一種重組戊型肝炎疫苗p179抗原的純化方法

一種重組戊型肝炎疫苗p179抗原的純化方法
【專利摘要】本發明提供一種重組戊型肝炎疫苗P179抗原的純化方法，采用目的蛋白再經陰離子交換層析（陰離子層析介質）和疏水層析（疏水層析介質）相結合對重組戊型肝炎疫苗P179抗原進行純化，能夠在保護疫苗的免疫原性的基礎上有效去除雜質，提高該疫苗的產量和質量穩定性。同時縮短了重組戊型肝炎疫苗P179抗原的純化時間，降低了生產成本。
【專利說明】一種重組戊型肝炎疫苗P179抗原的純化方法

【技術領域】
[0001]本發明提供一種重組戊型肝炎疫苗P179抗原的純化方法，具體涉及酸沉、陰離子交換層析與疏水層析的應用，屬于疫苗制備生產【技術領域】。

【背景技術】
[0002]戍型肝炎是一種由戍型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)引起的經腸道傳播的急性肝炎，發病癥狀重，病死率高，常引起萬人發病的大流行，對孕婦和胎兒的危害尤為嚴重，妊娠晚期病死率可高達15%-25%，且極易發生早產、流產和死胎。目前，對戊型肝炎尚無有效的治療方法，預防是控制戊型肝炎病毒傳播的重要措施，戊肝疫苗被世界衛生組織推薦為21世紀最優先發展的疫苗之一。
[0003]目前我國最流行的IV型HEV外殼蛋白P179片段(參見表1)作為疫苗的候選抗原，在大腸桿菌中進行了高效可溶性表達。采用純化后的P179抗原配制成本重組戊型肝炎疫苗。
[0004]現有的大腸桿菌表達可溶性蛋白的純化工藝流程一般是將發酵菌體通過過濾或離心沉淀澄清后，經裂解劑裂解至一定程度，再加入一定硫酸銨至一定飽和度，放置一定時間，然后經疏水層析柱和分子篩層析柱進一步提純抗原活性組分；或者是將發酵菌體通過過濾或離心沉淀澄清后，經裂解劑裂解至一定程度，再加入一定硫酸銨至一定飽和度，放置一定時間，然后經陰離子交換柱層析和分子篩層析柱進一步提純抗原活性組分。其中，獲得可溶性蛋白質的工藝比較通用，而對溶性蛋白質進一步提純的方法卻有多種方法:
方法一:大腸桿菌表達可溶性蛋白經硫酸銨沉淀，采用一種或多種疏水層析柱一次或多次層析進行提純；
方法二:大腸桿菌表達可溶性蛋白經硫酸銨沉淀，采用一種或多種分子篩層析柱一次或多次層析進行提純；
方法三；大腸桿菌表達可溶性蛋白經硫酸銨沉淀，經分子篩層析后，再采用離子交換柱層析提純抗原。
[0005]由此可見，傳統的生產通常的大腸桿菌表達可溶性蛋白采用硫酸銨沉淀進行純化，由于純化步驟中大量多次使用硫酸銨沉淀，工藝參數不夠穩定，一旦出現問題往往比較嚴重，問題查找的追溯型比較困難，且不易保持無菌，在設備與人力的投入上都大大超過了使用層析技術所需的投入，不適宜目前工業化大生產。采用硫酸銨沉淀提純抗原的純化效果上也無法有效地獲得較高的抗原回收率。單步分子篩是指得到大腸桿菌表達可溶性蛋白后，通過一種或多種分子篩填料進行層析提純。這種方法僅僅通過分子量大小不同的單一原理來分離雜質，只能分開不用分子量的物質，而對于相近分子量的物質就算經過更長的層析路徑也無法分離，對于與抗原分子量相近的雜質，特別是DNA無法做到有效的去除。同時由于分子篩層析工藝批量較小，從而導致疫苗產品批間差異大，產品質量穩定性不夠好。


【發明內容】

[0006]本發明的目的在提供一種重組戊型肝炎疫苗P179抗原的純化方法，操作規程簡單、方便，并利于規模化生產。
[0007]本發明提供的一種重組戊型肝炎疫苗P179抗原的純化方法，其工藝步驟為:
1、將表達重組戊肝疫苗P179抗原的大腸桿菌HEV 179/BL21(DE3)破碎，調節破菌液pH至酸性，使雜蛋白沉淀，離心去除雜蛋白及細胞碎片，得粗提液。
[0008]2、粗提液經陰離子交換層析或疏水層析初步純化P179抗原，含目的蛋白的洗脫液經處理后再用疏水層析或陰離子交換層析純化，獲得精純的P179抗原。
[0009]3、含精純P179抗原的層析洗脫液經過濾除菌后即為重組戊型肝炎疫苗原液。
[0010]在所述步驟(2)和(3)過程中，檢測重組戊型肝炎疫苗原液的蛋白濃度在2~5mg/ml之間，目的蛋白回收率40%~60%，原液外源性DNA殘留量應≤Ing/劑，宿主菌蛋白殘留量小于總蛋白質含量的0.10%，疫苗原液稀釋10倍后的細菌內毒含量應< 5EU/ml。經蛋白電泳檢測純度> 95%，經高效液相檢測純度> 95%。
[0011]所述的一種重組戊型肝炎疫苗P179抗原的純化方法，其中，步驟(1)中所述表達重組戊肝疫苗抗原P179的工程菌破菌方法為超聲波法或勻質法。超聲儀超聲破碎I~3次或勻質機勻質(600bar~800bar)破碎I~3次,破菌液滴加0.lmol/L~lmol/L鹽酸調至破菌液的pH為2.0~5.5之間，使雜蛋白沉淀。將沉淀物放入離心機，離心力6000rpm~12000rpm,離心時間40分鐘，得上清液。用0.22 μ m濾膜過濾除菌，將目的蛋白與雜蛋白及細胞碎片初步分離，得粗提液。
[0012]所述的一種重組戊型肝炎疫苗P179抗原的純化方法，其中，步驟(2)中所述采用的層析純化次序可以是先進行陰離子交換層析再進行疏水層析，也可以是先進行疏水層析再進行陰離子交換層析。
[0013]所述的一種重組戊型肝炎疫苗的純化方法，其中，步驟(2)中所述采用的陰離子交換層析介質是陰離子層析介質，疏水層析介質是疏水層析介質。
[0014]所述的一種重組戊型肝炎疫苗P179抗原的純化方法，其中，步驟(2)中所述采用的陰離子交換層析介質，層析柱柱高10~100厘米，粗提液的體積為陰離子層析柱體積的
1.5~3倍，用三羥甲基氨基甲烷-鹽酸pH在7.0~9.0之間平衡，用氯化鈉溶液濃度在0.05~0.12mol/L之間洗脫雜蛋白，用氯化鈉溶液濃度在0.13~0.20mol/L之間洗脫目的蛋白，洗脫溶劑的流速為50~150ml/min。紫外檢測器波長280nm處檢測。
[0015]所述的一種重組戊型肝炎疫苗P179抗原的純化方法，其中，步驟(2)中所述采用的疏水層析介質，層析柱柱高10~100厘米，粗提液的體積為疏水層析柱體積的1.5~3倍。疏水層析平衡液pH在4.0~6.0之間，洗脫雜蛋白的氯化鈉濃度在0.30~3.0Omol/L之間，洗脫目的蛋白的氯化鈉濃度在0.10~0.20mol/L之間。洗脫溶劑的流速為50~150ml/min。紫外檢測器波長280nm處檢測。
[0016]所述的一種重組戊型肝炎疫苗P179抗原的純化方法，其中，步驟(3)中所述重組戊型肝炎疫苗原液的蛋白濃度在2~5mg/ml之間，目的蛋白回收率40%~60%，原液外源性DNA殘留量應< Ing/劑，宿主菌蛋白殘留量應小于總蛋白質含量的0.10%，疫苗原液稀釋10倍后的細菌內毒含量應小于5EU/ml。經蛋白電泳檢測純度應> 95%，經高效液相檢測純度應> 95%。本發明提供一種重組戊型肝炎疫苗P179抗原的純化方法，該純化方法將陰離子交換層析和疏水層析相結合對重組戊型肝炎疫苗抗原P179進行純化，重組戊型肝炎疫苗原液的蛋白濃度在2~5mg/ml之間，目的蛋白回收率40%~60%，原液外源性DNA殘留量應< Ing/劑，宿主菌蛋白殘留量應小于總蛋白質含量的0.10%，疫苗原液稀釋10倍后的細菌內毒含量小于5EU/ml。該純化工藝穩定、簡單、易于產業化。本發明由于加入酸沉步驟，可大大減輕離子交換層析和疏水層析的壓力，有效保障了抗原的免疫原性，只需要很低含量的抗原即可達到足夠的效力。經過兩步層析，均可有效去除濃縮液中雜質，特別是DNA、殘留的宿主蛋白等物質。
[0017]本發明根據目的蛋白與雜蛋白及細胞碎片各種分子在不同酸性作用下穩定性不同的特點，使欲分離的目的蛋白以病毒樣顆粒(VLP)形式存在存在于溶液中，而且保持其活性，其他成分(雜蛋白及細胞碎片)由于酸性條件因素影響下，可引起雜蛋白質失去表面的水化層和雙電層破壞其穩定的親水狀態，達到其等電點，失去表面的電荷在水溶液中溶解度最小而沉淀。尤其當溶液的酸性條件影響下發生劇烈變化時，引起雜蛋白的變性而沉淀，變性作用破壞雜蛋白氫鍵構象穩定，影響雜蛋白氨基酸殘基側鏈之間的相互作用，從而達到純化有效成分的目的。離心分層使目的蛋白純度在上清液中達到80%以上。
[0018]本發明的積極效果在于:
(I)重組戊型肝炎疫苗抗原P179的工程菌所表達的重組戊肝抗原P179為胞內可溶性表達，且表達產物以病毒樣顆粒(VLP)形式存在，由于加入破菌、酸沉、離心這三個步驟，可大大減輕離子交換層析和疏水層析的壓力，有效保障了抗原的免疫原性，只需要很低含量的抗原即可達到足夠的效力。
[0019](2)純化方法將陰離子交換層析和疏水層析相結合對重組戊型肝炎疫苗抗原P179進行純化，經過兩步層析，均可有效去除濃縮液中雜質，特別是DNA、殘留的宿主蛋白等物質，獲得精純的目的P1 79抗原，蛋白濃度在2~5mg/ml之間，目的蛋白回收率40%~60%，，原液外源性DNA殘留量應小于Ing/劑，宿主菌蛋白殘留量應小于總蛋白質含量的0.10%，疫苗原液稀釋10倍后的細菌內毒含量應小于5EU/ml。經蛋白電泳檢測純度應> 95%，經高效液相檢測純度應> 95%。該純化工藝穩定、簡單、易于產業化。
[0020](3)含精純P179抗原的層析洗脫液經過濾除菌后即為重組戊型肝炎疫苗原液。
[0021]采用目的蛋白再經陰離子交換層析(陰離子層析介質)和疏水層析(疏水層析介質)相結合對重組戊型肝炎疫苗P179抗原進行純化，能夠在保護疫苗的免疫原性的基礎上有效去除雜質，提高該疫苗的產量和質量穩定性。同時縮短了重組戊型肝炎疫苗P179抗原的純化時間，降低了生產成本。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為本發明重組戊型肝炎疫苗P179抗原的工藝流程圖；
圖2為本發明重組戊型肝炎疫苗P179抗原的電鏡(實施例1)觀察圖；
圖3為本發明重組戊型肝炎疫苗P179抗原的電鏡(實施例2)觀察圖；
圖4為本發明重組戊型肝炎疫苗原液的高效液相(實施例1)圖；
圖5為本發明重組戊型肝炎疫苗原液的高效液相(實施例2)圖；
圖6為本發明重組戊型肝炎疫苗P179抗原的勻質、酸沉蛋白電泳(實施例1)圖；
圖7為本發明重組戊型肝炎疫苗P179抗原的勻質、酸沉蛋白電泳(實施例2)圖；
圖8為本發明重組戊型肝炎疫苗P179抗原的蛋白電泳圖分子量為19KD ；圖9為本發明重組戊型肝炎疫苗P179抗原基礎結構為二聚體分子量為38KD ；
圖10為本發明重組戊型肝炎疫苗P179抗原的紫外分光光度掃描分析圖；
圖11為本發明提供一種重組戊型肝炎疫苗原液的殘余DNA檢測圖(實施例1)顯示了疫苗原液殘留DNA檢定結果為每劑< lng。

【具體實施方式】
[0023]本發明提供一種重組戊型肝炎疫苗P179抗原的純化方法，為使發明的目的、技術方案及效果更加清楚、明確，舉實例對本發明進一步詳細說明(參照附圖1)。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0024]實施例1
重組戊型肝炎疫苗抗原的純化方法
重組戊型肝炎疫苗抗原P179的工程菌主要在大腸桿菌中表達，經過勻質破碎洗滌后，可溶性表達P179抗原釋放在溶解于溶液中，然后經過調節pH至酸性，上清液中P179抗原純度達65%以上(參照附圖6 )。
[0025]按照之前描述的方法，選用勻質機將表達重組戊肝疫苗抗原P179的工程菌勻質(800bar)破碎2次，將勻質破碎后液體倒入燒杯中，攪拌的同時滴加lmol/L鹽酸調至pH為
4.0。使雜蛋白質沉淀，酸用0.22 μ m濾膜過濾除菌，將目的蛋白與雜蛋白及細胞碎片初步分離，得粗提液。
[0026]重組戊型肝炎疫苗抗原的粗提液，采用的層析純化次序可以是先經陰離子交換層析初步純化目的蛋白P179，含目的蛋白的洗脫液經處理后再用疏水層析純化，獲得精純的目的蛋白P179。
[0027]陰離子交換層析介質(DEAE-Sepharose FF)分離,層析柱柱高20厘米,粗提液的體積為陰離子層析柱體積的3倍。平衡陰離子交換層析的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液，pH為8.0，用0.07mol/L氯化鈉溶液洗脫雜蛋白，采用0.20mol/L氯化鈉溶液洗脫目的蛋白。洗脫溶劑的流速為80ml/min。紫外檢測器波長280nm處檢測。
[0028]收集陰離子交換柱層析后樣品，以50/min的流速泵入疏水柱層析介質(Phenyl-Sepharose 6FF)層析分離,層析柱柱高15厘米,在上樣之前用3倍柱體積的平衡液溶劑平衡層析柱。平衡液PH在4.0之間，洗脫雜蛋白的氯化鈉濃度為3.0mol/L，洗脫目的蛋白的氯化鈉濃度為0.15mol/L。紫外檢測器波長280nm處檢測，獲得精純的目的蛋白P179，經蛋白電泳檢測純度達98.8% (參見附圖8和附圖9)，經高效液相檢測純度達99.9%(參見附圖4)。目的蛋白回收率在40%~60%，，原液外源性DNA殘留量小于Ing/劑(見附圖11)，宿主菌蛋白殘留量小于總蛋白質含量的0.10%，疫苗原液稀釋10倍后的細菌內毒含量小于5EU/ml ο
[0029]含精純P179抗原的層析洗脫液經過濾除菌后即為重組戊型肝炎疫苗原液。
[0030]實施例2
重組戊型肝炎疫苗抗原的純化方法
重組戊型肝炎疫苗抗原P179的工程菌主要在大腸桿菌中表達，經過超聲儀超聲破碎洗滌后，可溶性表達P179抗原釋放在溶解于溶液中，然后經過調節pH至酸性，上清液中P179抗原純度達80%以上(參照附圖7)。
[0031]按照之前描述的方法，選用勻質機將表達重組戊肝疫苗抗原P179的工程菌超聲儀超聲破碎I~3次,將勻質破碎后液體倒入燒杯中,攪拌的同時滴加lmol/L鹽酸調至pH為4.0。使雜蛋白質沉淀，酸沉后于SOOOrpm離心40分鐘，上清液目的蛋白含量的純度占上清總蛋白的65%以上。取上清用0.22 μ m濾膜過濾除菌，將目的蛋白與雜蛋白及細胞碎片初步分離，得粗提液。
[0032]重組戊型肝炎疫苗抗原的粗提液，采用的層析純化次序可以是先經疏水層析純化，初步純化目的蛋白P179，含目的蛋白的洗脫液經處理后再用陰離子交換層析純化，獲得精純的目的蛋白P179。
[0033]疏水柱層析介質(Phenyl-Sepharose 6FF)層析分離,層析柱柱高15厘米,在上樣之前用3倍柱體積的平衡液溶劑平衡層析柱。平衡液pH在4.0之間，洗脫雜蛋白的氯化鈉濃度為3.0mol/L,洗脫目的蛋白的氯化鈉濃度為0.15mol/Lo紫外檢測器波長280nm處檢測。收集疏水柱層析后樣品。以80/min的流速泵入陰離子交換層析介質(DEAE-SepharoseFF)分離，層析柱柱高20厘米，粗提液的體積為陰離子層析柱體積的3倍。平衡陰離子交換層析的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液，pH為8.0，用0.07mol/L氯化鈉溶液洗脫雜蛋白，采用0.20mol/L氯化鈉溶液洗脫目的蛋白。紫外檢測器波長280nm處檢測。獲得精純的目的蛋白P179。經蛋白電泳檢測純度達98.8% (參見附圖8和附圖9)，經高效液相檢測純度達99.9% (參見附圖5)。目的蛋白回收率在50%左右，原液外源性DNA殘留量小于Ing/劑(見附圖 11，圖中，P:陽性對照 Dl:64.5ng D2:6.45ng D3:0.645ng D4:0.0645ng N:陰性對照al (實例一樣品)、bl (實施二樣品)為疫苗原液)，宿主菌蛋白殘留量小于總蛋白質含量的0.10%，疫苗原液稀釋10倍后的細菌內毒含量小于5EU/ml。
[0034]含精純P179抗原的層析洗脫液經過濾除菌后即為重組戊型肝炎疫苗原液。
[0035]試驗例:
重組戊型肝炎疫苗抗原的分析方法
根據實施例1和實施例2描述重組戊型肝炎疫苗抗原的純化流程，將重組戊型肝炎工程菌，破碎后酸沉，并在陰離子層析柱和疏水柱層析中純化，然后超濾除菌過濾，從而得到重組戊型肝炎疫苗抗原。使用透射電鏡觀察、高效液相色譜分析、SDS-聚丙烯胺凝膠電泳檢測分析、紫外分光光度掃描分析等方法對重組戊型肝炎疫苗抗原進行研究。
[0036]透射電鏡觀察:
使用的儀器為日本日立公司生產的H600-A透射電鏡，放大倍數為30，000倍。將獲得的重組戊型肝炎疫苗抗原用2%磷鎢酸pH6.4負染，固定于銅網上，進行觀察。電鏡效果見圖2，其中可見大部分呈現直徑為20nm左右、大小均勻的病毒樣顆粒。
[0037]高效液相色譜分析:
使用的儀器為日本島津液相CBM-lOAvp Plus分析型高效液相色譜層析系統以及TSKGel PW5000xl 7.8 X 300mm柱子進行分子篩層析分析。以2倍柱體積的生理鹽水預先平衡層析柱，直至280nm處的吸收值無明顯變化。將檢測器的吸收值歸零，然后由自動進樣器進樣并進行分析。結果如圖3所示，按面積歸一化法計算，戊肝疫苗抗原主峰面積應不低于總面積的95.0%。
[0038]聚丙烯胺凝膠電泳檢測分析:使用的儀器為美國伯樂公司電泳儀，SDS-聚丙烯胺凝膠電泳分子篩作用能夠對蛋白質的組分進行分離，樣品與載樣液混合后不進行煮沸處理，分離膠膠濃度為15%，考馬斯亮蘭R250染色。蛋白主區帶為19kD、38kD (二聚體蛋白)，經掃描，結果如圖5所示，單體及二聚體總量應在95.0%以上，二聚體應占總蛋白的80%~100%。
[0039]紫外分光光度掃描分析
使用的儀器為日本島津公司生產紫外可見分光光度計UV-2550，用生理鹽水將供試品稀釋至500 μ g/ml左右，在光路Icm,波長190nm~400nm下進行掃描，結果如圖10所不,最大吸收峰波長應為278 nm±3nm。
[0040]戊型肝炎疫苗原液檢定結果如下:

【權利要求】
1.一種重組戊型肝炎疫苗P179抗原的純化方法，包括以下步驟: 1)將表達重組戊肝疫苗P179抗原的大腸桿菌HEV179/BL21 (DE3)破碎，調節破菌液PH至酸性，使雜蛋白沉淀，離心去除雜蛋白及細胞碎片，得粗提液； 2)粗提液經陰離子交換層析或疏水層析初步純化P179抗原，含目的蛋白的洗脫液經處理后再用疏水層析或陰離子交換層析純化，獲得精純的P179抗原； 3)含精純P179抗原的層析洗脫液經過濾除菌后即為重組戊型肝炎疫苗原液。
2.權利要求1所述的一種重組戊型肝炎疫苗P179抗原的純化方法，其特征在于: 步驟1)中所述表達重組戊肝疫苗抗原P179的工程菌破菌方法為超聲波法或勻質法，破菌液滴加0.lmol/L~lmol/L鹽酸調至破菌液的pH在2.0~5.5之間，使雜蛋白沉淀；離心，過濾除菌，得粗提液。
3.權利要求1所述的一種重組戊型肝炎疫苗P179抗原的純化方法，其特征在于: 步驟(2)中所述采用的層析純化次序可以是先進行陰離子交換層析再進行疏水層析，也可以是先進行疏水層析再進行陰離子交換層析。
4.權利要求1所述的一種重組戊型肝炎疫苗P179抗原的純化方法，其特征在于: 步驟(2)中所述采用的陰離子交換層析介質，層析柱柱高10~100厘米，粗提液的體積為陰離子層析柱體積的1.5~3倍，用三羥甲基氨基甲烷-鹽酸pH在7.0~9.0之間平衡，用氯化鈉溶液濃度在0.05~0.12mol/L之間洗脫雜蛋白，用氯化鈉溶液濃度在0.13~0.20mol/L之間洗脫目的蛋白，洗脫溶劑的流速為50~150ml/min ;紫外檢測器波長280nm處檢測。
5.權利要求1所述的一種重組戊型肝炎疫苗P179抗原的純化方法，其特征在于: 步驟(2)中所述采用的疏水層析介質，層析柱柱高10~100厘米，粗提液的體積為疏水層析柱體積的1.5~3倍；疏水層析平衡液pH在4.0~6.0之間，洗脫雜蛋白的氯化鈉濃度在0.30~3.00mol/L之間，洗脫目的蛋白的氯化鈉濃度在0.10~0.20mol/L之間；洗脫溶劑的流速為50~150ml/min ;紫外檢測器波長280nm處檢測。
【文檔編號】C07K1/18GK104130317SQ201410354886
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月24日 優先權日:2014年7月24日
【發明者】陳子楊, 遲祥, 賈媛, 李錚, 張健鋒, 時成波, 遲春萍 申請人:長春生物制品研究所有限責任公司