
取完全干燥的青蒿素生產廢料725g，加入2200mL 0.3%(ff/V)的氫氧化鈉溶液，將青蒿素生產廢料攪碎，調節pH值至9.0,60°C浸泡20min,室溫下3000rpm離心15min,取上清液。打開層析柱下端活塞，以lBV/h的速度上柱(717陰離子交換樹脂的最初處理量為500mL)，上柱完畢后，關閉層析柱下端活塞，靜態吸附于飽和。吸附完畢，打開層析柱下端活塞，采用3000mL的去離子水沖洗，沖洗速度為4BV/h。取6%(W/V)氯化銨溶液和85%(V/V)食用酒精按1:1體積比混合的混合液，加入層析柱，以2BV/h的速度進行洗脫，收集洗脫液共1500mL。35°C下，真空濃縮洗脫液，濃縮至1/3體積，然后用500mL 二氯甲烷萃取兩次，合并萃取液，真空濃縮至有機溶劑全部揮干，得二氫青蒿酸粗產品13.94g，于該粗產品中加入41.82ml分析純乙酸乙酯，回流加熱至60°C，攪拌至完全溶解，過濾，室溫放置，直至晶體完全析出，重結晶一次，獲得二氫青蒿酸產品12.18g，經氣相色譜檢測(方法與實施例1相同)，二氫青蒿酸含量為99.21%。
[0020]實施例3
取完全干燥的青蒿素生產廢料1.2kg，加入4.8L 0.3%(ff/V)的氫氧化鈉溶液，將青蒿素生產廢料攪碎，調節pH值至8.5，55°C浸泡26min，室溫下2800rpm離心15min，取上清液。打開層析柱下端活塞，以1.2BV/h的速度上柱(717陰離子交換樹脂的最初處理量為100mL),上柱完畢后，關閉層析柱下端活塞，靜態吸附至飽和。吸附完畢，打開層析柱下端活塞，采用5.5L去離子水沖洗，沖洗速度為5BV/h。取8%(W/V)氯化銨溶液和70%(V/V)食用酒精按1:1體積比混合的混合液，加入層析柱，以2.5BV/h的速度進行洗脫，收集洗脫液共3.3L。38°C下，真空濃縮洗脫液，濃縮至1/3體積，然后用1.1L氯仿萃取兩次，合并萃取液，真空濃縮至有機溶劑全部揮干，得二氫青蒿酸粗產品22.85g，于該二氫青蒿酸粗產品中加入91.40mL分析純石油醚，回流加熱至65°C，攪拌至完全溶解，過濾，室溫放置，直至晶體完全析出，重結晶一次，獲得二氫青蒿酸產品20.89g，經氣相色譜檢測(方法與實施例1相同)，二氫青蒿酸含量為99.17%。
[0021]實施例4
取完全干燥的青蒿素生產廢料1.2kg，加入4.8L 0.3%(ff/V)的氫氧化鈉溶液，將青蒿素生產廢料攪碎，調節pH值至8.5，55°C浸泡26min，室溫下2800rpm離心15min，取上清液。打開層析柱下端活塞，以1.2BV/h的速度上柱(D201陰離子交換樹脂的最初處理量為IlOOmL),上柱完畢后，關閉層析柱下端活塞，靜態吸附至飽和。吸附完畢，打開層析柱下端活塞，采用5.5L去離子水沖洗，沖洗速度為4.5BV/h。取9%(W/V)氯化銨溶液和80%(V/V)食用酒精按1:1體積比混合的混合液，加入層析柱，以2.5BV/h的速度進行洗脫，收集洗脫液共3.3L。38°C下，真空濃縮洗脫液，濃縮至1/3體積，然后用1.1L氯仿萃取兩次，合并萃取液，真空濃縮至有機溶劑全部揮干，得二氫青蒿酸粗產品21.93g，于該二氫青蒿酸粗產品中加入90.0OmL分析純乙酸乙酯，回流加熱至60°C,攪拌至完全溶解,過濾,室溫放置,直至晶體完全析出，重結晶一次，獲得二氫青蒿酸產品19.79g，經氣相色譜檢測(方法與實施例1相同)，二氫青蒿酸含量為99.03%。
[0022]實施例5
取完全干燥的青蒿素生產廢料1.2kg，加入4.8L 0.3%(ff/V)的氫氧化鈉溶液，將青蒿素生產廢料攪碎，調節pH值至8.5，55°C浸泡26min，室溫下2800rpm離心15min，取上清液。打開層析柱下端活塞，以1.2BV/h的速度上柱(201X4陰離子交換樹脂的最初處理量為1200mL)，上柱完畢后，關閉層析柱下端活塞，靜態吸附至飽和。吸附完畢，打開層析柱下端活塞，采用5.5L去離子水沖洗，沖洗速度為5BV/h。取10%(W/V)氯化銨溶液和80%(V/V)食用酒精按1:1體積比混合的混合液，加入層析柱，以2.5BV/h的速度進行洗脫，收集洗脫液共3.0L。40°C下，真空濃縮洗脫液，濃縮至1/3體積，然后用1.0L氯仿萃取兩次，合并萃取液，真空濃縮至有機溶劑全部揮干，得二氫青蒿酸粗產品23.99g，于該二氫青蒿酸粗產品中加入90.0OmL分析純丁酮，回流加熱至60°C，攪拌至完全溶解，過濾，室溫放置，直至晶體完全析出，重結晶一次，獲得二氫青蒿酸產品20.33g，經氣相色譜檢測(方法與實施例1相同)，二氫青蒿酸含量為99.11%。
[0023] 實施例6
取完全干燥的青蒿素生產廢料1.2kg，加入4.8L 0.3%(ff/V)的氫氧化鈉溶液，將青蒿素生產廢料攪碎，調節pH值至8.5，55°C浸泡26min，室溫下2800rpm離心15min，取上清液。打開層析柱下端活塞，以1.2BV/h的速度上柱(D209陰離子交換樹脂的最初處理量為1200mL)，上柱完畢后，關閉層析柱下端活塞，靜態吸附至飽和。吸附完畢，打開層析柱下端活塞，采用6.0L去離子水沖洗，沖洗速度為5BV/h。取9.5%(ff/V)氯化銨溶液和80%(V/V)食用酒精按1:1體積比混合的混合液，加入層析柱，以2.5BV/h的速度進行洗脫，收集洗脫液共3.6L。38°C下，真空濃縮洗脫液，濃縮至1/3體積，然后用1.2L氯仿萃取兩次，合并萃取液，真空濃縮至有機溶劑全部揮干，得二氫青蒿酸粗產品21.33g，于該二氫青蒿酸粗產品中加入91.0OmL分析純石油醚，回流加熱至65°C，攪拌至完全溶解，過濾，室溫放置，直至晶體完全析出，重結晶一次，獲得二氫青蒿酸產品20.05g，經氣相色譜檢測(方法與實施例1相同)，二氫青蒿酸含量為99.11%。
【權利要求】
1.一種離子交換樹脂法從青蒿素生產廢料中分離精制二氫青蒿酸，其特征在于，該方法步驟如下: (1)樣品處理:按每升陰離子交換樹脂使用1.0-1.45公斤干燥的青蒿素生產廢料的比例，取干燥的青蒿素生產廢料，再按Ig干燥的青蒿素生產廢料加3-4.5ml質量體積濃度為0.3%的氫氧化鈉溶液的比例，于干燥的青蒿素生產廢料中加入氫氧化鈉溶液，將青蒿素生產廢料攪碎，調節pH值至8.0-9.0，50-60°C下浸泡20_30min，室溫下離心，收集上清液； (2)上柱、沖洗、解吸:取上述上清液，以1-1.5BV/h的速度通過裝有陰離子交換樹脂的層析柱，靜態吸附至飽和；采用5-6BV的去離子水沖洗，沖洗速度為4-6BV/h ;再取6-10%質量體積濃度的氯化銨溶液和60-85%體積濃度的食用酒精按1:1的體積比混合的混合液，以2-3BV/h的速度進行洗脫，收集洗脫液； (3)濃縮、萃取:35-40°C下，真空濃縮上述洗脫液，濃縮至1/3體積，然后于濃縮液中按I:1的體積比，加入有機溶劑萃取兩次，合并萃取液，真空濃縮至有機溶劑全部揮干，得二氫青蒿酸粗產品； (4)結晶:按Ig二氫青蒿酸粗產品加3-5ml有機溶劑的比例，于上述二氫青蒿酸粗產品中加入有機溶劑，回流加熱至60-70°C，溶解，過濾，室溫放置，直至晶體完全析出，重結晶一次，獲得二氫青蒿酸產品。
2.如權利要求1的離子交換樹脂法從青蒿素生產廢料中分離精制二氫青蒿酸，其特征在于，所述步驟(2 )中的陰離子交換樹脂是指717、D201、201 X 4或D209陰離子交換樹脂。
3.如權利要求1的離子交換樹脂法從青蒿素生產廢料中分離精制二氫青蒿酸，其特征在于，所述步驟(I)中干燥后的青蒿素生產廢料的含水率〈3%、有機溶劑〈1%。
4.如權利要求1的離子交換樹脂法從青蒿素生產廢料中分離精制二氫青蒿酸，其特征在于，所述步驟(I)中的離心轉速為2500-3000rpm/min，時間為15min。
5.如權利要求1的離子交換樹脂法從青蒿素生產廢料中分離精制二氫青蒿酸，其特征在于，所述步驟(3)中萃取時用的有機溶劑為乙酸乙酯、氯仿或二氯甲烷，該乙酸乙酯、氯仿和二氯甲烷均為分析純。
6.如權利要求1的離子交換樹脂法從青蒿素生產廢料中分離精制二氫青蒿酸，其特征在于，所述步驟(4)中加入的有機溶劑為乙酸乙酯、丁酮或石油醚，該乙酸乙酯、丁酮和石油醚均為分析純。
【文檔編號】C07C51/47GK104230699SQ201410535332
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年10月13日 優先權日:2014年10月13日
【發明者】劉碩謙, 田冬銘, 廖歡, 曹娟, 揚威, 吳敦超, 周蘭 申請人:湖南農業大學