靶向于RANKL和TNF-α的人源化抗體及其應用的制作方法

靶向于RANKL和TNF-α的人源化抗體及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種靶向于RANKL和TNF-α的人源化抗體及其應用。本發明的抗體是將針對RANKL-TNF樣區表位的鼠源性單克隆抗體的V區通過CDR替換技術進行人源化改造獲得。本發明還提供了用于表達靶向于RANKL和TNF-α的人源化抗體的表達載體及其構建方法。本發明的人源化抗體可在體外有效的中和TNF-α，抑制TNF-α所致的細胞凋亡，中和RANKL，抑制破骨細胞的生成，可同時拮抗TNF-α造成的炎癥和RANKL引起的骨破壞作用，可為治療類風濕性關節炎新型生物制劑的研究提供了基礎。
【專利說明】靶向于RANKL和TNF- α的人源化抗體及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程及免疫學領域，具體地，涉及靶向于RANKL和TNF-α人源化抗體及其應用。
【背景技術】
[0002]類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種常見的以慢性、進行性、侵襲性關節炎為主要表現的自身免疫性疾病。常可影響全身多組織器官，尤以關節累及最為常見。可表現為受累關節的持續性滑膜炎、滑膜組織異常增生，大量炎性細胞浸潤、血管翳的形成以及骨、軟骨、韌帶的損傷，最終導致關節畸形、功能障礙，甚至致殘。
[0003]RA的病理學機制極其復雜，目前還未完全闡明。但大量的研究表明在RA的病理過程中，促炎因子介導的免疫炎癥反應是其重要的環節。TNF-α的生物學作用在實驗動物和人體中都得到了廣泛的研究，特別是其在炎癥相關的諸多疾病中均表現出明顯的高表達。TNF-α是一個多效性的細胞因子，介導了廣泛的生物學作用，在RA的整個病理過程中其也成為一個重要的靶點而廣受關注。在RA患者中，TNF-α除了表現為在多種疾病類型中表現的相同作用，如介導細胞的募集、增殖和死亡，以及免疫調節的作用外，其還表現有一些特殊的生物學功能，如誘導破骨細胞的生成。在RA等自身免疫疾病的病理過程中，TNF-a對于病理性炎癥瀑流的調節發揮著重要作用，如其可以迅速誘導炎癥因子IL-1 β、IL-6、IL-17，以及急性炎癥蛋白——C反應蛋白的產生。TNF-a在一個由炎癥細胞和炎癥因子共同作用的復雜網絡中發揮著作用，在這個復雜網絡中，TNF-a是一個早期而又重要的節點，它觸發及介導了下游的機制，并且通過各種正、負反饋控制著炎癥病理的發生和發展。在RA患者中，關節滑膜的炎癥增加了血流的供應和炎癥細胞的浸潤。巨噬細胞是滑膜炎癥中TNF-a的主要來源，其通過細胞與細胞之間的接觸、細胞因子、免疫復合物、補體、微生物感染、內源性配體(Toll樣受體)、缺氧的病理機制影響TNF-α的產生。在整個疾病的過程中，滑膜組織都可以持續檢測到TNF-a的表達。高表達TNF-a的轉基因小鼠中，其關節中高表達IL-1 β、IL-6，發生自發性關節炎的表現，出現了類似于RA的臨床表現和組織病理改變。在體外培養RA患者滑膜組織的過程中，中和TNF- α可以有效的抑制IL-1及其他引起RA病理過程的炎癥因子的產生。膠原誘導關節炎小鼠模型的研究中也證明，通過中和TNF-a或是阻遏其膜受體，對于疾病的改善都具有明顯的作用。正是基于在實驗模型中關于TNF-α的作用及阻遏其所表現出來的功效，使得人們開始致力于針對TNF-α的單克隆抗體研究，其中最早應用于臨床的是其一種人鼠嵌合抗體——英夫利西(infliximab)。之后以此為基礎出現了大量的相關性研究，結果均表明抗TNF-α抗體的應用，可以有效的緩解RA的疾病活動度，改善患者的癥狀體征。目前在美國和歐盟上市的TNF-α拮抗劑一共有5種，分別是英夫利西(infliximab)、依那西普(etanercept)、阿達木單抗(adalimumab)、賽妥朱單抗(certolizumab)和高利單抗(golimumab)。但在臨床研究中發現，對于TNF-α的拮抗雖然能夠有效的緩解RA過程中表現出的滑膜炎癥和關節腫脹，但是其對于相伴隨 的關節軟骨和骨破壞的保護作用相應較弱。[0004]現今的研究表明，破骨細胞在類風濕性關節炎的骨與軟骨破壞的病理過程中發揮著重要的作用，在RA臨床患者或實驗模型中均可發現，破骨細胞的數量增加和活化直接導致了骨質丟失病理反應的發生。而NF-K B活化因子受體的配體(RANKL)、骨保護素(OPG)、NF-K B活化因子受體(RANK)的共同作用，調節著破骨細胞募集和活化。RANKL是TNF超家族成員，在骨髓的基質細胞、成骨細胞或活化的T細胞表面表達，其可以與巨噬細胞或髓系祖細胞表面的RANK結合，誘導后者分化為成熟的破骨細胞。在巨噬細胞或髓系祖細胞的體外培養體系中，外源性加入重組RANKL也可以誘導破骨細胞的產生。如在小鼠體內敲除RANKL或RANK基因，則會出現破骨細胞缺陷導致骨硬化癥的產生，也表明RANK和RANKL是破骨細胞生成的關鍵。OPG是RANKL的拮抗劑，如其在體內缺乏，對RANKL的拮抗作用將隨之減弱，活化的破骨細胞產生的數量將隨之增加，從而在臨床上出現了骨質疏松癥。可見如果體內RANK和OPG出現了變化則將引起骨代謝的紊亂，同時，以TNF- α為主要代表的炎性分子分別與其受體相互作用后，破壞了骨重塑的微環境，進而使成骨細胞上的RANKL表達上調，與破骨細胞上的RANK結合，激活了破骨細胞的信號轉導通路，使破骨細胞異常增殖、活化，進一步使炎癥加重和骨破壞持續。
[0005]靶向于TNF- α和RANKL的生物制劑在臨床上的應用，改變了 RA患者的臨床治療狀況，如今拮抗TNF- α的阿達木單抗、英夫利昔單抗、依那西普、以及拮抗RANKL作用的迪諾賽麥，已經先后投入到臨床中并取得了較好的治療效果。但是對于RA出現的滑膜炎癥及伴隨的骨質破壞，單一應用一種生物學制劑均不能得到完全的解決。
[0006]鑒于RANKL-RANK與TNF- α信號轉導通路交叉對話機制的闡明，及RANKL和TNF- α與RA主要病理改變的相關性，本發明設想同時抑制RANKL和TNF- α的作用可能更有利于控制RA病情進展。基于RANKL為TNFSF成員，核心結構為胞外羧基端的158個氨基酸，由數條β型 折疊構成，為TNF家族同源性結構域。本發明以RANKL的TNF樣區與TNF- α的氨基酸序列相似性高的區域作為抗原的候選表位,選用相應原核表達系統,構建重組蛋白表達載體，并對重組蛋白進行表達、通過大量實驗數據驗證，該蛋白刺激機體產生的多克隆抗體可同時拮抗TNF-α造成的炎癥與RANKL引起的骨破壞進而降低了膠原誘導小鼠關節炎發病率緩解了疾病程度。通過單克隆抗體篩選技術，獲得了一株高特異性的鼠源性單抗，可以有效的同時拮抗TNF-a和RANKL的生物學作用，同時緩解疾病過程中所出現的炎癥反應和骨破壞的病理過程。但由于鼠源性單抗的種屬特異性，會使得其在人類類風濕性關節炎疾病臨床治療的應用過程中受到限制。因此亟需研發一種人源化的可同時拮抗TNF- α和RANKL的抗體并將其合理地應用于人類炎性骨病的治療中。

【發明內容】

[0007]為了解決上述技術問題，本發明目的是提供一種靶向于RANKL和TNF-a的人源化單克隆抗體。
[0008]本發明另一目的是提供表達上述單克隆抗體的表達載體及其制備方法。
[0009]本發明又一目的是提供上述單克隆抗體在制備治療炎性骨病藥物中的應用。
[0010]為實現上述目的，本發明針對發明人前期研究成果RANKL-TNF樣區的鼠源單克隆抗體(其制備方法已在中國專利CN 103060274B中公開)的V區通過⑶R替換技術進行人源化改造，在保留其特異性功能的前提下，實現重組人源化抗體的構建，制備獲得了靶向于TNF-α和RANKL的人源化抗體，并對其生物學特性及功能進行鑒定。
[0011]本發明提供的靶向于RANKL和TNF-α的人源化抗體，其輕鏈氨基酸序列如SEQ IDN0.1所示，其重鏈氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0012]具體而言，本發明是采用CDR替換技術制備靶向于TNF-a和RANKL的人源化抗體，包括如下步驟:
[0013](I)鼠源單克隆抗體可變區cDNA序列的克隆和確定:提取分泌雙靶點鼠源抗體的雜交瘤細胞總RNA，RT-PCR技術獲得鼠源抗體可變區的cDNA序列；
[0014](2)人源化抗體可變區的設計及合成:分別選取同源性最高的人抗體重鏈、輕鏈作為替換骨架，將鼠源抗體CDR區與人源抗體的骨架區進行拼接，完成鼠源CDR的替換；
[0015](3)重組人源化抗體表達載體的構建:上述構建完成的人源化抗體重鏈、輕鏈的序列分別與攜帶有人抗體IgGl和K鏈恒定區的表達載體相拼接，構建完成攜帶有完整人源化抗體重、輕鏈基因的表達載體；
[0016](4)重組人源化抗體的表達及提純:將上述載體共轉染細胞中進行真核表達，將培養上清中的分泌抗體通過蛋白質G親和層析進行提純。最終獲得靶向于RANKL和TNF- a的人源化抗體。
[0017]上述方法中，步驟(1)的RT-PCR方法中，用于擴增重鏈上游引物為:
[0018]5’-CCGCTCGAGTCATGCTCTTCTTGGTAGCAACAGCT-3’
[0019]下游引物為:5’-CTAGCTAGCTGCAGAGACAGTGAGAGTGG-3’；
[0020]用于擴增輕鏈的上游引物為:
[0021]5’-CATGCCATGGAAAATGGAGACAGACACACTCCTGC-3’
[0022]下游引物:5’-CTACGTACGCCCGTTTGATTTCCAACTT-3’。
[0023]其中，步驟(1)的重鏈的PCR 條件為:94°C，2min ;94°C，30s，58°C，30s，72°C，ls，共35個循環；72°C延伸IOmin。
[0024]輕鏈的PCR 條件為:94 V，2min ；94 V，30 秒，55 °C，30s，72 °C，ls，共 35 個循環；72°C延伸 lOmin。
[0025]步驟(4)所述細胞優選為中華倉鼠卵巢上皮細胞(Chinese hamster ovary, CH0)。
[0026]本發明提供了編碼上述人源化抗體的基因，其輕鏈核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，其重鏈核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0027]本發明還提供了用于表達靶向于RANKL和TNF- α的人源化抗體的重組重鏈表達載體hGl-hHv和重組輕鏈表達載體hK-hLv。
[0028]進一步地，本發明提供了上述攜帶有完整人源化抗體重、輕鏈基因表達載體的構建方法，包括以下步驟:
[0029](I)構建重組重鏈表達載體hGl-hHv ；
[0030](2)構建重組輕鏈表達載體hK-hLv ；
[0031](3)將上述兩個表達載體分別轉入感受態細胞中，完成轉化。
[0032]其中，步驟(1)是將人源重組抗體重鏈可變區序列和載體pFUSEss-CHIg-hGl分別用XhoI和NheI雙酶切，回收酶切產物，在T4連接酶的作用下連接；
[0033] 其中，步驟(2)是將人源重組抗體輕鏈可變區序列和載體pFUSE2ss-CLIg-hk分別用NcoI和BsiWI雙酶切，回收酶切產物，在T4連接酶的作用下連接。[0034]進一步地，步驟(2)的酶切方法是先加入Ncol，充分混勻，離心數秒，水浴I小時，待第一次消化完成后，再在反應體系中加入10XBuffer3、BsiffI和去離子水充分混勻，離心數秒，水浴I小時。具體酶切方法如下:
[0035](I)重鏈或載體的酶切反應體系(20 μ I)
[0036]IOXBuffer4 2 μ I ;人源重組抗體重鏈可變區序列(或pFUSEss-CHIg-hGl),16.8μ I ； 100 X BAS, 0.2 μ I ；XhoI和NheI各0.5μ 1，充分混勻，離心數秒，水浴I小時。
[0037](2)輕鏈或載體的酶切反應體系:
[0038]10XBuffer3, 2 μ I ;人源重組抗體輕鏈可變區序列(或pFUSE2ss_CLIg_hk),17.5μ I ；NcoI 0.5 μ 1，充分混勻，離心數秒，水浴I小時。待第一次消化完成后，于上述20 μ I反應體系中 加入:10XBuffer3,ly I ；BsiffI,0.75 μ I ;去離子水，8.25μ 1，充分混勻，離心數秒，水浴I小時。
[0039](3)將上述酶切正確的片段行Τ4連接酶連接，構建完整的重組人源化抗體表達載體。連接體系(20 μ I)如下:
[0040]10ΧΤ4連接酶反應緩沖液，2μ I ;Τ4連接酶，1μ I ;載體片段3μ I ;可變區片段14 μ 1，充分混勻，短暫離心，水浴過夜。
[0041](4)將上述分別連有重組人源化抗體重、輕鏈的表達載體hGl-hHv和hK-hLv，分別轉入DH5CI的感受態細胞中，按前述步驟完成轉化。含有重組人源化抗體重鏈表達載體的感受態細胞涂布Zeo選擇平板，含有輕鏈嵌合載體的感受態細胞涂布于Bar選擇平板，孵育，過夜培養。選取測序正確的載體。
[0042]對通過上述方式獲得的人源化抗體進一步進行生物學鑒定，通過羊抗人IgG(L+H)抗體檢測轉入PVDF膜的人源化抗體，其分子量分別約為23kDa和50kDa，分子量大小與理論抗體輕重鏈單鏈相仿。RT-PCR獲得表達有重組抗體的cDNA，以人抗體上下游引物進行PCR,電泳結果顯示，在大約700bp和1400bp左右出現陽性條帶，與理論長度輕鏈666bp、重鏈1356bp相吻合，進一步證明該分泌的重組抗體即為人源化抗體。
[0043]間接ELISA結果顯示，該人源化抗體可以分別與RANKL和TNF- α結合，雖然在同等條件下其結合的能力要弱于相應的市售抗體，但是其雙結合的特性是當前市售抗體所沒有的。Western blotting結果也顯示,該人源化抗體可以分別與TNF-α和RANKL發生特異的結合。細胞毒性試驗結果分析，TNF-a (0.25ng/ml)可以誘導L929細胞發生凋亡，平均凋亡率為48.65%，應用該人源化抗體經行中和試驗，最佳抑制結果出現于2 μ g/ml時，此時細胞凋亡率為22.01%，破骨細胞生成試驗顯示，人源化抗體可以抑制由RANKL誘導產生的破骨細胞的分化。
[0044]進而，本發明還提供含有上述人源化抗體的藥物，所述藥物還包括藥學上可接受的載體和/或賦形劑。該藥物可用于緩解類風濕關節炎的炎癥和骨破壞兩個病理特征，進而用于治療類風濕關節炎等炎性骨病。
[0045]本發明還提供了所述人源化抗體在制備治療炎性骨病藥物中的應用。所述炎性骨病伴隨骨破壞。所述炎性骨病如類風濕關節炎。
[0046]本發明的優點在于能夠在體外有效中和人TNF-α，拮抗其作用，并且也能夠中和人RANKL，有效抑制破骨細胞的分化、成熟，緩解骨質疏松的骨損失；是一種能夠抑制炎癥和骨破壞的雙靶點人源化抗體，可成為一種有效針對類風濕關節炎兩個病理特征的單一制劑。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0047]圖1為免疫鼠源可變區cDNA序列PCR電泳圖，其中泳道1:Marker，2:包括前導序列在內的鼠源重鏈可變區序列，3:包括前導序列在內的鼠源輕鏈可變區序列；
[0048]圖2為鼠源重鏈信號肽序列預測圖，SRVMLFLVATATGVHSQ為信號肽序列。
[0049]圖3為鼠源輕鏈信號肽序列預測圖，MEMETDTLLLffVLLLffVPGSTG為信號肽序列
[0050]圖4為鼠源輕鏈⑶R序列分析圖。
[0051 ] 圖5為鼠源重鏈⑶R序列分析圖。
[0052]圖6為重組人源化抗體與鼠源模板鏈序列比較圖，其中A圖為重組人源化抗體輕鏈序列與鼠源模板鏈序列比較圖，共有18個位點不同，分別為IO(Thr-Ser), 12 (Ser-Val)，15(Pro-Leu), 23(Cys-Tyr), 40(Tyr-Asn), 49(Lys-Arg), 78(Thr-Asn), 80(Ser-His), 81(Ser-Pro)，84(Pro-Glu)，87(Phe-Ala)，105(Gly-Pro)，106(Thr-Ser)，107(Lys-Trp)，108 (Leu-Lys)，109 (Glu-Ser)，110 (Ile-Asn)，Ill(Lys-Gly) 3圖為重組人源化抗體重鏈序列與鼠源模板比較，結果表明共有9個位點不同，分別為I (Glu-Gln)，3 (Lys-Gln)，9 (Pro-Ala)，40 (Lys-Thr)，62(Glu-Gln)，72(Ser-Ala)，82(Glu-Gln)，83(Leu-Val)，119(Ser-Ala)。
[0053]圖7為含有人源抗體K恒定區的重組人源化抗體完整輕鏈序列的表達載體圖譜。
[0054]圖8為含有人源抗體Y I恒定區的重組人源化抗體完整重鏈序列的表達載體圖
-1'TfeP曰。
[0055]圖9為夾心ELISA鑒定轉染表達載體CHO細胞培養上清中分泌表達的抗體結果圖，當重鏈輕鏈表達載體同時轉入時，才可以檢測到完整的抗體表達。(***P < 0.001)
[0056]圖10為western blot分析人源化抗體輕、重鏈圖，顯示在23kDa和50kDa位點有陽性條帶。
[0057]圖11為RT-PCR獲得表達有重組抗體的cDNA的電泳圖，其中1:PT_PCR獲得的輕鏈產物，約700bp，2:PT-PCR獲得的重鏈產物，約1400bp，3:Marker。
[0058]圖12為人源化抗體與TNF-α的結合能力圖，通過OD45tl驗證人源化抗體組為1.376±0.127，雖效果比市售重組TNF-α抗體2.162±0.084相較不足，但明顯優于陰性對照組 0.248 ±0.030(***Ρ〈0.001)。
[0059]圖13為人源化抗體與RANKL的結合能力圖，通過OD45tl驗證人源化抗體組為1.725±0.104，雖效果比市售重組RANKL抗體2.470±0.075相比較略低(**Ρ〈0.01)，但明顯優于陰性對照組0.231 ±0.018(***Ρ〈0.001)。
[0060]圖14為western blot分析人源化抗體同時與TNF- α和RANKL結合，A:TNF- a (17.5KD)，B:RANKL (23KD)。
[0061]圖15為細胞 毒性試驗結果分析圖，TNF-a (0.25ng/ml)誘導48.65% L929細胞發生凋亡，人源化抗體在2μ g/ml時可以將該凋亡率下降至22.01(*P〈0.05)。
[0062]圖16為重組人源化抗體在破骨細胞生成實驗效果圖，人源化抗體治療組在低劑量時仍可見RANKL誘導產生的破骨細胞的分化(TRAP染色陽性，丨標注位點)，在Iyg/ml及以上劑量處理時，能夠完全抑制RANKL的作用。A:陰性對照(30ng/ml M-CSF)；B:陽性對照(30ng/ml M_CSF+40ng/ml RANKL) ;C 治療對照組(30ng/ml M_CSF+40ng/mlRANKL+0.1 μ g/ml ant1-RANKL) ；D:實驗組 I (30ng/ml M_CSF+40ng/ml RANKL+0.1 μ g/ml 人源化抗體)；E:實驗組 2 (30ng/ml M_CSF+40ng/ml RANKL+1 μ g/ml humanized antibody) ；F:實驗組 3: (30ng/ml M_CSF+40ng/ml RANKL+10 μ g/ml 人源化抗體)
【具體實施方式】
[0063]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。
[0064]若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。所用試劑均可商業購得。本發明涉及的RANKL-TNF樣區的鼠源單克隆抗體(已在中國專利CN103060274B 中公開)。
[0065]實施例1動物免疫鼠源可變區cDNA序列的克隆和確定
[0066]按照操作程序提取雜交瘤細胞(保藏號為CGMCC N0.6853)的總mRNA(SV TotalRNA7Promega) ;RT_PCR反轉錄系統(promega)獲得鼠源抗體可變區cDNA ;按照下列程序進行鼠源抗體可變區基因擴增
[0067]1、引物(INVIV0GEN 公司合成)
[0068](I)重鏈上游引物:
[0069]5’-CCGCTC GAGTCATGCTCTTCTTGGTAGCAACAGCT-3’
[0070](2)重鏈下游引物:
[0071]5，-CTAGCTAGCTGCAGAGACAGTGAGAGTGG-3，
[0072](3)輕鏈上游引物:
[0073]5’-CATGCCATGGAAAATGGAGACAGACACACTCCTGC-3’
[0074](4)輕鏈下游引物:5’-CTACGTACGCCCGTTTGATTTCCAACTT-3’
[0075]2、PCR反應循環條件
[0076]重鏈的PCR 條件為:94°C，2min ；94°C，30 秒，58°C，30 秒，72°C，I 秒，共 35 個循環；72°C延伸10分鐘。輕鏈的PCR條件為:94。〇，211^11;941:，30秒，551:，30秒，721:，1秒，共35個循環；72°C延伸10分鐘。
[0077]結果見圖1所示在400bp左右有明顯的陽性條帶，與理論值相符(抗體可變區重鏈與輕鏈大小一般位于350~450bp之間)。
[0078]3、對PCR陽性產物，切膠回收后進行測序。
[0079]將鼠源抗體可變區重鏈、輕鏈的PCR陽性產物測序結果通過BLAST程序進行同源性比對(http:"www.ncb1.nlm.nih.gov/)。使用信號肽分析軟件SignalP4.1對重、輕鏈可變區進行分析，對信號肽剪切位點進行預測(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，SignalP4.1結果分析，S值位于基線上方，則其對應氨基酸位點為信號肽成分，C值峰值處為信號肽與成熟蛋白的切割位點，Y值意義與C值相同，但更為準確。如圖2所示鼠源重鏈信號肽序列預測:SRVMLFLVATATGVHSQ為信號肽序列；如圖3所示鼠源輕鏈信號肽序列預測:MEMETDTLLLWVLLLWVPGSTG為信號肽序列。
[0080]VBASE2 (http://www.vbase2.0rg/)進行結構域分析。如圖4鼠源輕鏈⑶R序列分別為CDRl:27 - 36，CDR2:52 - 56，CDR3:94 - 103位點；圖5所示鼠源重鏈CDR序列分別為CDRl:26 - 33，CDR2:52 - 58CDR3:96 - 109 位點。[0081]實施例2人源化抗體可變區的設計及合成
[0082]重組人源化抗體的設計:分別將實施例1獲得的鼠源抗體可變區重鏈、輕鏈的序列與BLAST程序中人源抗體重鏈、輕鏈的數據庫信息進行比對(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)。分別確立與鼠源抗體可變區重鏈、輕鏈同源性最高的人源化抗體重鏈(pdb: 3DGG_B)、輕鏈(pdb:1I9R_L)的序列。
[0083]分別將篩選所得的人源化抗體重鏈、輕鏈的序列通過VBASE2程序(http: //WWW.vbase2.0rg/)進行結構域分析，分別確立其⑶R區及FR區結構:3DGG_B的⑶Rl為GYTFTSYV,CDR2 為 NPYNDDT，CDR3 為 CAREDYYGSRWGYW。1I9R_L 的 CDRl 為 QRVSSSTYSY，CDR2為IKAS，⑶R3為HSWEIPPTF。充分保證人源化抗體FR區結構完整性的同時，替換相應鼠源抗體可變區重鏈、輕鏈的CDR結構，構建完成重組的人源化抗體(如圖6所示)。人源化抗體重鏈5’上游加入Xhol，3’下游加入NheI酶切位點；人源化抗體輕鏈5’上游加入Ncol，3’下游加入BsiWI酶切位點。INVITR0GEN公司進行全基因合成。獲得本發明的靶向于RANKL和TNF-α的重組人源化抗體的輕鏈核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，其重鏈核苷酸序列如SEQ ID N0.4 所示。
[0084]實施例3重組人源化抗體表達載體的構建及表達
[0085]重組人源化抗體表達載體的構建:將重組抗體重鏈可變區序列及pFUSEss-CHIg-hGl (Catalog#pfusess_hchgl,購自美國 InvivoGen 公司)應用限制性內切酶 Xhol、NheI37°C水浴I小時進行雙酶切。重組抗體輕鏈可變區序列及pFUSE2ss_CLIg-hk(Catalog#pfuse2ss_hchlk,購自美國InvivoGen公司)應用限制性內切酶NcoI37°C水浴I小時、BsiWI55°C水浴I小時進行雙酶切。上述酶切產物分別行瓊脂糖凝膠電泳(1.2%瓊脂糖凝膠)。紫外燈下切取陽性條帶，后按試劑盒說明程序行凝膠回收(QIAquickGel ExtractionKU，購自美國QIAGEN公司)。
[0086]將酶切片段T4連接酶連接，構建完整的重組人源化抗體表達載體，攜帶有重組人源化抗體重鏈的表達載體命名為hGl-hHv (如圖7所示)，攜帶有重組人源化抗體輕鏈的表達載體命名為hK-hLv (如圖8所示)。分別將上述hGl-hHv及hK-hLv載體共轉染CHO細胞，48小時后分析轉染結果。
[0087]雙抗夾心ELISA法檢測上清抗體含量:將羊抗人κ鏈抗體用包被緩沖液1:500稀釋，100 μ I/孔加入至96孔酶標板中(200ng/孔)，4°C過夜。PBST洗滌3次；加入200 μ I/孔封閉液，4°C過夜。棄去封閉液，加入PBST洗滌3次。200 μ I/孔加入培養上清，并設置3個樣本復孔，以正常未轉染CHO細胞上清作為陰性對照，人IgG標準品(40ng/ml)為陽性對照。37°C，I小時。PBST洗滌3次。HRP標記的羊抗人IgG Fe段抗體(1:8，000)每孔100μ 1，37°C，1小時。加入PBST洗滌5次。顯色劑100 μ I顯色30分鐘，終止試劑50 μ I終止，測定OD45tl值。如圖9所示，夾心ELISA鑒定轉染表達載體CHO細胞培養上清中分泌表達的抗體的產生，只有重鏈輕鏈表達載體同時轉入時，才可以檢測到完整的抗體表達。(***Ρ< 0.001)本發明的靶向于RANKL和TNF- α的重組人源化抗體的輕鏈氨基酸序列如SEQ IDN0.1所示，其重鏈氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0088]實施例4重組人源化抗體的穩定表達
[0089]將攜帶有重組人源化抗體重鏈的表達載體hGl-hHv、輕鏈的表達載體hK_hLv共轉染入 CHO細胞中，DMEM培養基(10% FBS，100U/ml 青霉素，100 μ g/ml 鏈霉素)，37°C，5% CO2孵箱孵育。待轉染48小時后CHO細胞換用BZ培養基(DMEM含有10% PBS, 25 μ g/ml Zeo,
2.5 μ g/ml Bar)培養，常規2~3天換液一次，換液時PBS沖洗，清除死細胞。
[0090]上述篩選培養15天的各孔細胞，其上清行雙抗夾心ELISA法檢測，并挑選表達量最高的3個孔行有限稀釋法亞克隆培養。使用BZ培養基將細胞重懸并逐步稀釋至5個/ml ο于96孔板中每孔加入200 μ I細胞懸液,此時理論上每孔只含有I個細胞,鋪板5塊，37°C,5% CO2培養。2~3天常規換液，選取單克隆孔進行后續培養。待單克隆細胞鋪滿板底60%以上時，取培養上清行雙抗夾心ELISA法檢測，將可持續分泌表達人源化抗體并且連續2次表達量較高的克隆轉入24孔板中擴增培養，建系、凍存。
[0091]實施例5重組人源化抗體的純化
[0092]應用親和色譜法對人源化抗體進行純化:在室溫下，用5~10倍柱體積的起始緩沖液流洗柱子，流速可達lml/cm2.mirio用3~5倍體積柱體積的0.lmol/L甘氨酸-鹽酸緩沖液洗去柱內的污染物。用5~10倍柱體積的起始緩沖液重新平衡柱子。將含有重組人源化抗體的培養上清收集后12，000rpm，4°C，30min，去除細胞碎片。0.45 μ m濾膜過濾，除去聚合物用截留分子量為IOOkD的中空纖維超濾柱濃縮至原體積的1/10。用等體積起始緩沖液稀釋樣品。將樣品加入色譜柱，待樣品完全流經色譜柱后，用5~10倍柱體積起始緩沖液流洗色譜柱。 [0093]用5~10倍柱體積的0.lmol/L甘氨酸-鹽酸緩沖液(ρΗ2.5~3.0)洗脫。承接流洗液的容器預先注入約為流洗液1/10體積的lmol/L TriS-HCl (pH8.0)。每個接樣管接流洗液1ml，管內應預先放置0.1mllmol/L Tris-HCl (pH8.0)。合并與G280反應成陽性的各收集管。用5倍柱體積的0.lmol/L甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH2.5~3.0)清潔色譜柱。用10倍柱體積的起始緩沖液重新平衡柱子。存放色譜柱時，平衡柱子的起始緩沖液中應加入
0.02%的疊氮鈉或是20%的乙醇。
[0094]蛋白樣品的透析:將透析袋剪成15cm長度小段；在透析袋處理液中將透析袋煮沸IOmin ;用蒸餾水徹底清洗透析袋；放入lmmol/L EDTA (pH8.0)中煮沸IOmin ;用蒸餾水徹底清洗干凈；冷卻后，浸泡于PBS中，放置在4°C，備用；將預處理的蛋白樣品裝于透析袋中，兩端用夾子夾緊后，將透析袋置于PBS溶液的燒杯中。PBS溶液體積大于50倍蛋白樣品體積。將燒杯置于4°C冰箱中，持續磁力攪拌。每4小時換液一次，持續透析24~48小時。
[0095]實施例6重組人源化抗體的理化性質測定
[0096]1、抗體特異性測定:
[0097]分別將TNF- a ,RANKL,DKKI和IL-17重組細胞因子包被于酶標板(IOOng/孔)4°C過夜。PBST洗滌3次。5%脫脂牛奶封閉，室溫搖床孵育Ih或4°C過夜，PBST洗滌3次，100 μ I/孔加入純化抗體(100 μ g/ml)，并設置3個樣本復孔，37°C孵育2h。PBST洗滌3次。HRP標記的羊抗人IgG (H+L)抗體(1:8,000)每孔加100μ 1，37°C孵育Ih0 PBST洗滌3次。加顯色劑(A、B液等體積混合)100 μ 1，避光顯色30min，終止試劑50 μ I終止，測定OD45tl值。
[0098]2、BCA法測定抗體濃度
[0099](I)BSA濃度梯度標準液的制備，見表1。
[0100]表1
[0101]
【權利要求】
1.靶向于RANKL和TNF-α的人源化抗體，其特征在于，其輕鏈的氨基酸序列如SEQ IDN0.1所示，其重鏈的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.編碼權利要求1所述人源化抗體的基因，其特征在于，其輕鏈核苷酸序列如SEQIDN0.3所示，其重鏈核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
3.權利要求1所述人源化抗體的制備方法，包括如下步驟: (1)鼠源單克隆抗體可變區cDNA序列的克隆和確定:提取分泌雙靶點鼠源抗體的雜交瘤細胞總RNA，RT-PCR方法獲得鼠源抗體可變區的cDNA序列； (2)人源化抗體可變區的設計及合成:分別選取同源性最高的人抗體重鏈、輕鏈作為替換骨架，將鼠源抗體CDR區與人源抗體的骨架區進行拼接，完成鼠源CDR的替換； (3)重組人源化抗體表達載體的構建:上述構建完成的人源化抗體重鏈、輕鏈的序列分別與攜帶有人抗體IgGl和K鏈恒定區的表達載體相拼接，構建完成攜帶有完整人源化抗體重、輕鏈基因的表達 載體； (4)重組人源化抗體的表達及提純:將上述載體共轉染細胞中進行真核表達，將培養上清中的分泌抗體通過蛋白質G親和層析進行提純，最終獲得靶向于RANKL和TNF- α的人源化抗體。
4.如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)的RT-PCR方法中，用于擴增鼠源單克隆抗體重鏈的上游引物為:
5’-CCGCTCGAGTCATGCTCTTCTTGGTAGCAACAGCT-3’ ； 下游引物為:
5，-CTAGCTAGCTGCAGAGACAGTGAGAGTGG-3，； 用于擴增鼠源單克隆抗體輕鏈的上游引物為:
5’-CATGCCATGGAAAATGGAGACAGACACACTCCTGC-3’ ； 下游引物:5’-CTACGTACGCCCGTTTGATTTCCAACTT-3’。
5.用于表達權利要求1所述祀向于RANKL和TNF-α的人源化抗體的重組表達載體。
6.制備權利要求5所述重組表達載體的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)構建重組重鏈表達載體hGl-hHv； (2)構建重組輕鏈表達載體hK-hLv； (3)將上述兩個表達載體分別轉入感受態細胞中，完成轉化。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(1)是將人源重組抗體重鏈可變區序列和載體pFUSEss-CHIg-hGl分別用XhoI和NheI雙酶切，回收酶切產物，在T4連接酶的作用下連接； 步驟(2)是將人源重組抗體輕鏈可變區序列和載體pFUSE2ss-CLIg-hk分別用NcoI和BsiffI雙酶切，回收酶切產物，在T4連接酶的作用下連接。
8.含有權利要求1所述的靶向于RANKL和TNF-α的人源化抗體的藥物。
9.權利要求1所述靶向于RANKL和TNF-α的人源化抗體在制備治療炎性骨病藥物中的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于，所述炎性骨病為類風濕關節炎。
【文檔編號】C07K14/46GK104004080SQ201410250303
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月6日 優先權日:2014年6月6日
【發明者】趙文明, 王君, 袁慧慧, 杜雨軒 申請人:首都醫科大學