一種氨基酸和多肽等水溶性物質的純化方法
【專利摘要】本發明公開了一種氨基酸和多肽等水溶性物質的純化方法，屬于蛋白質與多肽純化【技術領域】。該方法為：將氨基酸或/和多肽的粗品水溶液的pH調整為適合值，使與目標氨基酸或/和多肽在后續有機溶劑沉淀法中溶解性相似的雜質轉化為溶解性不同的產物，再加酸調整pH值后使用有機溶劑沉淀法得到精品，從而達到除鹽與純化產品的目的。本發明意在提供一種簡單高效的分離純化方法，解決了在合成過程中銨鹽等較難除去的鹽對產品純度和物性方面的影響，同時節約成本，溶劑處理量小，對環境污染小，工藝操作簡單，生產成本低，特別適合工業化大生產。
【專利說明】一種氨基酸和多肽等水溶性物質的純化方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于蛋白質與多肽純化【技術領域】，具體涉及一種氨基酸和多肽等水溶性物質的純化方法，特別涉及一種用于處理含和/或氯鹽的氨基酸或/和多肽粗品的純化方法。
【背景技術】
[0002]近幾年隨著氨基酸及多肽藥物市場的飛速發展，其前景展現出令人可喜的景象，其制備和生產技術也越來越多，多肽分離純化技術的研究和開發也日益受到專家的關注，一些新工藝和新技術被應用，促使生物活性多肽的研究和開發成為科技界的一個熱點。但是一般多肽合成的工藝得到的多肽初品濃度較低，雜質復雜，尤其是雜質的理化性質和目標多肽十分相似，因而分離純化比較困難。以往的分離純化技術，如通用的溶劑沉淀，重結晶，萃取等技術操作過程復雜，時間長，易失活，消耗原料多，回收率低，盡管國內外在多肽的研究上花費了大量的時間和精力，發表了幾百篇研究論文，多肽的分離純化技術仍然進展緩慢。
[0003]中國專利CN201080040450.3公開了一種基于快速蛋白質液相層析(FPLC)純化多肽的方法，包括以下步驟:a)將包含所述多肽的溶液施加至包含固定相的層析裝置中；b)通過使所述溶液經過所述層析裝置的固定相，將所述多肽與包含于所述液體溶液中的其它分子分離；c)以流經物或洗出液從層析裝置中回收多肽；和(1)通過過濾的方式對包含回收的多肽的流經物或洗出液進行滅菌。但此方法溶劑處理量大，產品收率低，過程麻煩，工業化生產還有待進一步改進。
[0004]中國專利CN201210214758.6公開了一種純化多肽的方法，其特征在于，將制得的多肽粗品預處理后，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，以濃度為0.1~0.8%的高氯酸和濃度為0.01~0.08%硫酸水溶液制得混合溶液，用堿調節所述混合溶液的pH值為2.0~
3.5后作為A相，以乙腈為B相，按照B相為10%~40%的梯度進行洗脫，制得第二粗品；取所述第二粗品，采用離子交換法轉鹽，即得目標產物。但此方法也面臨著洗脫溶劑量大，一次處理樣品量小，廢水處理量大，成本高，工業化生產還有待進一步改進。
[0005]凝膠層析是根據分子大小分離蛋白混合物的方法之一，混合物隨流動相流經裝有凝膠固定相的層析柱時，由于混合物中各物質的分子大小和形狀不同，因此，在洗柱過程中，分子量最大的物質不能進入凝膠網孔而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外；分子量最小的物質因能進入凝膠網孔而受阻滯，流速緩慢，使其最后流出柱外，整個過程和過濾類似，故又名凝膠過濾。選擇不同的分子量凝膠可用于脫鹽置換緩沖液以及利用分子量差異等除去熱源。但需用大量的蒸鎦水或其它稀溶液洗柱，溶劑量大，廢水處理量大，工業化應用有待結合自身情況綜合考慮。
[0006] 置換層析是一種非線性的層析技術，與傳統的洗脫層析技術相比有明顯的優點，即高上樣量高產率高分辨率，被分離樣品在分離過程中有濃縮效應，這一技術已經越來越引起人們的關注，利用一種非線性層析技術，借助小分子高效置換劑交換色譜柱上的樣品，從而達到分離的目的它具有分離組分含量較少成分的特性，研究表明，置換劑的相對分子質量越低，越容易于與固定相結合，因此在分離相對分子質量較小的多肽時，需要更小的置換劑才能將其置換純化出來，處理量也隨之增大。隨著生物技術工業的發展，生物物質層析分離的工業化應用就顯得越來越重要了。以往的制備性分離技術往往是將實驗室里的線性分析型分離技術簡單地進行擴大，但上樣量的限制，低濃度洗脫和層析過程的稀釋效應，使得樣品組分的回收率很低，經濟效益較低。
[0007]離子交換色譜(IEXC)技術主要是根據物質的帶電性質和帶電數量不同而進行層析的一種分離技術.由于這種技術分辨率高，分離量大，耐酸堿性好，易于操作，已經成為分離多肽的一種重要方法.但是pH、溫度、分子量大小、離子強度以及鹽濃度對分離多肽的影響較大，且對于不同的多肽提取，所選用的離子交換劑不同，環境條件及洗脫條件也不相同，一旦條件選取不當，分離純化效果將會很差.因此，對于不同多肽，其最適離子交換劑以及對應最適條件不斷提高提取效果依然是科研工作者的重要研究課題。
[0008]與離子色譜以及中低壓色譜相比較，反相高效液相色譜(R P-HPLC)是以液體為流動相的色譜技術，具有高靈敏度高壓高速，柱子可以反復使用，分離效果較好，比較穩定，回收方便，特別適用于分子量低于5000，尤其是10000以下的多肽的分離純化.但由于肽在溶液中的擴散系數小，黏度比較大，介質的PH值，外界溫度，有機溶劑性質等會導致有些結構改變，產生變性。這種分離純化技術也存在其它劣勢，如:對柱子要求嚴格，需要摸索最佳條件等。其它色譜方法，如疏水作用色譜(HIC)，金屬離子親和層析(IMAC)也有一些類似問題。
[0009]超濾，由于膜分離純化技術可保護多肽的活性，操作簡單，不需要大型儀器，得到廣泛應用。超濾就是利用膜的選擇性，施加一定的壓力，在膜的兩側形成壓力差作為驅動力，通過溶液中各種組分透過膜遷移速率的不同而實現物質的分離。這種技術成本低廉，不需增加任何化學試劑，實驗條件溫和，與蒸發冷凍干燥相比沒有相的變化，且不引起溫度PH的變化，因而可以防止生物大分子的變性失活和自溶。但是在超濾過程中，由于濾膜表面易被吸附的物質堵塞，導致超濾效率降低，截留物質的分子量也越來越小因此，在超濾過程中，選擇合適的的膜材料尤為重要。類似方法，納濾是一種介于反滲透和超濾之間的分離方法，納濾膜的孔徑范圍在幾個納米左右，比超濾的效果更好，可以完全除去細菌膠體鐵銹重金屬等，不存在污染問題，某些多肽具有熱敏性，受熱易被破環，并且采用傳統的提純方法不易除去低分子量的鹽分，從而影響產品的純度，但采用納濾分離是很好的選擇，不僅能降低能耗，還可以將其中的有機污染物和鹽分除去，大大提高產品的品質。
[0010]有機溶劑沉淀法是最傳統方法之一，其原理是:與水互溶的有機溶劑(如甲醇、乙醇)能使一些氨基酸及多肽在水中的溶解度顯著降低；而且在一定溫度、pH值和離子強度下，有機溶劑的濃度不同，物質析出順序也不一樣，因此，控制有機溶劑的濃度可以分離純化氨基酸及多肽。對于一些和脂質結合比較牢固或分子中極性側鏈較多、不溶于水的氨基酸及多肽，可以用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑沉淀，它們有一定的親水性和較強的親脂性，是理想的提取液。冷乙醇分離法提取免疫球蛋白最早由Cohn于1949年提出，用于制備丙種球蛋白。冷乙醇法也是目前WHO規程和中國生物制品規程推薦的方法，不僅分辨率高，提純效果好，可同時分離多種血漿成分，而且有抑菌、清除和滅病毒的作用。但此方法在處理某些產物時，一次不能很好地達到純化效果，需多次醇析，損失大。本發明介紹了一個簡單，實用的脫鹽與純化的方法，特別適合產業化應用。
【發明內容】
[0011]在實際工作中，有時很難用單一方法實現氨基酸及多肽等水溶性化合物的分離純化，一種理想的分離提純方法往往要求最終目的產品的純度和回收率越高越好，但實際上兩者難以兼顧。因此，考慮分離提純的條件和方法時，不得不在兩者之間作適當的平衡。因此當需要提純氨基酸及多肽等產物時，要根據其物理、化學性質等特性，選擇一套適當的提純程序來獲取高純度的目標產物的同時，盡量得到多的產品。本發明意在提供一種簡單高效的分離純化方法，解決了在合成過程中銨鹽等較難除去的鹽對產品純度和物性方面的影響，同時節約成本，溶劑處理量小，對環境污染小，工藝操作簡單，生產成本低，特別適合工業化大生產。
[0012]本發明的主要思路是將含有銨鹽等的水溶性氨基酸或/和多肽粗品溶于水、或含水的混合溶劑、或直接使用溶液，加特定的堿溶液，如水合肼、氫氧化鋰等，調節pH值到7-14，優選為7-11，最優為9-10，將銨鹽等雜質轉換成與目標氨基酸或/和多肽(在有機溶劑沉淀法中析出)物性不同，可以溶于甲醇、乙醇、丙酮等適合工業化生產的有機溶劑的肼鹽或鋰鹽，轉化后的溶液可以減壓濃縮干或部分濃縮，加水或不加水溶解，再加酸，如鹽酸等調PH值到任何所需要的值(適合氨基酸或/和多肽沉淀的環境且保證肼鹽或鋰鹽溶于后續處理的有機溶劑)，然后在合適溫度下滴加有機溶劑析出目標產物，目標產物也可以繼續加入有機溶劑在特定溫度下洗滌或重結晶，直到得到合格產品，產品進一步冷卻，抽濾和烘干等得到高純度的精品。
[0013]具體地，該純化方法為:使用具有調節pH作用的轉化劑將氨基酸或/和多肽的粗品水溶液的PH調整為適合值(一般為7-14，優選為7-11，最優為9-10)，使與目標氨基酸或/和多肽在后續有機溶劑沉淀法中溶解性相似的雜質轉化為溶解性不同的產物，加酸調整PH值后采用有機溶劑沉淀法得到精品。其中，在上述方法中需要去除的雜質包括銨鹽和/或氯鹽等，它們可能在氨解時產生，也可以因為酸堿中和而引入；轉化后的溶解性不同的產物可以溶于后續有機溶劑沉淀法中使用的有機溶劑，包括肼鹽或鋰鹽等，使用的轉化劑可以包括水合肼或氫氧化鋰等。
[0014]本發明實施例中的氨基酸包括天然與非天然氨基酸、如D或L氨基酸(該方法不影響目標物的構型)、以及它們的DL混合物；多肽包括含兩個或多個氨基酸的直鏈肽或環肽，以及它們的衍生物，如酯或酰胺等。具體例子包括甘氨酸、精氨酸，水溶性的甘谷二肽、甘酪二肽、丙谷二肽等。
[0015]其中，加酸的作用為:加酸將待采用有機溶劑沉淀法的處理液調節為適合氨基酸或/和多肽沉淀的環境，具體在目標氨基酸或/和多肽等電點附近，并兼顧肼鹽或鋰鹽在有機溶劑中的溶解性。
[0016]更具體地，該純化方法為:使用水合肼或氫氧化鋰等特定堿，如80%水合肼，將氨基酸或/和多肽的粗品水溶液的PH調整為9-10，將銨鹽和/或氯鹽等雜質轉化為可溶于后續有機沉淀法中使用的有機溶劑的肼鹽或鋰鹽；濃縮(如旋干)，用酸(如鹽酸溶液)將濃縮液調節為適合目標氨基酸或/和多肽沉淀的環境，如等電點附近，采用有機溶劑沉淀法處理得到目標物沉淀，抽濾，用乙醇回流煮，抽濾，干燥得到精品。
[0017]經檢測，使用該方法，收率超過80%，對其中含有的銨鹽、氯鹽的分離效果顯著，且不需要引進額外的溶劑，過程簡單，處理成本低，尤其適合工業化生產。
【具體實施方式】
[0018]實施例一，甘氨酸粗品的精制及除鹽:
1、取10g甘氨酸粗品(由氯代乙酸氨解制得)于茄形瓶中，加50 ml水攪拌溶解，用水合肼調PH=1-1I。
[0019]2、旋干后加50ml水溶解，用HCl調pH=7左右。攪拌0.5h后，室溫滴加300ml無水乙醇,析出產品。
[0020]3、將析出的產品抽濾，得濕品約100g，加入800 ml酒精在60°C下回流煮0.5h。
[0021]4、抽濾，烘干得精品88g，收率88%，氯離子含量低于0.1%。
實施例二，甘谷二肽粗品的精制及除鹽
1、取10g甘谷二肽粗品(氯含量7.2%)于茄形瓶中，加60 ml水攪拌溶解，用80%水合肼調 pH=10-lI。
[0022]2、旋干后加60ml水溶解，用HCl調pH=6。攪拌0.5h后，室溫滴加360ml無水乙醇，析出產品。
[0023]3、將析出的產品抽濾，得濕品約100g，加入800 ml酒精在60°C下回流煮0.5h。
[0024]4、抽濾，烘干得精品85g，收率85%,氯離子含量低于0.2%。
[0025]實施例三，甘谷二肽粗品的精制及除鹽
1、取10g甘谷二肽粗品(氯含量7.2%)于茄形瓶中，加60 ml水攪拌溶解，用氫氧化鋰溶液調PH=1-1I。
[0026]2、旋干后加60ml水溶解，用HCl調pH=6。攪拌0.5h后，室溫滴加360ml無水乙醇，析出產品。
[0027]3、將析出的產品抽濾，得濕品約100g，加入800 ml酒精在60°C下回流煮0.5h。
[0028]4、抽濾，烘干得精品86g，收率86%，氯離子含量低于0.2%。
[0029]實施例四，丙谷二肽粗品的精制及除鹽
1、取10g丙谷二肽粗品(氯含量7.2%)于茄形瓶中，加50 ml水攪拌溶解，用80%水合肼水溶液調pH=9-10。
[0030]2、旋干后加50ml水溶解，用HCl調pH = 7。攪拌0.5h后，室溫滴加300ml無水乙醇，析出產品。
[0031]3、將析出的產品抽濾，得濕品約100g，加入800 ml酒精在60°C下回流煮0.5h。
[0032]4、抽濾，烘干得精品82g，收率82%，氯離子含量低于0.2%。
[0033] 以上所述僅為本發明的較佳實施例，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種氨基酸和多肽等水溶性物質的純化方法，其特征在于，將氨基酸或/和多肽的粗品水溶液的pH調整為適合值，使與目標氨基酸或/和多肽在后續有機溶劑沉淀法中溶解性相似的雜質轉化為溶解性不同的產物，再加酸調整PH值后采用有機溶劑沉淀法得到精品O
2.根據權利要求1所述的純化方法，其特征在于:使用轉化劑將氨基酸或/和多肽的粗品水溶液的pH調整為適合值，使與目標氨基酸或/和多肽在后續有機溶劑沉淀法中溶解性相似的雜質轉化為溶解性不同的肼鹽或鋰鹽，再加酸調整PH值后采用有機溶劑沉淀法得到精品，所述適合值為7-14，所述轉化劑包括水合肼或氫氧化鋰。
3.根據權利要求1或2所述的純化方法，其特征在于:所述與目標氨基酸或/和多肽在后續有機溶劑沉淀法中溶解性相似的雜質包括銨鹽和/或氯鹽。
4.根據權利要求1或2所述的純化方法，其特征在于:所述氨基酸包括水溶性天然與非天然氨基酸。
5.根據權利要求1或2所述的純化方法，其特征在于:所述多肽包括水溶性的甘谷二肽、甘酪二肽、丙谷二肽。
6.根據權利要求1或2所述的純化方法，其特征在于:所述適合值為7-11。
7.根據權利要求1或2所述的純化方法，其特征在于:所述適合值為9-10。
8.根據權利要求1或2所述的純化方法，其特征在于:使用水合肼或氫氧化鋰將氨基酸或/和多肽的粗品水溶液的PH調整為9-10，將銨鹽和/或氯鹽轉化為可溶于后續有機沉淀法中使用的有機溶劑的 肼鹽或鋰鹽；濃縮，用酸將濃縮液調節為適合目標氨基酸或/和多肽沉淀的環境，再采用有機溶劑沉淀法得到精品。
【文檔編號】C07C229/08GK104163767SQ201410357778
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年7月25日 優先權日:2014年7月25日
【發明者】李健雄, 鮑汝楊 申請人:湖北泓肽生物科技有限公司