從動物心管制備膠原蛋白肽的方法

從動物心管制備膠原蛋白肽的方法
【專利摘要】本發明公開了一種從動物心管制備膠原蛋白肽的新型方法。所述方法包括如下步驟：包括新鮮動物心管的低溫保持，切碎，浸泡漂洗，磨漿，酸浸提，離心，酶解，納濾脫鹽，除菌冷凍干燥等步驟。本發明的方法具有抽提效果好，所獲得膠原蛋白肽具有純度高、高活性和容易吸收等特點。本發明還提供了通過本發明方法所制備的膠原蛋白肽在制備藥物、食品、保健品和化妝品的用途。本發明方法操作簡單，生產成本低廉，適用于大規模工業化生產，實現了從動物心管中高效制備高活性膠原蛋白肽的目的。
【專利說明】從動物心管制備膠原蛋白肽的方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及從動物心管中制備膠原蛋白肽的方法，屬于蛋白質生物化學工程領域。

【背景技術】
[0002]膠原蛋白(Collagen)又稱膠原，是由三條肽鏈擰成的螺旋形纖維狀蛋白質，是細胞外結締組織最重要的水不溶性纖維蛋白，是構成細胞外基質的骨架，占人體蛋白質總量的25% -30%，是人體內含量最多的蛋白質。結締組織除了含60~70%的水分外，膠原蛋白占了約20~30%，因為有高含量的膠原蛋白，結締組織具有了一定的結構與機械力學性質，如張力強度、拉力、彈力等以達到支撐、保護的功能。原膠原是由三條α-肽鏈組成的纖維狀蛋白，相互擰成三股螺旋狀構型，長300nm，直徑1.5nm。膠原蛋白，主要存在于人和動物的皮膚、骨骼、眼睛、牙齒、肌腱、內臟(包括心、胃、腸、膀胱、血管、肺、氣管、腦等)部位，所有組織臟器都含有不同數量和種類的膠原蛋白，其功能是維持組織器官的形態和結構，也是修復各損傷組織的重要原料物質。人體膠原蛋白有28種，不同部位所含的膠原蛋白的類型也各不相同。不同類型的膠原蛋白定位于體內的特定組織，也有2-3種不同的膠原存在于同一組織中。血管中主要含有I型和III型膠原蛋白，血管屬于上皮組織，其組成中膠原蛋白和硬彈性蛋白含量較高，保證了血管有一定的強度容納血液，并有一定的滲透性來保證物質交換正常進行。膠原蛋白能維護血管彈性，防止血管破裂、栓塞。
[0003]為了確保膠原蛋白原有構象，我們在低溫和低酸堿度的條件下，使用動物心臟大血管，即心管生產富含III型膠原蛋白的產品，并使用酶解法制備膠原蛋白肽。


【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種從動物心管制備高活性膠原蛋白肽的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步驟:所述包括如下步驟:動物心管的低溫保持，切碎，浸泡漂洗，磨漿，酸抽提，離心，酶解，過濾，納濾脫鹽，除菌冷凍干燥步驟。
[0005]在本發明的又一個方面，對所述動物心管的低溫非變性處理包括快速低溫冷凍處理；優選地，所述動物為哺乳動物，例如牛、豬、羊等哺乳動物。
[0006]在本發明的又一個方面，利用酸抽提的方法從所述動物心管提取膠原蛋白，所述的酸為有機酸或無機酸，優選為醋酸。
[0007]在本發明的又一個方面，提供了一種從動物心管制備高活性膠原蛋白肽的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步驟:
[0008]I)取冷凍動物心管，切碎后加入5-10倍體積的清水，用清水反復沖洗3次，去除血水，骨泥磨磨漿后，加入20-40倍體積的2-10%醋酸，攪拌浸提6-12小時，用14000轉/離心，收集沉淀得膠原蛋白粗品；
[0009] 2)膠原蛋白粗品加3-5倍重量體積去離子水，攪拌混勻，調pH7_9.0，加入膠原蛋白粗品重量的0.1%胰蛋白酶，42°C保溫水解6-8小時，得酶解膠原蛋白肽粗品；
[0010]3)酶解膠原蛋白肽粗品用0.2微米的濾膜過濾，過濾液用截留分子量在400-500道爾頓的納濾膜納濾脫鹽3-5次，再濃縮到含蛋白肽4-10%，
[0011]上述的脫鹽、濃縮步驟如下:先納濾膜濃縮，然后加水稀釋到原體積時再進行納濾膜濃縮以達到脫鹽的目的，反復3-5次；
[0012]4)除菌過濾，冷凍干燥制備高活性的動物心管膠原蛋白肽凍干粉。
[0013]在本發明的一個具體方面，提供了一種從動物心管制備高活性膠原蛋白肽的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步驟:
[0014]I)取冷凍動物心管，切碎，加5倍體積的清水，浸泡過夜，用清水反復沖洗3次，去除血水，骨泥磨磨漿后，加入20倍體積3%醋酸，攪拌浸提8小時，用14000轉/分離心，收集沉淀得膠原蛋白粗品；
[0015]2)沉淀加3-5倍重量體積去離子水，攪拌混勻，調pH8.6，加入膠原蛋白粗品重量的0.1%胰蛋白酶，42°C保溫水解8小時，得酶解膠原蛋白肽粗品；
[0016]3)酶解膠原蛋白肽粗品用0.2微米的濾膜過濾，過濾液用截留分子量在400-500道爾頓的納濾膜納濾脫鹽3次，再濃縮到含蛋白肽4-10%，
[0017]上述的脫鹽、濃縮步驟如下:先納濾膜濃縮，然后加水稀釋到原體積時再進行納濾膜濃縮以達到脫鹽的目的，反復3次；
[0018]4)除菌過濾 ，冷凍干燥制備高活性的動物心管膠原蛋白肽凍干粉。
[0019]在本發明的另一個方面，提供了一種膠原蛋白肽產品，當膠原蛋白肽濃度為0.5mmol/mL時，其具有超過40%以上的ACE抑制率；且當膠原蛋白肽濃度為1mmol/mL時，其具有超過60%以上的ACE抑制率；和低于0.55mg/mL IC500
[0020]在本發明的又一個方面，提供了一種膠原蛋白肽產品，當膠原蛋白肽濃度為0.5mmol/mL時，其具有大于45%的ACE抑制率；且當膠原蛋白肽濃度為1mmol/mL時，其具有大于65%的ACE抑制率；和低于0.50mg/mL IC500
[0021]在本發明的另一個方面，提供了通過本發明方法制備的膠原蛋白制品的用途，所述的用途包括將所述的膠原蛋白用于預防和/或防治受試者老化的藥物、食品、保健品或化妝品中的應用。其中，所述藥物、食品、保健品或化妝品為口服制劑、外用制劑、吸入制劑、經鼻制劑、經直腸制劑、經皮制劑或注射制劑。
[0022]本發明的方法操作簡單，生產成本低廉，適用于大規模工業化生產，實現了從動物心管中高效制備膠原蛋白資源。離心和過濾所得到的濾液由于不含有任何有害物質，不會污染環境。本工藝幾乎不產生固形廢棄物，沒有垃圾，無需專門進行垃圾處理。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1、從動物心管制備膠原蛋白肽工藝流程圖。
[0024]圖2、馬尿酸含量測定標準曲線。
[0025]圖3、不同膠原蛋白的ACE活性抑制效果。
[0026]圖4、不同膠原蛋白的IC5tl比較。
[0027]圖5、根據本發明方法所制備的牛、豬和羊心管膠原蛋白肽的凍干粉外部形狀。【具體實施方式】
[0028]為了提供對本發明的實質性理解，在下文中以不同的詳細程度描述了本發明的某些方面、模式、實施方式、變型和特征。
[0029]在實施本發明的過程中，使用了生物化學、蛋白質生物化學、醫學、病理學、動物實驗學的很多傳統技術。這些技術是熟知的。
[0030]在本發明的一個實施方式中，本發明提供了一種從動物心管制備高活性膠原蛋白肽的新型方法。所述方法包括如下步驟:包括動物心管的低溫保持，切碎，浸泡漂洗，磨漿，酸抽提，離心，酶解，過濾，納濾脫鹽，除菌冷凍干燥等步驟(如圖1所示)。
[0031]術語“動物”是指動物學意義上的任何動物，優選為哺乳動物。所述哺乳動物可源自于任何種類的動物，包括陸生的或者水生的哺乳動物，本文的陸生哺乳動物包括但不限于人類、猩猩，猴、牛、水牛、野牛、豬、野豬、羊(例如羊蓋、綿羊、山羊)、驢、鹿、駱騎、鼠類、馬等，本文的水生哺乳動物包括但不限于鯨魚、河馬、海豹等。因此本文中的哺乳動物是指能夠提供心管的一切哺乳動物，并且用該心管制備膠原蛋白。
[0032]術語“一”，“一種”和“該”:除非內容清楚指明，否則本說明和所附的權利要求中使用的單數形式“一”，“一種”和“該”包括復數的引用對象。例如，所提及的“一種心管”包括兩種不同動物心管或更多種動物心管的組合等。
[0033]在本發明的又一實施方式中，提供了哺乳動物心管的非變性的低溫保持方法。所述心管可以整塊冷凍保存，也可以成數個大塊甚至切碎保存。保存時可以不加任何添加劑或者添加添加劑以防止凍結變性。常用防止心管凍結變性的防護劑本文僅為舉例但不限于例如糖類和/或糖醇類。
[0034]本發明可以直接使用新鮮的心管組織也可以使用低溫保持過的動物心管組織。
[0035]術語“低溫保持”包括“冷藏保持”和“冷凍保藏”兩種方式。
[0036]在另一個實施方式中，冷藏保持可在低于約10°C的溫度下將所述肉與所述組合物一起溫育，例如在(TC以上至約9 °C之間，適合地在約I °C至約5 °C，適合地在約2 °C至約6 °C之間，優選在約2°C至約4°C之間溫育。
[0037]當將所述肉與所述組合物在低于約10°C的溫度下低溫保持，例如在約0°C至約9 0C之間的溫度，適合地在約I °C至約5 °C之間的溫度，適合地在約2 °C至約5 °C之間的溫度，優選在約2°C至約4°C之間的溫度溫育時，優選將所述肉與所述組合物溫育約4小時至約20小時之間。
[0038]在一個實施方式中，適合地，可將所述肉與所述組合物冷凍保藏約I天至35天，適合地一起冷凍保藏約2天至20天小時之間，優選在一起冷凍保藏約5天至10天。
[0039]在另一個實施方式中，可在低于約(TC (比如液態氮)的溫度下將所述肉與所述組合物一起冷凍保藏，例如在0°c以下至約-180°c之間，適合地在約-20°c至約-80°c，適合地在約_25°C至約_80°C之間，優選在約_25°C至約_40°C之間冷凍保藏。
[0040]術語“快速低溫冷凍”就是將要處理的動物組織，通過噴灑，或者直接置于液氮_180°C等超低溫的液體內，達到動物組織瞬間降溫的效果。然后再將處理后的動物組織置于所期望的溫度中冷凍保存，該方法也可以被稱之為“cooling shock”。
[0041] 當將所述肉與所述組合物在低于約0°C (比如液態氮)的溫度下將所述肉與所述組合物一起冷凍保藏時，例如在0°c以下至約-180°c之間，適合地在約約-20°c至約-80°c，更適合地在約_25°C至約_80°C之間，優選在約_25°C至約_40°C之間冷凍保藏約5天至8天。
[0042]所述糖類可以是白砂糖、木糖、葡萄糖、聚葡萄糖、果糖、半乳糖、鼠李糖、異麥芽酮糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、海藻糖、低聚果糖、木糖、異麥芽糖、低聚麥芽糖、低聚異麥芽糖、異麥芽酮糖、低聚半乳糖(半乳寡糖)、甘露低聚糖(甘露寡糖)、低聚木糖(木寡糖)、淀粉、纖維素、肝糖原、肌糖原、蛋白多糖、蜂蜜等，這些甜味劑可以單獨使用或者由上述甜味劑組成的組的一種或兩種以上混合使用；優選為使用白砂糖、海藻糖、木糖、果糖、半乳糖、異麥芽糖、低聚麥芽糖、低聚異麥芽糖、異麥芽酮糖、聚葡萄糖，更優選為海藻糖、異麥芽糖、低聚麥芽糖、低聚異麥芽糖、異麥芽酮糖、和/或聚葡萄糖。用于本發明的糖醇類可以是赤蘚糖醇(赤藻糖醇)、木糖醇、山梨糖醇、甘露醇、麥芽糖醇、葡萄糖醇、異麥芽糖醇、木糖醇、乳糖醇和異麥芽酮糖醇，優選為赤蘚糖醇、山梨糖醇、異麥芽糖醇，更優選為赤蘚糖醇和/或異麥芽糖醇。如果心管組織為1000重量份來計算，糖類和/或糖醇類可以為20-80重量份，合適為20-70重量份，優選為20-65重量份，更優選為20-50重量份，最優選為25-50重量份。
[0043]在本發明的又一個【具體實施方式】中，將動物心管切成切片、塊、絲、條、剁碎成肉末和/或機械粉碎成肉糜，優選為肉末或肉糜。使其形狀更有利于充分如下抽提步驟。
[0044]在本發明的又一個【具體實施方式】中，對切碎的動物心管進行了浸泡和漂洗。浸泡可以用1-10倍或者10倍以上的清水來進行，溫度可以在0-25°C直接任意溫度進行，通常在低于10°C、例如8°C 、6°C或4°C，優選4°C。通常浸泡過夜，對于浸泡效果本領域技術人員可以根據實際觀察的心管組織的狀態做出選擇。漂洗可以進一步去除動物心管中的漂浮的脂肪和血水，通常漂洗2次以上，例如3次，4次，5次等。
[0045]在本發明的又一個【具體實施方式】中，對浸泡漂洗后的動物心管進行了酸抽提。所述的酸包括有機酸或無機酸。
[0046]本文中的術語“有機酸”是指單獨一種有機酸，或將兩種以上的有機酸。用于本發明的所述有機酸選自一元羧酸、二元羧酸和多元羧酸組成的組的一種或兩種以上，例如，所述一元羧酸包括但不限于甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、乳酸、辛酸、葵酸、月桂酸、肉桂酸、ARA(花生四烯酸)、硬脂酸、亞麻酸、油酸、亞油酸、芥酸、肉豆蘧酸、葡萄糖酸、棕櫚酸，適合地為乳酸、月桂酸、肉桂酸、花生酸、硬脂酸、亞麻酸、油酸、葡萄糖酸、亞油酸、棕櫚酸，優選具有乳酸、月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸、葡萄糖酸。本文僅為舉例性質，所述二元羧酸包括但不限于蘋果酸、琥珀酸、酒石酸、馬來酸、甲基馬來酸、富馬酸、甲基富馬酸、草酸、丙二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸，適合地為蘋果酸、琥珀酸、酒石酸、馬來酸；優選地為蘋果酸、琥珀酸。
[0047]術語“無機酸”包括含有鹵素、碳、氮、硼、硅、磷、硫等原子的含有氧或者非含有氧原子的所有無機酸；僅為舉例性質例如:碳酸、硫酸、亞硫酸、醋酸、硼酸、硝酸、亞硝酸、焦磷酸、亞磷酸、磷酸、氯酸、次氯酸、重鉻酸、溴酸、次溴酸、碘酸、次碘酸等；用于本發明的無機酸可以是一種或兩種以上的無機酸，優選地，所述無機酸為醋酸、碳酸、硫酸、亞硫酸、硝酸、亞硝酸、焦磷酸、亞磷酸、磷酸所組成的組的一種或兩種以上的；更優選地，所述無機酸為醋酸。
[0048]在本發明的進一步優選實施方式中，所述的酸為是硫酸，鹽酸，檸檬酸，醋酸，甲酸，丁酸，更優選為醋酸。
[0049]上述酸可以為固體或者是液體，如果是固體一般用水溶解后稀釋使用。
[0050]按照體積比，用于抽提的動物心管組織沉淀與液體酸的體積比(vol:vol)為1:2-40，例如1:5-40，1:10-40，或1:20_40。酸的濃度根據具體酸的性質而定，使用醋酸的情況下，可以是 1% -20%，例如 1% -15%,1-10%,2-10%ο
[0051]上述抽提的pH 為 1-6.8，例如 pH 為 6.7,6.6,6.5,6.4,6.2,6.1,6.0,5.9,5.8、
5.7,5.6,5.5,5.4,5.3,5.2,5.1 有時候低于 5 都有可能，例如 pH 低于 4.5,4.0,3.5,3.0，甚至低于2.0。
[0052]抽提的溫度可以選擇在室溫中進行，也可以在低于室溫下進行，低于20°C，例如180C、16°C、15°C，合適地 10°C 以下，例如 8°C、6°C、或 4°C。
[0053]抽提時間依據抽提溫度、抽提效果和膠原蛋白性質來決定，例如2-24小時，例如，4-20小時，6-16個小時；即使抽提超過24小時也是可能的。在一些實例中進行了過夜抽提，即抽提在通常在8-12小時。本領域技術人員會根據抽提液的濃度和效果選擇合理的抽提時間。
[0054]本發明的另一【具體實施方式】是對抽提后樣品采用了離心操作，離心可以采用實驗室常用的各種離心設備，例如真空離心機，或非真空離心機。也可采用冷凍離心機或者常溫離心機。工業化生產的離心機。例如:高速連續離心機，此外離心機離心力的計算為本領域已知的技術。例如，離心機的轉速和相對離心力計算公式為:RCF(g)=
11.18X (rpm/1000)2XR
[0055]其中:RCF是英文Relative Centrifugal Forece (相對離心力)的簡稱，通常以克(g)為單位。RPM為revolut1ns per minute的簡稱，即每分鐘離心機的轉了多少轉。
[0056]2為開平方
[0057]R為離心機半徑，例如水平離心機半徑為離心機軸至試管底部的距離，；或垂直式離心機為離心機軸至試管口中央的距離，以厘米(cm)為單位來表示。
[0058]例如水平離心機半徑R = 10cm, rpm = 10000時，其RCF = 11180g
[0059]例如垂直式離心機半徑R = 15cm, rpm = 10000時,其RCF = 16770g
[0060]通常離心力大小以g為單位進行計算轉速的設定，離心力可以在10000g以上，也可以在100g至20000g之間，例如100g至1000g之間，優選為8000g，更優選為lOOOOOg。
[0061]離心也可以以每分轉速來表示，例如，在1000、1500、2000、3000、5000、10000轉以上，15000轉以上，20000轉甚至100000轉以上。
[0062]離心溫度可以選擇在室溫中進行，也可以在低于室溫下進行，例如低于20°C，或低于15°C，優選為低于10°C，更優選為6°C，最優選為4°C。
[0063]離心時間可以為任何小時，基于不能使離心時間過長導致過多的雜質沉淀而導致純度降低，同時過長時間也容易導致膠原蛋白變性。合適為0.5-2小時，優選為0.5-1個小時,例如I小時，45分鐘，30分鐘。離心后可以有效去除含有雜質的上清液，保留含有膠原蛋白的沉淀粗品。
[0064]本發明的另一實施方式是對上述離心后膠原蛋白的沉淀粗品進行酶解(利用水解蛋白酶分解膠原蛋白)。本發明使用的水解蛋白酶分解膠原蛋白可以為任何酶，包括但不限于胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶中性蛋白蛋、酸性蛋白酶等，優選為胰蛋白酶。
[0065]上述水解時間可以在24小時以上，也可以在24小時以內，但為了水解效果和避免水解帶來的降解，比較合適的水解時間為12小時以內，例如2-12小時，2-10個小時，4-8個小時。優選為8小時,更優選為6小時,最優選為4小時。
[0066]在本發明的又一個實施方式中，提供了對酶解膠原蛋白肽粗品過濾和納濾脫鹽的方法，過濾采用了利用板筐壓濾機和納濾機過濾。常用的板筐壓濾機有手動板框壓濾機、機械板框壓濾機和液壓板框壓濾機，過濾機通常裝有過濾膜，膜的大小可以任意調節，例如5微米、2微米、I微米、0.5微米、0.2微米、0.1微米、0.05微米等等。同時采用納濾機進行濃縮脫鹽，常用的納濾機有空心纖維柱式納濾機和反滲透納濾機。納濾機通常裝置有納濾膜，其大小根據所截留蛋白分子大小的目的而設置，本發明采用了分子量為400-500道爾頓的納濾膜進行了納濾脫鹽和濃縮。
[0067]在本發明的一個【具體實施方式】中，提供了一種從動物心管制備高活性膠原蛋白肽的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步驟:
[0068]I)取冷凍動物心管，切碎后加入5-10倍體積的清水，用清水反復沖洗3次，去除血水，骨泥磨磨漿后，加入20-40倍體積的2-10%醋酸，攪拌浸提6-12小時，用14000轉/離心，收集沉淀得膠原蛋白粗品；
[0069]2)膠原蛋白粗品加3-5倍重量體積去離子水，攪拌混勻，調pH7_9.0，加入膠原蛋白粗品重量的0.1%胰蛋白酶，42°C保溫水解6-8小時，得酶解膠原蛋白肽粗品；
[0070]3)酶解膠原蛋白肽粗品用0.2微米的濾膜過濾，過濾液用截留分子量在400-500道爾頓的納濾膜納濾脫鹽3-5次，再濃縮到含蛋白肽4-10%，
[0071]上述的脫鹽、濃縮步驟如下:先納濾膜濃縮，然后加水稀釋到原體積時再進行納濾膜濃縮以達到脫鹽的目的，反復3-5次；
[0072]4)除菌過濾，冷凍干燥制備高活性的動物心管膠原蛋白肽凍干粉。
[0073]在本發明的進一步【具體實施方式】中，提供了一種從動物心管制備高活性膠原蛋白肽的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步驟:
[0074]I)取冷凍動物心管，切碎，加5倍體積的清水，浸泡過夜，用清水反復沖洗3次，去除血水，骨泥磨磨漿后，加入20倍體積3%醋酸，攪拌浸提8小時，用14000轉/分離心，收集沉淀得膠原蛋白粗品；
[0075]2)沉淀加3-5倍重量體積去離子水，攪拌混勻，調pH8.6，加入膠原蛋白粗品重量的0.1%胰蛋白酶，42°C保溫水解8小時，得酶解膠原蛋白肽粗品；
[0076]3)酶解膠原蛋白肽粗品用0.2微米的濾膜過濾，過濾液用截留分子量在400-500道爾頓的納濾膜納濾脫鹽3次，再濃縮到含蛋白肽4-10%，
[0077]上述的脫鹽、濃縮步驟如下:先納濾膜濃縮，然后加水稀釋到原體積時再進行納濾膜濃縮以達到脫鹽的目的，反復3次；
[0078]4)除菌過濾，冷凍干燥制備高活性的動物心管膠原蛋白肽凍干粉。
[0079]在本發明的又一個實施方式中，提供了一種膠原蛋白肽，其以對ACE(血管緊張素轉換酶)抑制的百分率和IC5tl來表征。如果以對ACE (血管緊張素轉換酶)抑制的百分率作為活力參數，當使用濃度0.lmmol/L本發明所制備的膠原蛋白肽制品時，超過22 %的ACE被抑制，例如大于25%，大于30%，甚至大于35%的ACE被抑制；當使用濃度為0.5mmol/L時，超過40%以上的ACE被抑制，例如大于45%以上或者大于50%以上的ACE被抑制；當使用濃度為lmmol/L時，超過60以上的ACE被抑制，例如大于65%以上或者大于70%以上的ACE被抑制。IC5tl是衡量ACE抑制劑效果的指標，也是對膠原蛋白的活性衡量指標。利用本發明方法所制備的各種心管膠原蛋白的IC5tl均低于0.65mg/mL,例如低于0.60mg/mL、
0.55mg/mL、0.50mg/mL、0.45mg/mL、0.40mg/mLo
[0080]同時，還對所制備的膠原蛋白肽的純度進行了測定，可以通過現有技術中的常用蛋白質條帶染色強度來衡量純度，在一些實施例中所制備的純度在60 %以上，例如均在80%以上。在本發明的又一些實施例中通過本發明的方法制備高純度的膠原蛋白肽，例如純度在 85%，86%，87%，88%，89%，90%，92%，95%，96% 以上。
[0081]蛋白質純度的檢測采用了常規的MS質譜分析儀，質譜分析儀檢測操作規程可參考說明書，通過本發明制備的心管膠原蛋白肽的純度均在85%以上，例如90%、91%、92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99.5%,99.6%,99.7%,99.8%,99.9%,99.95%,99.99%。
[0082]在本發明的一些實施方式中，對蛋白質濃度進行了測定，利用本發明方法制備的膠原蛋白肽的蛋白質濃度在850mg/g以上，例如900mg/g以上，950mg/g以上，980mg/g以上，990mg/g 或 995mg/g 以上。
[0083]在本發明的又一個實施方式中，提供了通過本發明方法制備的膠原蛋白制品的用途，所述的用途包括將所述的膠原蛋白用于預防和/或防治受試者老化的藥物、食品、保健品或化妝品中的應用。其中，所述藥物、食品、保健品或化妝品為口服制劑、外用制劑、吸入制劑、經鼻制劑、經直腸制劑、經皮制劑或注射制劑。
[0084]在本發明的再一個實施方式中，每天對人施用預防和/或治療有效量的含有本發明所制備的膠原蛋白肽，上述有效量可以為任何有效量，例如0.5ug/kg、lug/kg或10ug/kg人體重，合適地的有效量包括對人每天施用約lug/kg至約10000mg/kg體重的膠原蛋白肽。
[0085]通過如下實施例描述，更好地理解本發明，但本發明并不僅僅局限于所記載的實施例。
[0086]實施例
[0087]實施例1
[0088]牛屠宰后取新冷凍鮮心管1kg,切碎,加50升自來水,浸泡過夜,次日用清水反復沖洗3次，充分去除血水，用膠體磨磨漿，加入200升3%醋酸，攪拌浸提過夜。用14000轉/分離心，收集沉淀。沉淀加30升去離子水，攪拌混勻，調pH8.6，加入30克胰蛋白酶，42°C保溫8小時。用0.2微米的膜板筐過濾機過濾，穿過液用納濾機濃縮到10升，再加入去離子水到30升，攪拌后納濾濃縮，反復4次，最后濃縮到10升，冷凍干燥，得膠原蛋白肽0.3公斤。實施例2
[0089] 豬屠宰后取新鮮冷凍心管100kg，切碎，加500升自來水，浸泡過夜，次日用清水反復沖洗3次，充分去除血水，用膠體磨磨漿，加入2000升3%醋酸，攪拌浸提過夜。用14000轉/分離心，收集沉淀。沉淀加300升去離子水，攪拌混勻，調pH8.6，加入300克胰蛋白酶，42°C保溫8小時。用0.2微米的膜板筐過濾機過濾，穿過液用納濾機濃縮到100升，再加入去離子水到30升，攪拌后納濾濃縮，反復4次，最后濃縮到100升，冷凍干燥，得膠原蛋白肽
3.5公斤。
[0090]實施例3
[0091]豬屠宰后取新鮮冷凍心管500kg，切碎，加2500升自來水，浸泡過夜，次日用清水反復沖洗3次，充分去除血水，用膠體磨磨漿，加入10000升3%醋酸，攪拌浸提過夜。用14000轉/分離心，收集沉淀。沉淀加1500升去離子水，攪拌混勻，調pH8.6，加入3000克胰蛋白酶，42°C保溫8小時。用0.2微米的膜板筐過濾機過濾，穿過液用納濾機濃縮到2500升，再加入去離子水到15000升，攪拌后納濾濃縮，反復4次，最后濃縮到400升，冷凍干燥，得膠原蛋白肽20公斤。
[0092]實施例4
[0093]實驗為使用本工藝制備的豬心管膠原蛋白肽(下文稱之為自制豬心管膠原蛋白，為實施例1獲得的膠原蛋白肽)與市售的的德國(vikki膠原蛋白，http://www.vikkiup.com/)和法國產膠原蛋白肽(法國羅賽洛(R0USSEL0T)集團，http://cctv.manager8844.com/fIxdtjdbf/)進行血管緊張素轉化酶(Ang1tensin-Converting Enzyme,ACE)抑制試驗，以此檢驗我們制備的膠原蛋白肽質量。分為以下幾個步驟:
[0094](I)從豬肺中提取血管緊張素轉化酶(劉宏，陳蘭英.血管緊張素轉換酶純化與性質研究.中國生物化學與分子生物學報，2000，06:788-792 ;劉淑集，王茵，蘇永昌，吳成業.血管緊張素轉換酶(ACE)的提取與活性驗證，福建水產，2009，02:1-5)將200g新鮮豬肺放置冷藏室中12h后用預冷的0.9%的生理鹽水清洗，剪成小塊，除去脂肪和大血管，加入600mL的蒸餾水，斷續勻漿10 X 20s，加入15mL的10% Triton X-100，慢速攪拌30min，4層紗布過濾，濾液4°C離心(6000gX20min),保留上清液，1.6~2.6mol/L硫酸銨分級沉淀，收集沉淀溶液。用預冷的pH 8.3、100mmol/L的磷酸緩沖液(含0.3mol/L NaCl)溶解。溶解液離心后取上清進行透析以及濃縮，得到ACE濃縮液。
[0095](2)馬尿酸標準曲線的制作:將馬尿酸標準樣品用磷酸緩沖液溶解配成Immol/L的標準母液。然后將標準母液稀釋成5 μ mol/L、10 μ mol/L、50 μ mol/L、100 μ mol/L、150 μ mol/L、200 μ mol/L系列濃度。經0.45 μ M濾膜過濾后，在228nm下分別測定吸光值。以馬尿酸濃度為橫坐標，其吸光值為縱坐標，繪制標準曲線(見圖2)。
[0096]⑶ ACE活力測定參考Cushman等的(CUSHMAN D ff, CHEUNG H.Spectrophotometricassay and properties of the ang1tensin-converting enzyme of rabbit lung[J].B1chemical Pharmacology, 1971, 20: 1637-1648,和，PRADIPTA B C, SHANTH1.1solat1n of novel b1active reg1ns from bovine Achilles tendon collagenhaving ang1tensin 1-converting enzyme-1nhibitory properties[J].ProcessB1chemistry, 2012, 4712)的經典方法并稍作修改:在37°C，pH8.3的條件下，ACE催化血管緊張素I的模擬物HHL產生馬尿酸。產物馬尿酸在波長228nm處具有特殊吸收峰。根據馬尿酸標準曲線上相對應的值即可進行活性計算。
[0097](4)膠原蛋白對ACE抑制效果的比較:將以上三種膠原蛋白用磷酸緩沖液溶解配成 lmg/mL 的標準母液。經過稀釋之后配成 0.01mg/mL、0.05mg/mL、0.lmg/mL、0.5mg/mL、
1.0mg/mL系列濃度后。分別與提取的適量ACE預先混合，將混合物在37°C水浴鍋中先溫浴 1min。實驗具體操作步驟根據 PRADIPTA 等方法(PRADIPTA B C, SHANTH1.1solat1n ofnovel b1active reg1ns from bovine Achilles tendon collagen having ang1tensin1-converting enzyme-1nhibitory properties[J].Process B1chemistry, 2012, 4712),并稍作修改:測量的總體積為350yL，含lOOmmol/L pH 8.3磷酸緩沖液、0.3mol/L NaCl、5mmol/L HHL。在37°C恒溫水浴3min，然后加入溫浴1min后的混合物啟動反應，恒溫保持4011^11后，加入25(^1^ lmol/L HCl中止反應。再加入1.5mL乙酸乙酯，用力混合15s，3500轉/min離心15min后取出1.0mL酯層轉入另一試管中，在120°C的烘箱經30min蒸干,再將它重新溶于1.0mL的磷酸緩沖液中，在228nm處測定吸光值。抑制率的計算方法根據TSAI等的方法(TSAI J S，CHEN J L, BONNIE S P.ACE-1nhibitory peptides identified fromthe muscle protein hydrolysate of hard clam(Meretrix lusoria).Process B1chemistry.，2008，43(7):743-747)。如下式計算:①抑制率) = (ODa-ODb)/(ODa-ODc)，(注:ODa為不存在抑制劑時的光密度；0DBS存在抑制劑與酶時的光密度；0D。為抑制劑與酶都不存在時的光密度。對ACE抑制率達到50%時的抑制劑濃度即為半抑制濃度，記為IC5(I。IC50值越小，說明抑制劑活性越大。
[0098](5)測定結果:不同產地的膠原蛋白對ACE的抑制率結果見表1，根據表1結果繪制的不同來源不同濃度的膠原蛋白ACE活性的抑制曲線見圖3。從圖3中可以看出當濃度在0.01mg/mL~0.05mg/mL時，三種不同來源的膠原蛋白對ACE活性的抑制率幾乎處在同一水平上，并沒有表現出明顯的活性抑制作用。在加入的濃度到達0.lmg/mL時，自制膠原蛋白對ACE的抑制率就達到了將近30%，而另外兩種商品化13父原蛋白的抑制率僅為20%左右。繼續升高濃度，自制膠原蛋白依然在ACE抑制作用上表現出很好的效果，在加入濃度為0.5mg/mL時,就已經達到50%以上的ACE抑制率。而在同樣的濃度下,另外兩種商品化膠原蛋白的ACE抑制率相比其有一定的差距。而當濃度升至lmg/mL時，這種差距進一步被拉大。根據表1中IC5tl結果繪制的不同膠原蛋白對ACE抑制效果柱狀圖見圖4。IC50是一種公認檢驗ACE抑制劑效果的指標，IC5tl的值越低說明抑制ACE作用的效果越好。如下表I或圖3所示，通過計算得出自制豬、牛和羊心管膠原蛋白，德國膠原蛋白以及法國膠原蛋白的 IC5tl 分別為 0.46mg/mL、0.49mg/mL、0.38mg/mL, 0.68mg/mL 和 0.97mg/mL。根據結果繪制不同膠原蛋白IC5tl的比較柱狀圖見圖4，通過分析后發現，自制的膠原蛋白對ACE的抑制效果極顯著地超越于另外兩種商品化的膠原蛋白(P〈0.01)，其抑制能力甚至接近法國產膠原蛋白的2倍之多。
[0099] 表1不同膠原蛋白對ACE的抑制效果比較
[0100]

【權利要求】
1.一種從動物心管制備膠原蛋白肽的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟:動物心管的低溫保持，切碎，浸泡漂洗，磨漿，酸抽提，離心，酶解，納濾脫鹽，除菌冷凍干燥步驟。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述動物心管的低溫保持包括將新鮮動物心管進行快速低溫冷凍處理步驟。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述酸抽提為醋酸抽提。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述納濾脫鹽包括將酶解膠原蛋白肽粗品用0.2微米的濾膜過濾，過濾液用截留分子量為400-500道爾頓的納濾膜脫鹽3-5次，再濃縮到含蛋白肽4-10%的步驟。
5.如上述權利要求所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: 1)取冷凍動物心管，切碎后加入5-10倍體積的清水，用清水反復沖洗3次，去除血水，骨泥磨磨漿后，加入20-40倍體積的2-10%醋酸，攪拌浸提6-12小時，用14000轉/離心，收集沉淀得膠原蛋白粗品； 2)膠原蛋白粗品加3-5倍重量體積去離子水，攪拌混勻，調PH7-9.0，加入膠原蛋白粗品重量的0.1%胰蛋白酶，42°C保溫水解6-8小時，得酶解膠原蛋白肽粗品； 3)酶解膠原蛋白肽粗品用0.2微米的濾膜過濾，過濾液用截留分子量在400-500道爾頓的納濾膜納濾脫鹽3-5次，再濃縮到含蛋白肽4-10%， 上述的脫鹽、濃縮步驟如下:先納濾膜濃縮，然后加水稀釋到原體積時再進行納濾膜濃縮以達到脫鹽的目的，反復3-5次； 4)除菌過濾，冷凍干燥制備高活性的動物心管膠原蛋白肽凍干粉。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步驟: 1)取冷凍動物心管,切碎,加5倍體積的清水，浸泡過夜，用清水反復沖洗3次，去除血水，骨泥磨磨漿后，加入20倍體積3%醋酸，攪拌浸提8小時，用14000轉/分離心，收集沉淀得膠原蛋白粗品； 2)沉淀加3-5倍重量體積去離子水，攪拌混勻，調pH8.6，加入膠原蛋白粗品重量的0.1%胰蛋白酶，42°C保溫水解8小時，得酶解膠原蛋白肽粗品； 3)酶解膠原蛋白肽粗品用0.2微米的濾膜過濾，過濾液用截留分子量在400-500道爾頓的納濾膜納濾脫鹽3次，再濃縮到含蛋白肽4-10%， 上述的脫鹽、濃縮步驟如下:先納濾膜濃縮，然后加水稀釋到原體積時再進行納濾膜濃縮以達到脫鹽的目的，反復3次； 4)除菌過濾，冷凍干燥制備高活性的動物心管膠原蛋白肽凍干粉。
7.如權利要求1-6所述方法制備的膠原蛋白肽，其特征在于，當膠原蛋白肽濃度為0.5mmol/mL時，其具有超過40%以上的ACE抑制率；且當膠原蛋白肽濃度為1mmoI/mL時，其具有超過60%以上的ACE抑制率；和低于0.55mg/mL IC500
8.如權利要求7所述的膠原蛋白肽,其特征在于，當膠原蛋白肽濃度為0.5mmol/mL時，其具有大于45%的ACE抑制率；且當膠原蛋白肽濃度為1mmol/mL時，其具有大于65%的ACE抑制率；和低于0.50mg/mL IC500
9.如權利要求7或8所述的膠原蛋白肽的用途，所述用途包括將所述的膠原蛋白肽用于預防和/或防治人類老化的藥物、食品、保健品或化妝品中的應用。
10.如權利要求9所述的用途，其特征在于:所述藥物、食品、保健品或化妝品為口服制劑、外用制劑、吸入制 劑、經鼻制劑、經直腸制劑、經皮制劑或注射制劑。
【文檔編號】C07K14/78GK104164468SQ201410398332
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年8月13日 優先權日:2014年4月24日
【發明者】劉爽, 鄧小霞, 龐玉, 王子華 申請人:吉林省金梓源生物科技有限公司