一種基因治療用載體蛋白及其制備方法和用途

一種基因治療用載體蛋白及其制備方法和用途
【專利摘要】本發明提供一種基因治療用載體蛋白及其制備方法和用途，提供了人源H467-103作為DNA結合結構域，用于構建基因載體的用途，同時本載體利用人源組蛋白H4的部分DNA結合域（H467-103）作為攜帶治療基因的核心區域，同時融合與特定細胞結合的識別區域、多種促進細胞轉染的功能區域、核定位信號區等功能片段，產生一種新型的用于基因治療的載體蛋白。這種載體蛋白能有效的攜帶治療基因入腫瘤細胞，對正常細胞無毒性作用。與常規病毒與化學合成類載體相比，具有制備工藝簡單、安全、無毒、易清除、靶向性好等優勢。
【專利說明】一種基因治療用載體蛋白及其制備方法和用途
【技術領域】
[0001]本發明提供一種基因治療用載體蛋白及其制備方法，是可以與治療性基因表達質粒結合的蛋白，作為基因治療用載體蛋白。同時還公開了該蛋白的制備方法，并應用此蛋白對多種腫瘤細胞進行效應研究，屬于生物工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]目前用于基因治療載體主要有兩大類，即病毒衍生載體和非病毒載體。
[0003]病毒載體轉染效率高，但是存在整合入人體基因組的危險及機體免疫反應，廣泛應用于臨床還需解決這些危險問題。
[0004]非病毒載體主要包括化學聚合物衍生載體和蛋白/多肽類衍生載體。目前化學聚合物衍生載體轉染效率與病毒載體相當，但是免疫原性強，機體不易降解與清除，靶向性差，限制其應用。
[0005]蛋白/多肽類載體可分成天然蛋白類與合成蛋白類。合成蛋白類載體包括多聚精氨酸、多聚組氨酸等，依靠其所帶正電荷與DNA結合，攜帶其進入細胞。這類蛋白/多肽類載體因其具有較強的免疫原性，不適于應用于臨床。另外一類源于生物體表達的天然蛋白，他們通過特定空間結構與DNA結合，攜帶這些DNA進入細胞后，載體蛋白隨著蛋白質體內降解途徑被機體降解為氨基酸后，為機體所再利用，既無細胞毒性。如果這些蛋白為生物體內高度保守的蛋白，則免疫原性低，不引起免疫反應，也不易在血漿中降解，有利于維持血漿中的濃度。再者，蛋白/多肽類載體易與功能性多肽融合而獲得諸如靶向性等優點。蛋白/多肽類載體的低毒性、低免疫原性、易獲得靶向性、開發及制備成本低等優點成為基因載體的研究熱點。
[0006]目前天然的蛋白/多肽類載體多采用組蛋白H1、組蛋白H2A、魚精蛋白等高度保守的DNA結合蛋白為核心構件，融合促進轉染的功能結構域，制備成融合蛋白。但是這些蛋白與合成蛋白類載體相比體積較大，又具有多個非DNA結合結構域，諸如與蛋白分子結合的結構域，使得載體蛋白之間易于相互結合，形成聚合物，是導致轉染效率不高的原因之一。再者，蛋白/多肽類載體的跨膜及運輸作用機制，尚不十分明確，需要制備多種不同種類的蛋白/多肽類載體，并加以研究，獲得大量實驗數據，進而闡明載體蛋白轉運的作用機制。況且蛋白分子中的非DNA結合結構域的存在，在細胞內表現出與多種蛋白/因子結合，使得機制研究變得更加復雜，將單一 DNA結合結構域與多種轉染相關功能結構域融合，是研究蛋白/多肽類載體特定結構域功能的有效途徑，為蛋白轉染機制的研究提供豐富的材料與數據。
[0007]本 發明采用人源組蛋白H4中一個DNA結合結構域(Μ67,)作為蛋白/多肽載體的核心結構，該結構在生物體中保守性極高，從植物中獲取基因，略加改造就獲得與人完全一致的蛋白序列。該結構維持其天然的構象，既可以有效結合DNA，免疫原性又低，是個理想的用于基因載體構建的元件。將Η467_1(ι3與多種已知的促進轉染的功能結構域相融合，即可構建出低毒的基因轉運蛋白。[0008]
【發明內容】
:
本發明提供一種人源H467_1(i3多肽，作為DNA結合結構域用于構建基因轉運載體。
[0009]本發明進一步提供H467_1(i3多肽基因的獲取方法。
[0010]本發明進一步提供載體蛋白，具有與質粒DNA結合，具有將質粒運輸到腫瘤細胞的特征。
[0011]本發明進一步提供了上述載體蛋全長基因的獲取方法。
[0012]本發明進一步提供了載體蛋白的原核表達質粒構建、載體蛋白原核表達、純化及功能驗證等詳細方法。
[0013]本發明提供的人源H467_1(i3多肽作為DNA結合結構域用于構建基因轉運載體的用途，
其中，所述的人源Η467_1(ι3多肽的氨基酸序列如下:SEQ n0.1。
[0014]本發明所述的人源Hf3多肽的基因的獲取方法，包括以下步驟: 1)提取全小麥基因組；
2)以小麥全基因組為模板設計引物，在引物中替換個別核苷酸，使得所擴增的產物所編碼的氨基酸序列與人源氨基酸序列一致；并在上游引物上添加酶切位點，用于原核表達載體構建；
所用引物為:
上游引物:
ATGGCTAGCA TCCGCGACGC CGTCACCTAC ACCGAGCACG CCAAGCGCAA GACCGTC ；
下游引物:
ACGTGAATTCTTAGCCGCCGAAGCCGTAG ；
以小麥全基因組為模板，上述兩條引物，PCR法擴增得到人源Η467_1(ι3多肽基因序列，圖1所示，P為Η467_1(ι3多肽基因的PCR產物2%瓊脂糖凝膠電泳結果，經測序完全正確。
[0015]本發明提供的一種載體蛋白，其特征在于:
是以Μ67,3多肽為DNA結合結構域、融合多種功能多肽的基因載體蛋白，具有與質粒DNA結合并且將質粒運輸到腫瘤細胞的特征；
載體蛋白序列由以下幾部分構成:Ν端起始為HiS6-H467_1(l3-NLS-Tat-AHNP ；
其氨基酸序列如下:
SEQ n0.2o
[0016]本發明所述載體蛋白的基因獲取方法，具體步驟如下:
I)引物設計
上游引物:
ATGGCTAGCA TCCGCGACGC CGTCACCTAC ACCGAGCACG CCAAGCGCAA GACCGTC ；
下游引物為兩條長引物 下游引物1:
TTCCTGCCAT ATGAACCGCC TCCACCTGGT TTCTTCTTTG GCTGGGGGCC GCCGAAGCCG ；
下游引物2:
CCGCAAGCTT TTAGTACCAC GGCGAGACGG TGAGTCTTCG TCGCTGTCTC CGCTTCTTCCTGCCATATGA ACC ；2)以人源H467_1(i3多肽PCR擴增產物為模板(圖2第四泳道所示)，用上游引物和第一條下游引物組合，PCR擴增出部分載體蛋白基因序列(圖2第一泳道所示)；
再以該PCR產物為模板，通過上游引物和第二條下游引物擴增出載體蛋白基因全長(圖2第二泳道所示)，圖2為2%瓊脂糖凝膠電泳結果所示本發明載體蛋白基因全長的獲取過程。
[0017]本發明所述載體蛋白的制備方法，包括以下步驟:
O原核表達質粒構建；
載體蛋白全長基因PCR擴增產物雙酶切(Me I和Λ?/^ΙΙΙ)后，凝膠回收雙酶切產物； pET28a表達質粒雙酶切(Me I和Hind III)后，凝膠回收大片段；
將上述兩個回收片段連接，獲得將載體蛋白全長基因構建入pET28a表達載體中的重組質粒，既載體蛋白原核表達質粒；
2)載體蛋白原核表達
將步驟I)的載體蛋白原核表達質粒導入到BL21 (DE3)原核表達菌體系，37°C終濃度
0.1 mM IPTG誘導表達載體蛋白；
3)載體蛋白原核表達產物純化
變性條件下，Ni親 和層析一步法純化步驟2)獲得的載體蛋白，透析后分裝凍存即得。
[0018]4)載體蛋白功能驗證
4.1)應用凝膠阻滯實驗證實載體蛋白可有效結合質粒DNA。
[0019]圖4所示,該基因載體蛋白所帶正電荷(pH 7.4條件下)與DNA所帶負電荷(核苷酸個數)數量之比(P/N)為2:1時，DNA被完全阻滯。并應用動態光散射技術，對本發明的載體蛋白與DNA結合復合物的極性進行檢測，圖4所示，在P/N為2:1時，復合物所帶凈電荷由負電荷轉至正電荷。
[0020]4.2)本發明所述載體蛋白轉染功能檢測。
[0021]在P/N比為2:1條件下，將載體蛋白與質粒DNA室溫條件下結合成穩定復合物，轉染腫瘤細胞。成功的將綠色熒光(EGFP )質粒和熒光素酶(Luc )質粒轉染入MCF-7和SK-0V-3腫瘤細胞系中。
[0022]圖6為本發明所述載體蛋白轉染表達綠色熒光蛋白基因質粒；
圖7為本發明所述載體蛋白轉染表達螢光素酶基因質粒。
[0023]以上實驗證實本發明載體可有效將外源質粒DNA轉染至腫瘤細胞，并表達質粒所攜帶的特定蛋白。
[0024]本發明的積極效果在于:提供了人源Η467_1(ι3作為DNA結合結構域，用于構建基因載體的用途，同時本載體利用人源組蛋白H4的部分DNA結合域(H467_1ci3)作為攜帶治療基因的核心區域，同時融合與特定細胞結合的識別區域、多種促進細胞轉染的功能區域、核定位信號區等功能片段，產生一種新型的用于基因治療的載體蛋白。這種載體蛋白能有效的攜帶治療基因入腫瘤細胞，對正常細胞無毒性作用。與常規病毒與化學合成類載體相比，具有制備工藝簡單、安全、無毒、易清除、靶向性好等優勢。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為本發明所述組蛋白H4 DNA結合結構域Μ67,3多肽基因片段的調取圖(2%瓊脂糖凝膠電泳);
圖2為本發明所述載體蛋白全長基因的獲取圖(2%瓊脂糖凝膠電泳)；
圖3為本發明所述載體蛋白的Ni親和層析純化結果圖(15% SDS-PAGE電泳圖)；
圖4為本發明所述載體蛋白與DNA的結合能力實驗結果圖(凝膠阻滯實驗)；
圖5為本發明所述載體蛋白與DNA在P/N=2時所形成復合物的表面電荷性質圖(動態光散射)；
圖6為本發明所述載體蛋白轉染表達綠色熒光蛋白基因質粒結果圖(熒光顯微鏡)；
圖7為本發明所述載體蛋白轉染表達螢光素酶基因質粒結果統計圖(分光光度法)。
【具體實施方式】
[0026]通過以下實施例進一步舉例描述本發明，并不以任何方式限制本發明。下面用實施例來進一步說明本發明的實質性內容,但本發明的內容并不局限于此。
[0027]實施例1
人源Η467_1(ι3多肽基因的獲取。
[0028]具體過程如下: I)檢索人組蛋白H467_1CI3。(來源于NCBI核酸數據庫)，并加以對比
1.1)人源 H4 (6H°3)多肽基因序列(來源 GenBank: BC075806.1)
I ATCCGTGACG CGGTGACTTA CACGGAGCAC GCCAAGCGCA AGACCGTCAC GGCCATGGAT
61 GTGGTGTACG CGCTGAAACG CCAGGGTCGC ACCCTTTATG GTTTCGGCGG TTGA ；
小麥H4 (67,3)多肽基因序列(來源GenBank: X00043.1)
I ATCCGCGATG CCGTCACCTA CACCGAGCAC GCCCGCCGCA AGACCGTCAC CGCCATGGAC
61 GTCGTCTACG CGCTCAAGCG CCAGGGCCGC ACCCTCTACG GCTTCGGCGG CTAA ；
1.2)組蛋白Hf3蛋白序列 人:IRDAVTYTEH AKRKTVTAMD VVYALKRQGR TLYGFGG*
小麥:IRDAVTYTEH ARRKTVTAMD VVYALKRQGR TLYGFGG*
組蛋白H467_1(i3為螺旋-轉角-螺旋結構，是H4組蛋白中與DNA結合的結構域，各種生物的保守性較高，該結構可以結合在DNA大溝，并壓縮DNA，因其分子小、并保留結合DNA的天然構象、物種間保守性強等特點，可以作為基因載體中理想的DNA結合工具。
[0029]2)引物設計；
以小麥全基因組為模板，設計引物，在引物中替換個別核苷酸，使得所擴增的產物所編碼的氨基酸序列與人源一致。并在上游引物上添加酶切位點GVAe I)，用于原核表達載體構建。
[0030]所用引物為:
上游引物:
ATGGCTAGCA TCCGCGACGC CGTCACCTAC ACCGAGCACG CCAAGCGCAA GACCGTC ；
下游引物:
ACGTGAATTCTTAGCCGCCGAAGCCGTAG ；
3)PCR法獲得人源H467_1(i3多肽基因序列。
[0031]以小麥全基因組為模板，應用上述兩條引物，擴增得到人源H467_1(i3多肽基因序列。[0032]PCR反應條件:
U96°C 3 min
2,95°C I min ； 58°C 30 s ； 72°C I min ； 30 cycles
3、72°C 10 min
4>4°C store
圖1為本發明所述組蛋白H4 DNA結合結構域Μ67—103多肽基因片段的調取圖。P為Μ67,3多肽基因的PCR產物凝膠電泳結果，經測序完全正確。
[0033]實施例2
載體蛋白基因獲取方法:
是以人源Μ67,3多肽為DNA結合結構域、融合多種功能多肽的基因載體蛋白，具有與質粒DNA結合并且將質粒運輸到腫瘤細胞的特征。本發明載體蛋白序列由以下幾部分構成=N端起始為His6 (純化用標簽)-H467^103 (DNA結合核心區)-NLS (PQPKKKP，核定位信號)-Tat (YGRKKRRQRRR，跨膜結構域)-AHNP (LTVSPWY，擬 Her2 受體結合肽)。
[0034]具體步驟如下:
1)引物設計。
[0035]設計兩條下游引物，第一條下游引物包括H467_1(i3多肽C端部分基因序列、NLS基因序列及部分Tat基因序 列。第二條引物包括Tat基因序列、AHNP基因序列及酶切位點(MindIII)。
[0036]上游引物:
ATGGCTAGCA TCCGCGACGC CGTCACCTAC ACCGAGCACG CCAAGCGCAA GACCGTC ；
下游引物為兩條長引物 下游引物 I (Primer down I):
TTCCTGCCAT ATGAACCGCC TCCACCTGGT TTCTTCTTTG GCTGGGGGCC GCCGAAGCCG ；
下游引物 2 (Primer down 2):
CCGCAAGCTT TTAGTACCAC GGCGAGACGG TGAGTCTTCG TCGCTGTCTC CGCTTCTTCCTGCCATATGA ACC ；
2)以人源H467_1(i3多肽PCR擴增產物為模板，引物延長PCR法擴增出載體蛋白全長基因序列。
[0037]圖2 2%瓊脂糖凝膠電泳結果所示本發明載體蛋白基因全長的獲取過程。
[0038]2.1)以H467_1(i3多肽的PCR產物(圖2第四泳道所示)為模板為，用上游引物和第一條下游引物組合，PCR擴增出部分載體蛋白基因序列(圖2第一泳道所示)。
[0039]2.2)再以該PCR產物為模板，通過上游引物和第二條下游引物擴增出載體蛋白基因全長(圖2第二泳道所示)。經測序完全正確。
[0040]PCR反應條件:
1、96。。3min
2、95°CI min ； 58°C 30 s ； 72°C I min ； 30 cycles
3、72°C10 min
4>4°C store。
[0041]實施例3載體蛋白原核表達質粒構建、載體蛋白原核表達、純化及功能鑒定等詳細方法。
[0042]I)原核表達質粒構建。
[0043]1.1)載體蛋白全長基因PCR擴增產物雙酶切(Me I取Hind III)后，凝膠回收雙酶切產物。
[0044]1.2) pET28a表達質粒雙酶切iNhe I和Hind III)后，凝膠回收大片段。
[0045]1.3)將上述兩個回收片段連接，轉入T0P10感受態細菌中，挑單菌落，提取質粒(ET28a-H467^103-NLS-Tat-AHNP)，獲得將載體蛋白全長基因構建入pET28a表達載體中(插入到船6> I和III之間)的重組質粒，既載體蛋白原核表達質粒。經測序完全正確。
[0046]2)載體蛋白原核表達
2.l)pET28a-H46H°3-NLS-Tat-AHNP 質粒轉入 B121(DE3)感受態細菌中。
[0047]2.2)挑單菌落至5 ml LB培養基中，37°C震蕩培養過夜，1/1000接菌至400 ml LB培養基中，37°C震蕩培養至OD6tltl至0.8-1.0，加入終濃度為0.1 mM IPTG,繼續37°C震蕩培養4_5小時。
[0048]3)載體蛋白原核表達產物純化
3.1)4°C 4000g離心收集菌體，PBS(pH 7.4)洗滌一次，按照每克濕菌加入50 ml BufferA (500 mM NaCl, 50 mM Tris, 10 mM imidazol, 10% glycerol; (pH 7.4))重懸菌體。
[0049]3.2)超聲裂解細菌(工作時間3秒，間歇時間5秒，強度450W，總工作時長10分鐘)。12，000Xg，4°C離心30分鐘，留取沉淀。
[0050]3.3)用與 Buffer A 相同體積的 Buffer B (500 mM NaCl, 6 M urea, 50 mM Tris, 10mM imidazol, 10% glycerol; (pH 7.4))重懸沉淀，室溫不停搖動 2-4 小時。12, 000 Xg, 4。。離心2小時，收集上清，0.45 μ m濾膜過濾，備用(圖3泳道3)。
[0051]3.4)Ni層析介質空跑。Buffer A平衡后Ni層析柱,用5倍體積的Buffer B平衡，2 倍體積的 Buffer C (500 mM NaCl, 6 M urea, 50 mM Tris, 500 mM imidazol, 10% glycerol;(pH 7.4))過柱，10倍體積的ddH20洗滌后，5倍體積的Buffer B再平衡。
[0052]3.5)將步驟3所制備的樣品，與步驟4的Ni介質(0.5ml Ni介質/g濕菌)混合，4°C翻轉搖床上，輕搖2小時。
[0053]3.6)將步驟5的樣品連同Ni介質一同裝柱。200 ml Buffer B充分洗滌。
[0054]3.7)洗脫。10 ml 洗脫液(500 mM NaCl, 6 M urea, 50 mM Tris, 100 mM imidazol, 10%glycerol; (pH 7.4))(用Buffer B與Buffer C適當比例混合而成)洗脫，流速控制在8-10滴/分鐘。收集OD28tl峰值處流出液，約6-8 ml。
[0055]3.8)透析與儲存。
[0056]3.8.1 )透析:一個小時之內，至少四次更換透析液(500 mM NaCl, 50 mM Tris, 10%glycerol; (pH 7.4)),用以除去殘存的咪唑和尿素。
[0057]3.8.2 )透析后的樣品，12，000Xg，4°C離心5分鐘，分裝上清，迅速置于液氮中過夜。_80°C冰箱保存，備用(圖3泳道I)。
[0058]3.9)鑒定。SDS-PAGE及Westen Blot檢測純化的樣品。變性條件下，Ni親和層析一步法純化融合蛋白，透析后分裝凍存。圖3 —泳道為純化后的載體蛋白。
[0059]4 )載體蛋白功能驗證 具體過程如下:4.1)載體蛋白與DNA結合能力檢測與蛋白質/質粒復合物帶電性質檢測將載體蛋白與質粒DNA按照不同P/N (蛋白所攜帶正電荷數量(P)與DNA所帶負電荷數量(N)數量之比)混合，室溫結合8小時，凝膠阻滯實驗鑒定載體蛋白結合DNA的能力，動態光散射測定蛋白質/質粒復合物帶電性質。如圖4所示，當N/P=2時，DNA在瓊脂糖凝膠中不能泳動，而被完全阻滯在加樣孔中。如圖5所示，當N/P=2時，蛋白質/質粒復合物呈現正電荷性質。
[0060]4.2)本發明所述載體蛋白轉染功能檢測 轉染方法:
4.2.1)根據凝膠阻滯實驗結果，采用質粒剛被完全阻滯時所需的蛋白量(P/N=2)。質粒量按照2微克/孔(24孔板)與相對應的蛋白量結合，混勻，4°C放置大于8小時。
[0061]4.2.2)轉染前3小時鋪細胞，轉染前更換為無血清培養基。
[0062]4.2.3)每孔用無血清培養基補充體積至200 μ I/孔，加入至質粒/蛋白復合體體系中，然后加入終濃度為10 mM CaCl2,充分混勻。
[0063]4.2.4)棄除培養板上原有培養基，將復合物滴加至培養板中。 [0064]4.2.5)轉染后4小時，更換為含2 mM CaCl2的完全培養基。
[0065]4.2.6)轉染后24小時，更換完全培養基(無CaCl2)。
[0066]4.2.7)轉染后48-60小時，熒光顯微鏡觀察表達綠色熒光細胞/測量熒光素酶活性。
[0067]結果說明構建的載體蛋白可成功將外源性核酸轉入目標細胞中，并且成功表達出目標蛋白(綠色熒光蛋白及螢光素酶)，含可見綠色熒光的細胞占總細胞數約15%,螢光素酶表達量約為脂質體轉染效率的10%。
[0068]圖6為本發明所述載體蛋白轉染表達綠色熒光蛋白基因質粒圖(熒光顯微鏡)；
圖7為本發明所述載體蛋白轉染表達螢光素酶基因質粒結果統計圖(分光光度計)。
[0069]以上實驗證實本發明載體可有效將外源質粒DNA轉染至腫瘤細胞，并表達質粒所攜帶的特定蛋白。
【權利要求】
1.人源H46h°3多肽作為DNA結合結構域用于構建基因轉運載體的用途，所述的人源H46HO3多肽的氨基酸序列如下:SEQ n0.1。
2.根據權利要求1所述的人源Μ67,3多肽的基因的獲取方法，包括以下步驟: 1)提取全小麥基因組； 2)以小麥全基因組為模板設計引物，在引物中替換個別核苷酸，使得所擴增的產物所編碼的氨基酸序列與人源氨基酸序列一致；并在上游引物上添加酶切位點，用于原核表達載體構建； 所用引物為: 上游引物:
ATGGCTAGCA TCCGCGACGC CGTCACCTAC ACCGAGCACG CCAAGCGCAA GACCGTC ； 下游引物:
ACGTGAATTCTTAGCCGCCGAAGCCGTAG ； 以小麥全基因組為模板，上述兩條引物，PCR法擴增得到人源Η467_1(ι3多肽基因序列。
3.一種載體蛋白，其特征在于: 是以人源Μ67,3多肽 為DNA結合結構域、融合多種功能多肽的基因載體蛋白，具有與質粒DNA結合并且將質粒運輸到腫瘤細胞的特征； 載體蛋白序列由以下幾部分構成:Ν端起始為HiS6-H467_1(l3-NLS-Tat-AHNP ； 其氨基酸序列如下:
SEQ n0.2o
4.權利要求3所述載體蛋白的基因獲取方法，具體步驟如下: 1)引物設計 上游引物:
ATGGCTAGCA TCCGCGACGC CGTCACCTAC ACCGAGCACG CCAAGCGCAA GACCGTC ； 下游引物為兩條長引物 下游引物1:
TTCCTGCCAT ATGAACCGCC TCCACCTGGT TTCTTCTTTG GCTGGGGGCC GCCGAAGCCG ； 下游引物2: CCGCAAGCTT TTAGTACCAC GGCGAGACGG TGAGTCTTCG TCGCTGTCTC CGCTTCTTCCTGCCATATGA ACC ； 2)以人源H467_1(i3多肽PCR擴增產物為模板，用上游引物和第一條下游引物組合，PCR擴增出部分載體蛋白基因序列； 再以該PCR產物為模板，通過上游引物和第二條下游引物擴增出載體蛋白基因全長。
5.權利要求3所述載體蛋白的制備方法，包括以下步驟: O原核表達質粒構建； 載體蛋白全長基因PCR擴增產物雙酶切(Me I和Λ?/^ΙΙΙ)后，凝膠回收雙酶切產物； pET28a表達質粒雙酶切(Me I和Hind III)后，凝膠回收大片段； 將上述兩個回收片段連接，獲得將載體蛋白全長基因構建入pET28a表達載體中的重組質粒，既載體蛋白原核表達質粒； 2)載體蛋白原核表達將步驟I)的載體蛋白原核表達質粒導入到BL21 (DE3)原核表達菌體系，37°C終濃度0.1 mM IPTG誘導表達載體蛋白； 3)載體蛋白原核表達產物純化 變性條件下，Ni親和層析一步法純化步驟2)獲得的載體蛋白，透析后分裝凍存即得。
6.權利要求3所述的載體蛋白在作為腫瘤基因治療用載體的用途。
【文檔編號】C07K14/00GK104031134SQ201410272758
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月19日 優先權日:2014年6月19日
【發明者】艾永興, 吳山力, 鄧晨, 鄭海南, 趙程程, 于佩峰, 王夢云, 郝林琳, 于浩, 張玉靜 申請人:吉林大學