金花茶皂苷a及其制備方法和抗腫瘤用途
【專利摘要】金花茶中分離出新的金花茶皂苷A化合物及其制備方法，以及該化合物在抗腫瘤中的應(yīng)用。本發(fā)明對(duì)金花茶分離得到了一種達(dá)瑪烷皂苷類新化合物，新化合物命名為(3β,6α,12β)-3,6,12-三羥基達(dá)瑪烷-24-烯-20-甲基-2-O-β-D-吡喃葡萄糖-(2→1)-O-β-D-吡喃葡萄糖-(2→1)-O-α-L-吡喃鼠李糖苷[(3β,6α,12β)-3,6,12-trihydroxydammar-24-en-20-yl- 2-O -β-D-glucopyranosyl-(2→1)-O-β-D-glucopyranosyl-(2→1)-O-α-L-Rhamnopyranoside]，本發(fā)明采用CCk-8法對(duì)此新化合物進(jìn)行了抗腫瘤活性檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示此化合物具有抑制人肺癌BeL-7402細(xì)胞、SMMC-7721等生長(zhǎng)的活性。
【專利說(shuō)明】金花茶皂苷A及其制備方法和抗腫瘤用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種從金花茶（Camellia chrysanth(Hu)Tuyama)中分離出的新的金 花茶皂苷A化合物及其制備方法，以及該化合物在抗腫瘤應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 金花茶（Camellia chrysanth(Hu)Tuyama)是山茶科，山茶屬，金花茶組，金花茶系 植物。為常綠灌木或小喬木。主產(chǎn)于中國(guó)廣西境內(nèi)北回歸線以南的兩間斷地區(qū)，1933年7 月29日，我國(guó)植物學(xué)家左景烈在廣西防城縣大箓多阿泄隘最先發(fā)現(xiàn)金花茶，在已發(fā)現(xiàn)的23 種金花茶中有21種生長(zhǎng)在防城港，金花茶被列為國(guó)家一級(jí)保護(hù)珍稀植物。金花茶具有極高 的觀賞價(jià)值外，同時(shí)還具有很高的藥用價(jià)值。含有多種保健成份，一直被民間作清熱解毒、 利尿利濕、止痢止血等使用。金花茶中含有的主成分金花茶皂苷，皂苷類成分對(duì)人體的新陳 代謝也起著重要的生理作用。它可以抑制血清中脂類氧化，抑制過(guò)氧化脂質(zhì)生成。降低血 清中膽固醇的含量，抑制過(guò)氧化脂質(zhì)對(duì)肝臟的損傷，防止動(dòng)脈硬化，因而它具有抗衰老的作 用。同時(shí)皂苷還具有免疫調(diào)節(jié)作用，增強(qiáng)機(jī)體免疫力。皂苷對(duì)核酸和蛋白質(zhì)合成有促進(jìn)作 用，可增加肝、肌肉組織中蛋白質(zhì)與DNA的含量，提高機(jī)體的耐力。
[0003] 在金花茶皂苷【技術(shù)領(lǐng)域】， 申請(qǐng)人:檢索到如下兩篇相關(guān)的技術(shù)文獻(xiàn)：
[0004] 文獻(xiàn)1 :題名：《金花茶葉皂苷類成分研究》，作者：蘇琳，莫建光，韋英亮等；刊物： 《中草藥》，2012, 43 (5)，877-879。
[0005] 該文獻(xiàn)研究了金花茶Camellia  ;euphlebia葉阜苷類成分。方法利用超聲提 取、大孔樹(shù)脂富集以及制備色譜對(duì)金花茶葉水溶性部分進(jìn)行分離純化，運(yùn)用NMR、MS、IR等 光譜手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)果分離得到3個(gè)單體化合物，分別為人參皂苷Rgl(I)、人參皂 苷Fl (2)和人參皂苷F5 (3)。結(jié)論化合物1?3均為首次從該植物中分離得到的人參皂苷， 其中人參皂苷Rgl、F5為首次從山茶屬中分離得到。金花茶為國(guó)家一級(jí)保護(hù)的珍稀藥用植 物，這些成分的分離鑒定對(duì)其進(jìn)一步的活性研究、開(kāi)發(fā)利用和推廣種植具有重要意義。但 該文獻(xiàn)分離得到的人參皂苷Rgl(I)、人參皂苷Fl (2)和人參皂苷F5 (3)三種化合物均是前 人研究已經(jīng)定性的化合物，對(duì)金花茶的深度開(kāi)發(fā)作用有限。
[0006] 文獻(xiàn)2 :題名：《金花茶皂甙的分離純化及化學(xué)結(jié)構(gòu)研究》；作者：曾秋文；刊物：廣 東海洋大學(xué)碩士論文，2010年。
[0007] 該文獻(xiàn)研究以金花茶葉為實(shí)驗(yàn)材料提取其中的皂甙成分，然后篩選分離樹(shù)脂純 化，對(duì)皂甙進(jìn)行分離純化。通過(guò)抗氧化指標(biāo)比較皂甙組分的抗氧化活性，并對(duì)抗氧化活性 最高的皂甙組分進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，分析其理化性質(zhì)，為金花茶皂甙的構(gòu)效關(guān)系研究 提供理論依據(jù)。
[0008] 研究的主要內(nèi)容及結(jié)果如下：
[0009] 1、以新鮮金花茶葉為原料，經(jīng)過(guò)微波滅酶后進(jìn)行組織破碎，采用超聲波浸提及納 米超濾等方法進(jìn)行提取和濃縮，得到金花茶濃縮液。金花茶濃縮液經(jīng)過(guò)乙醇沉淀去雜、乙 醚脫色得到粗皂甙提取液。試驗(yàn)結(jié)果顯示金花茶粗皂甙提取液中主要含有皂甙并含有少量 的茶多酚，皂甙含量約為茶多酚的10倍。
[0010] 2、通過(guò)靜態(tài)吸附率和解吸率等指標(biāo)比較了聚酰胺樹(shù)脂、XAD16、DM130和XAD1600 等4種樹(shù)脂對(duì)金花茶粗皂甙分離的效果，并選擇XAD16作為分離樹(shù)脂對(duì)金花茶粗皂甙進(jìn) 行分離純化。分離純化結(jié)果：在水以及和30%異丙醇洗脫液處分別得到了 WS、 151、 IS2、IS3等4個(gè)皂甙組分。各皂甙組分的得率分別為34. 8%、9. 1%、20. 3%、31.8%， 皂甙總得率達(dá)96.0%。高效液相色譜分析結(jié)果顯示，相對(duì)于粗皂甙，各皂甙組分的吸收峰 數(shù)量明顯減少，表明XAD16大孔吸附樹(shù)脂層析柱可以有效將金花茶粗皂甙分離出極性不同 的皂甙組分。
[0011] 3、以維生素C為參照物，通過(guò)羥基自由基清除試驗(yàn)、超氧陰離子清除試驗(yàn)、 DPPH ·自由基清除試驗(yàn)、磷鑰絡(luò)合物法等4種不同的抗氧化試驗(yàn)，比較了粗皂甙、WS、IS1、 152、 IS3等皂甙組分的抗氧化活性。結(jié)果顯示，各皂甙組分均有明顯的抗氧化活性，在 清除羥基自由基實(shí)驗(yàn)中，ISl的清除率為66. 5 %，比維生素C及其他三個(gè)皂甙組分高；在 DPPH ·自由基清除試驗(yàn)中，ISl的清除率為96. 3%，接近同濃度維生素C的清除率100% ; 在清除超氧陰離子的實(shí)驗(yàn)中，ISl的清除率達(dá)到64. 7%，比皂甙組分IS2、IS3高；在磷鑰 絡(luò)合物法實(shí)驗(yàn)中，ISl的抗氧化活性比皂甙組分IS2、IS3高37. 1%、39. 8%，可以看出ISl 的抗氧化活性較為顯著。
[0012] 4、通過(guò)XAD1600柱層析和聚酰胺柱層析對(duì)抗氧化活性最高的皂甙組分ISl進(jìn)行 進(jìn)一步的分離純化，得到ISlA皂甙組分。高效液相色譜分析結(jié)果顯示，ISlA出現(xiàn)唯一一 個(gè)尖銳的峰，表明ISlA為單一化合物?？寡趸钚苑治鼋Y(jié)果顯示，ISlA的抗氧化活性較 ISl高出10%左右，表明ISlA是主要的功效因子。顏色反應(yīng)及構(gòu)成糖薄層層析分析結(jié)果 顯示，ISlA是含有葡萄糖和半乳糖的三萜類皂甙。對(duì)于具體的化學(xué)結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步分析。
[0013] 但是該文獻(xiàn)的研究因其工藝比較粗糙，雖然得到了 WS、ISl、IS2、IS3等4個(gè)皂甙 組分，但因其組分比較復(fù)雜，純度不夠，無(wú)法確定其組分的具體成分和結(jié)構(gòu)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0014] 本發(fā)明是針對(duì)本領(lǐng)域以上現(xiàn)有研究的不足，提供一種以金花茶為原料，制備的金 花茶皂苷A及其制備方法，以及金花茶皂苷A的抗腫瘤用途。本發(fā)明的具體方案如下：
[0015] 金花茶皂苷4，其化學(xué)名稱為：（30，6〇，120)-3,6，12-三羥基達(dá) 瑪烷-24-烯-20-甲基-2-0-β-D-吡喃葡萄糖-(2 - 1)-0-β-D-吡喃葡萄 糖-(2 - I) -0- a -L-吡喃鼠李糖苷，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：
[0016]
【權(quán)利要求】
1. 金花茶皂苷A，其特征在于：所述的金花茶皂苷A化學(xué)名稱為： (3β，6α，12β) -3, 6，12-二輕基達(dá)瑪燒-24-稀-20 -甲基K- β -D-批喃甸萄 糖-(2 - I) -O- β -D-吡喃葡萄糖-(2 - I) -O- a -L-吡喃鼠李糖苷，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：
該化合物為白色針狀晶體；溶解性：溶于甲醇、乙醇，微溶于水，不溶于石油醚、氯仿； 熔點(diǎn)范圍：192°C?197°C ;其分子式為：C48H82O18 ;分子量為：946 ;重金屬（以pb計(jì)）：彡5. 0 mg/Kg ;灰分：彡（λ 2% ;水分：彡（λ 5% ;有關(guān)物質(zhì)：彡5. 0%。
2. -種如權(quán)利要求1所述的金花茶皂苷A的制備方法，其特征在于：包括以下步驟： (1) 原料提?。阂越鸹ú铻樵?，經(jīng)甲醇-水或乙醇-水溶液提取獲得金花茶提取液； (2) 大孔吸附樹(shù)脂處理金花茶提取液：將金花茶提取液濃縮后加水溶解，并經(jīng)大孔樹(shù)脂 吸附獲得大孔樹(shù)脂吸附物； (3) 金花茶粗皂甙的制備：然后將大孔樹(shù)脂吸附物經(jīng)一次柱層析分離得到金花茶粗皂 甙； (4) 由金花茶粗皂甙制備金花茶皂苷A :最后將金花茶粗皂甙再經(jīng)二次柱層析分離即 可得到單一高純度的化合物，經(jīng)結(jié)構(gòu)測(cè)定確認(rèn)為金花茶皂苷Α。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的金花茶皂苷A的制備方法，其特征在于：所述的大孔吸附樹(shù) 脂為XAD-16、D101、ΑΒ-8、ΗΡ-20中的一種；所述的一次柱層析分離和二次柱層析分離所用 的擔(dān)體均為硅膠。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3任一所述的金花茶皂苷A的制備方法，其特征在于：所述的二次 柱層析分離為：將金花茶粗皂甙濃縮至干，干法上擔(dān)體進(jìn)行柱層析分離，用體積比為15? 25:1?4的氯仿-甲醇進(jìn)行洗脫，然后取洗脫液進(jìn)行薄層色譜檢測(cè)，合并123?162流份并 濃縮得濃縮液，將濃縮液再上擔(dān)體進(jìn)行柱層析分離，重復(fù)二次柱層析分離步驟一次，最后得 到的濃縮液靜止結(jié)晶后即可得到金花茶皂苷A。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4任一所述的金花茶皂苷A的制備方法，其特征在于：所述的一次柱 層析分離為：將大孔樹(shù)脂吸附物濃縮至干，干法上擔(dān)體進(jìn)行柱層析分離，用體積比為15? 25:1?4的氯仿-甲醇進(jìn)行洗脫，然后取洗脫液進(jìn)行薄層色譜檢測(cè)，合并123?162流份并 濃縮得濃縮液，將濃縮液濃縮至干得到金花茶粗皂甙。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的金花茶皂苷A的制備方法，其特征在于：所述的金花茶是 指是山茶科山茶屬金花茶組金花茶系植物的根、莖、葉，并將金花茶的根、莖、葉切成l-3cm 長(zhǎng)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的金花茶皂苷A的制備方法，其特征在于：所述的原料提取 步驟中使用的設(shè)備為：超聲波提取器；提取的固液比為1:10?20 ;提取條件為40°C?80°C 條件下以15-35KHZ超聲波浸提l-5h。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的金花茶皂苷A的制備方法，其特征在于：所述的甲醇-水或 乙醇-水溶液中甲醇或乙醇與水的體積比為：50?95:50?5。
9. 權(quán)利要求5所述的金花茶皂苷A的制備方法，其特征在于：所述大孔樹(shù)脂吸附物濃 縮至干為：將大孔樹(shù)脂吸附物用水洗脫5個(gè)柱體積，然后用70%的乙醇洗脫，收集70%乙醇 部分，蒸干后即得金花茶總皂苷。
10. 權(quán)利要求1所述的金花茶皂苷A在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07J17/00GK104262445SQ201410439636
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月1日
【發(fā)明者】黃艷, 莫建光, 韋英亮, 葛利, 潘艷坤, 蘇琳 申請(qǐng)人:廣西壯族自治區(qū)分析測(cè)試研究中心