豬CD40Ldimer融合蛋白及其編碼基因的制作方法
【專利摘要】本發明屬于生物技術制藥工業中基因工程領域，具體是一種豬CD40Ldimer融合蛋白及其編碼基因，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。本發明所述的所述的豬CD40Ldimer融合蛋白利用Pichiapastoris高效的外源蛋白表達、易于大規模培養、培養基價格低廉、易純化并能夠對表達的蛋白進行轉錄后修飾等優點，以Pichiapastoris表達重組可溶性豬CD40Ldimer，為其作為疫苗佐劑的研究提供充足的原材料。
【專利說明】豬CD40Ldimer融合蛋白及其編碼基因
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術制藥工業中基因工程領域，具體是一種豬⑶40Ldimer融合蛋白及其編碼基因。
【背景技術】
[0002]⑶40配體(⑶40LXD154)，屬于TNF家族的一員，是一個II型跨膜糖蛋白，主要表達在活化的⑶4+ T細胞、一小部分⑶8+ T細胞和血小板上。⑶40L可能以異源二聚體復合物的形式表達，并被金屬蛋白酶從跨膜蛋白上分離下來。可溶性CD40L像細胞因子一樣與⑶40結合后傳遞生物信號。⑶40和⑶40L的相互作用可以激活抗原呈遞細胞和T細胞，轉化抗體亞型，并促進生發中心形成。此外，它們能夠活化細胞毒性T細胞，降低免疫抑制，調節腫瘤細胞的生存并將與腫瘤相關性抗原呈遞給免疫系統。
[0003]⑶40-⑶40L的相互作用在獲得性免疫中的重要作用表明，⑶40L有可能作為一個潛在的疫苗佐劑來提高疫苗的免疫效果。將CD40L作為疫苗佐劑應考慮其生產成本和生產水平，但從組織提取和化學合成的方法獲得CD40L的成本高且產量低，不能滿足其作為疫苗佐劑的需求。
【發明內容】
[0004]本發明為了解決從組織提取和化學合成的方法獲得CD40L的成本高且產量低，不能滿足其作為疫苗佐劑的需求的問題，提供了一種豬CD40L融合蛋白及其編碼基因。 [0005]本發明是通過以下技術方案實現的:豬⑶40Ldimer融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2 所示。
[0006]所述豬⑶40Ldimer融合蛋白的編碼基因，其堿基序列如SEQ ID NO:1所示。
[0007]本發明所述融合蛋白的編碼基因是由豬⑶40Ldimer的cDNA序列、6個組氨酸cDNA序列和限制性內切酶Xho I和EcoR I位點的cDNA序列以及符合酵母表達偏好性的基因序列組成。
[0008]本發明所述豬⑶40Ldimer融合蛋白的制備過程如下:
表達載體的構建:人工合成CD40Ldimer的基因序列作為第一部分，以合成的⑶40Ldimer基因序列為PCR模板，通過PCR擴增獲得第二部分基因序列，將第一步和第二部分連接后再與表達質粒pwPICZalpha進行連接，通過雙酶切檢測和篩選含有⑶40Ldimer基因序列的表達載體；
酵母表達系統的構建:使用限制性內切酶線性化重組表達質粒，通過電轉化的方法，將⑶40Ldimer的基因序列整合到酵母的基因組中。將轉化后的菌體懸液涂布于含有Zeocin的YPD平板上，30°C培養3-4d ;挑取6個單菌落，進行小劑量的誘導表達，SDS-PAGE檢測表達上清確認陽性克隆；
重組蛋白的純化和結合能力的檢測:挑選陽性克隆菌落進行大劑量的誘導表達，表達上清采用ProteinPure N1-NTA樹脂和強陽離子交換樹脂純化，通過SDS-PAGE和Westernblot檢測純化的重組蛋白。利用BCA測定濃度，計算⑶40Ldimer的產量；通過ELISA檢測重組⑶40Ldimer的結合能力，證明其構象的正確性。
[0009]本發明所述的所述的豬OMOLdimer融合蛋白利用Pichiapastoris高效的外源蛋白表達、易于大規模培養、培養基價格低廉、易純化并能夠對表達的蛋白進行轉錄后修飾等優點，以Pichiapastoris表達重組可溶性豬⑶40Ldimer,為其作為疫苗佐劑的研究提供充足的原材料。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010]圖1 是 ProteinPure N1-NTA 樹脂純化 CD40Ldimer 的 SDS-PAGE 電泳圖。
[0011]圖2是強陽離子交換樹脂純化⑶40Ldimer的SDS-PAGE電泳圖。
[0012]圖3 是重組 CD40Ldimer 的 Western blot 分析圖。
[0013]圖4是重組CD40Ldimer的ELISA分析圖。
【具體實施方式】
[0014]1、所用試劑及其配制
(I)LB (Luria-Bertani)液體培養基:取蛋白胨10g、酵母粉5g、NaC15g，溶解于800mLddH20 中，IOM NaOH 調節 pH 至 7.0，定容至 1000mL,高壓滅菌(121°C，1.034 X IO5Pa) 20min,4°C保存。
[0015](2) LB (Luria-Bertani)固體培養基:按每 10OOmT, ddH20 加 15g 瓊脂粉，向 LB 液體培養基中加入瓊脂粉，高壓滅菌，4°C保存。
[0016](3)貯備液:
IOXYNB (13.4%，含硫酸銨而不含氨基酸):將34g YNB和100g硫酸銨熱溶于1000mLddH20中，過濾除菌，4°C保存。
[0017]500 X生物素(0.02%):20mg生物素溶于IOOmL ddH20中，過濾除菌，4°C保存。
[0018]IOX葡萄糖(20%):200g葡萄糖溶于1000mL ddH20中，高壓滅菌,4°C保存。
[0019]IOX甲醇(5%甲醇):5mL甲醇與95mL ddH20混勻，過濾除菌，4°C保存。
[0020]IOX甘油(10%甘油MOOmL甘油與900mL ddH20混勻，過濾除菌或高壓滅菌，室溫保存。
[0021]IM 磷酸氫二鉀緩沖液，pH=7.0:132mL IM K2HPO4 與 868mL IM KH2PO4 混合，高壓滅菌，室溫保存。
[0022]10 X酸水解酪素(10%酸水解酪素):100g酸水解酪素溶于1000mL ddH20中，高壓滅菌，4°C保存。
[0023](4) YPD培養基(1.0%酵母提取物、2.0%蛋白胨、2.0%葡萄糖):IOg酵母提取物、20g蛋白胨溶于900mL ddH20中，加入20g瓊脂制YB)板，高壓滅菌，再加IOOmL IOX葡萄
糖，4°C保存備用。
[0024](5) YPG 培養基(1.0%酵母提取物、2.0%蛋白胨、1.0%甘油):IOg酵母提取物、20g蛋白胨溶于900mL ddH20中，高壓滅菌，再加IOOmL IOX甘油，4°C保存備用。
[0025](6) BMMYC 培養基(1.34%ΥΝΒ、4Χ 10、生物素、0.5% 甲醇、1.0% 酵母提取物、2.0%蛋白胨、1.0%酸水解酪素):10g酵母提取物、20g蛋白胨溶于600mL ddH20中，高壓滅菌，冷卻至室溫，加IOOmL IM磷酸氫二鉀緩沖液，pH=7.0UOOmL 10XYNB、2mL 500X生物素、IOOmLIOX甲醇、IOOmL IOX酸水解酪素混勻，4°C保存。
[0026](7)緩沖液:Buffer I (50 mM 磷酸鈉，0.3 M 氯化鈉，10 mM 咪唑和 10 mM pH 8.0Tris-HCl )； Buffer II (50 mM 磷酸鈉，0.3 M 氯化鈉，500mM 咪唑和 10 mM pH 8.0 Tris-HCl )；Buffer 111(20 mM Tris-HCl pH 8.0, I mM EDTA, 5% 甘油);Buffer IV (20 mM Tris-HCl pH 8.0，ImM EDTA, 5% 甘油，100 mM 硼砂)；Buffer V (20 mM Tris-HCl pH 8.0, ImM EDTA, 5% 甘油，200mM硼砂)。
[0027]2、CD40Ldimer基因序列的優化和獲得
根據NCBI登陸的豬CD40Ldimer基因序列(GeneID:397231)和酵母菌密碼子偏好性，對CD40L的基因序列進行優化，在序列的5’和3’端引入XhoI和BamHI兩個酶切位點，優化后的Q340L基因序列由Invitrogen公司合成。合成的QMOLdimer基因序列經XhoI和BamHI雙酶切后，使用膠回收試劑盒對目的片段進行回收，將回收的片段作為連接的第一部分。
[0028]以攜帶II酶切位點的 P40LBgl (5，CCG CTC GAG AGA TCT^r GGT GGT GGTTCT ATG CAC AAG GGT GAC CAA GAC 3’)和攜帶&oRI 酶切位點的 P40LEco (5，CCG GAA TTCTTAGTG GTGGTGGTGGTGGTGCkk CTT CAA CAA ACC GAA AGA AGT 3’)為引物，合成的 CD40Ldimer基因序列為模板進行PCR擴增，為了便于后期的純化，在C端引入6個組氨酸(6XHis tag)經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用膠回收試劑盒回收目的片段，將PCR產物進行通01和
雙酶切后克隆到pwPICZalpha中，之后對上述構建好的載體進行汝./ II和&oRI雙酶切，使用膠回收試劑盒對目的片段進行回收，將回收的片段作為連接的第二部分。 [0029]3、表達載體的構建
在無菌Eppendorf管中分別加入第一部分和第二部分基因片段各7 μ LJyUXoI和雙酶切的質粒，2 yL Τ4連接酶，2 μ L連接酶緩沖液，混勻，4°C連接12h ;將10 μ L連接產物加入到90 μ L感受態大腸桿菌Τ0Ρ10中，混勻，42°C熱激90s轉化，加入400 μ L LB液體培養基，37°C振蕩培養lh，將菌液涂布在Zeocin抗性的LB固體培養基上，37°C培養過夜。從轉化的平板上挑取6個菌落接種到含Zeocin的5mL LB液體培養基中，37°C過夜培養，用質粒提取試劑盒提取質粒。
[0030]用Xho I和EcoR I對連接產物進行雙酶切鑒定，驗證基因片段正確插入，該重組質粒命名為 pwPICZalpha-CD40Ldimer。
[0031]4、融合蛋白的表達 I)小劑量誘導表達
利用限制性內切酶Sac I將5-10 μ g重組質粒pwPICZalpha_0)40Ldimer進行線性化，采用PCR產物純化試劑盒回收線性化的pwPICZalpha-⑶40Ldimer，加入到90 μ L感受態畢赤酵母Χ-33中，混勻，冰浴5min后電擊轉化，加入ImL山梨醇后，30°C放置2h，將菌液涂布在Zeocin抗性的YPD固體培養基上，30°C培養3_4d。從轉化的平板上挑取6個菌落接種到含Zeocin的5mL YPD液體培養基中，30°C 250rpm培養24h，3500rpm離心，棄上清后加入5mL YPG液體培養基，300C 250rpm培養24h，3500rpm離心棄掉上清，加入2mL BMMYC液體培養基，270C 225rpm培養48h，每隔12h補充一次甲醇，使甲醇濃度維持在0.5%。3500rpm離心后收集上清液，SDS-PAGE分析上清液。[0032]2)大劑量誘導表達
挑取一個陽性菌落接種到YPD液體培養基中，30°C 250rpm培養24h作為種子培養液，取13mL種子培養液接種到250mL YPD液體培養基中，30°C 250rpm培養24h，30°C 250rpm培養24h，3500rpm離心，棄上清后加入250mL YPG液體培養基，30°C 250rpm培養24h，3500rpm離心棄掉上清，加入125mL BMMYC液體培養基，27°C 225rpm培養48h，每隔12h補充一次甲醇，使甲醇濃度維持在0.5%。3500rpm離心后收集上清液，SDS-PAGE分析上清液。
[0033]5、融合蛋白的純化
I)ProteinPure N1-NTA 樹脂純化
在誘導表達的上清液中加入終濃度為50mM磷酸鈉，0.3M氯化鈉，IOmM咪唑和IOmM pH
8.0 Tris-HCl，用 0.45 μ m 濾器過濾。取 IOmL ProteinPure N1-NTA 樹脂裝入 XK16/20 層析柱中，柱子裝好后與恒流泵相連，用10倍體積的Buffer I平衡柱子，平衡好后上樣，上樣結束后用8倍體積的Buffer I沖洗柱子，再用8倍體積的Buffer II洗脫目的蛋白并收集到8個不同的管中，整個過程的流速為5mL/min。用SDS-PAGE對純化的蛋白進行分析，圖1中的SDS-PAGE結果顯示，目的蛋白集中在Buffer II的2號和3號管中。將含有目的蛋白的Buffer II混合，裝入3.5kDa透析袋中，在4°C條件下用含有20mM Tris-HCl pH 8.0, ImM EDTApH8.0, 5%甘油的透析液透析8h，每隔4h換一次透析液。
[0034]2)強陽離子交換樹脂純化
取IOmL強陽離子交換樹脂裝入》(16/20層析柱中，柱子裝好后與恒流泵連接，用10倍體積的Buffer III平衡柱子，將透析好的樣品上樣，上樣結束后用8倍體積的Buffer III沖洗柱子，再分別用8倍體積的Buffer IV和Buffer V洗脫目的蛋白，并將洗脫液收集到8個不同的管中，整個過程的流速為5mL/min。用SDS-PAGE對純化的蛋白進行分析，由圖2可知目的蛋白集中在Buffer IV的I和2管中，將含有目的蛋白的Buffer IV混合，采用超濾濃縮的方法對目的蛋白進行濃縮，然后裝入3.5kDa的透析袋中，在4°C條件下用含有5%甘油的PBS透析8 h，每隔4 h換一次PBS。用BCA試劑盒測定目的蛋白濃度，蛋白濃度為0.9mg/mL,IL培養液產量約為14mg，說明該蛋白基因在畢赤酵母中得到高效表達。利用抗His標簽抗體對該蛋白進行western blot分析，由圖3結果確證其為所要表達的蛋白。
[0035]4、ELISA 分析
將重組的⑶40Ldimer蛋白加入到96孔聚苯乙烯酶標板中4°C孵育過夜，棄上清液，加入100 μ L2% BSA室溫下封閉2h。之后加入100 μ L不同濃度的⑶40L多克隆抗體(2.5 μ g/mL, 2 μ g/mL, I μ g/mL, 0.5 μ g/mL, 0.25 μ g/mL, 0.125 μ g/mL),室溫下孵育 l_2h,用 PBS洗3次，加入100 μ L 二抗，室溫下孵育0.5-lh，用PBS洗3次，加入100 μ L TMB室溫下避光孵育10-30min，加入100 μ LI N HCl終止反應，用酶標儀測定450nm的OD值。由圖4結果可知重組⑶40Ldimer蛋白能夠與⑶40L抗體結合,證明重組⑶40Ldimer蛋白的構象正確。
【權利要求】
1.豬⑶40Ldimer融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO:2所示。
2.權利要求1所述豬CD40Ldimer融合蛋白的編碼基因，其特征在于，其堿基序列如SEQID NO:1 所示。
【文檔編號】C07K19/00GK104004099SQ201410262607
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月13日 優先權日:2014年6月13日
【發明者】李宏全, 王志瑞, 范闊海, 溫慧之, 原慧 申請人:山西農業大學