截短的pcv2型衣殼蛋白o(hù)rf2病毒樣顆粒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一系列N端截短的PCV2型ORF2基因、其病毒樣顆粒及制備方法、含經(jīng)過(guò)截短的病毒樣顆粒的疫苗及其在預(yù)防斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征感染中的用途。本發(fā)明截短的PCV-ORF2基因組裝而成的病毒樣顆粒，具有良好的免疫原性和保護(hù)性。本發(fā)明的制備純化過(guò)程中，沒(méi)有使用變性劑，目的蛋白的活性得到了最大程度的保護(hù)。
【專利說(shuō)明】截短的PCV2型衣殼蛋白0RF2病毒樣顆粒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白基因及載體、菌株及其表達(dá)方法，和含該病毒樣顆粒的疫苗及其在預(yù)防斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(特別是PCV2)感染的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]豬圓環(huán)病毒2型PCV2屬圓環(huán)病毒科，圓環(huán)病毒屬，為無(wú)包膜的單鏈環(huán)狀DNA病毒。此病毒在世界各國(guó)廣泛流行，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。2型豬圓環(huán)病毒又包括兩種亞型:PCV2a、PCV2b，近年來(lái)PCV2b在中國(guó)的流行范圍最廣，所占比例最大，而且PCV2b的毒性更強(qiáng)。
[0003]PCV20RF2蛋白為病毒的衣殼蛋白，分子量為25kDa，是PCV疫苗主要靶蛋白。在多種表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的0RF2可形成在形態(tài)結(jié)構(gòu)與天然病毒顆粒相似的病毒樣顆粒(Virus-Like-Particle, VLP)。該病毒樣顆粒為二十面體立體對(duì)稱結(jié)構(gòu)。其保留了病毒顆粒的天然表位，具有較強(qiáng)的免疫原性，可誘導(dǎo)針對(duì)圓環(huán)病毒的中和抗體。此外，病毒樣顆粒并不帶有病毒核酸，無(wú)潛在致癌危險(xiǎn)，具有良好的安全性。因此，VLP疫苗已成為獸用疫苗發(fā)展的主要方向。隨著分子生物學(xué)技術(shù)越來(lái)越多的應(yīng)用于疫苗的研制。病毒樣顆粒組裝技術(shù)已經(jīng)成功并廣泛的運(yùn)用于現(xiàn)代疫苗研發(fā)與生產(chǎn)。PCV2疫苗研制的關(guān)鍵是能夠大量高效制備VLP顆粒。
[0004]大腸桿菌表達(dá) 系統(tǒng)是目前應(yīng)用最為廣泛的基因工程表達(dá)系統(tǒng)之一。由于該表達(dá)系統(tǒng)具有易于培養(yǎng)，不需要復(fù)雜設(shè)備，安全性高的顯著特點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用生物制藥行業(yè)中。此前也有眾多的研究者嘗試?yán)么竽c桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行PCV2 0RF2蛋白的表達(dá)，進(jìn)而進(jìn)行PCV2預(yù)防性疫苗的開發(fā)。但是眾多的研究結(jié)果均表明，0RF2蛋白N端含有由41個(gè)氨基酸組成的核定位信號(hào)，這個(gè)信號(hào)肽由于密碼子偏嗜性的原因，致使0RF2蛋白在E.coli中的表達(dá)量非常低，失去了大規(guī)模商業(yè)應(yīng)用的可能。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明提供一種基于大腸桿菌來(lái)源的、抗原表位的選擇符合中國(guó)豬圓環(huán)病毒特征的PCV2型的N端截短衣殼蛋白PCV2 0RF2基因。基于本實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)，通過(guò)序列優(yōu)化，對(duì)PCV2衣殼蛋白原核表達(dá)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)N端截短一直到27個(gè)氨基酸的衣殼蛋白依然能組裝成病毒樣顆粒。
[0006]本發(fā)明要求保護(hù)的截短衣殼蛋白PCV2 0RF2基因具有如Seq ID N0.1、2、3、4、5、6、
7、8、9所示核苷酸序列。
[0007]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案，該基因表達(dá)的蛋白能夠在大腸桿菌內(nèi)自組裝成病毒樣顆粒。
[0008]本發(fā)明的第二方面，提供截短的PCV2 0RF2衣殼蛋白，具有如Seq IDN0.10、11、12、13、14、15、16、17、18所示的序列。其中，基因序列Seq ID N0.1對(duì)應(yīng)于蛋白序列Seq IDN0.10 ;基因序列Seq ID N0.2對(duì)應(yīng)于蛋白序列Seq ID N0.11 ;基因序列Seq ID N0.3對(duì)應(yīng)于蛋白序列Seq ID N0.12 ;基因序列Seq ID N0.4對(duì)應(yīng)于蛋白序列Seq ID N0.13 ;基因序列Seq IDN0.5對(duì)應(yīng)于蛋白序列Seq ID N0.14 ;基因序列Seq ID N0.6對(duì)應(yīng)于蛋白序列Seq ID N0.15 ；基因序列Seq ID N0.7對(duì)應(yīng)于蛋白序列Seq ID N0.16 ;基因序列Seq ID N0.8對(duì)應(yīng)于蛋白序列Seq ID N0.17 ;基因序列Seq ID N0.9對(duì)應(yīng)于蛋白序列Seq ID N0.18。
[0009]本發(fā)明的第三方面，提供一種含有本發(fā)明截短的PCV2 0RF2基因的表達(dá)載體。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案，所述表達(dá)載體為適于在大腸桿菌中表達(dá)的載體。
[0011]本發(fā)明的第四方面，提供一種含本發(fā)明截短的PCV2 0RF2基因的表達(dá)載體的細(xì)胞。
[0012]本發(fā)明的第五方面，提供一種制備純化截短的PCV2 0RF2基因表達(dá)的衣殼蛋白的方法，包括如下步驟:
[0013](I)在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中可溶表達(dá)截短的PCV2 0RF2基因，
[0014](2)將表達(dá)了截短的PCV2 0RF2衣殼蛋白的大腸桿菌破碎，分離得到上清液，
[0015](3)用含有氯化鉀的硫酸銨分級(jí)分離，結(jié)合色譜層析純化目的蛋白。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案，所述步驟(3)用硫酸銨分級(jí)分離為先用含有氯化鉀的30%硫酸銨沉淀除去部分雜蛋白，然后用含有氯化鉀的50%硫酸銨沉淀粗目的蛋白，最后，將上述目的蛋白在150mM — 2500mM鹽溶液中重新溶解，離心沉淀得到目的蛋白。
[0017]根據(jù)本發(fā)明的一 個(gè)技術(shù)方案，將鹽溶液的重懸上清液通過(guò)濾膜過(guò)濾，進(jìn)一步通過(guò)色譜層析純化目的蛋白。
[0018]本發(fā)明的第六方面，提供一種經(jīng)過(guò)N端截短的PCV2 0RF2類病毒顆粒，其中該類病毒顆粒含有本發(fā)明PCV2 0RF2基因表達(dá)的N端截短的蛋白。
[0019]本發(fā)明的第七方面，提供一種用于預(yù)防PCV2感染的疫苗，其包括:PCV2病毒樣顆粒及疫苗用賦形劑或載體。
[0020]本發(fā)明的第八方面，提供一種預(yù)防PCV2感染的方法，其包括將含預(yù)防有效量的本發(fā)明N端截短的PCV2 0RF2基因表達(dá)的衣殼蛋白或病毒樣顆粒疫苗給予需要預(yù)防PCV2感染的豬。
[0021]本發(fā)明提供一種基于大腸桿菌來(lái)源的、抗原表位的選擇符合中國(guó)豬圓環(huán)病毒特征的PCV2b型別的衣殼蛋白高效表達(dá)的方法?；诒緦?shí)驗(yàn)室的技術(shù)，通過(guò)截短N(yùn)端序列，對(duì)原核表達(dá)PCV 0RF2蛋白進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)N端截短一直到27個(gè)氨基酸的衣殼蛋白依然能組裝成直徑約15-20nm的病毒樣顆粒，
[0022]本發(fā)明的制備純化N端截短的PCV2 0RF2基因表達(dá)的衣殼蛋白的方法，利用硫酸銨分級(jí)分離沉淀的方法對(duì)目的蛋白進(jìn)行初步純化。與其它的沉淀方法相比，該方法較為溫和，一般認(rèn)為不會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)造成破壞。此外，在目的蛋白復(fù)溶時(shí)，也采用了不含變性劑的復(fù)溶液，這也進(jìn)一步保持了 N端截短的0RF2蛋白的天然活性。通過(guò)沉淀，復(fù)溶兩個(gè)步驟，目的蛋白得到顯著富集純化，其占總蛋白的含量從20%上升到了 50%左右，為進(jìn)行色譜精純奠定了良好的基礎(chǔ)。而且，在上述初步純化的過(guò)程中，沒(méi)有使用諸如尿素等變性劑，目的蛋白的活性得到了最大程度的保護(hù)。在色譜純化過(guò)程中，整個(gè)工藝流程簡(jiǎn)單，無(wú)需進(jìn)行緩沖液置換等步驟，也無(wú)需特殊的色譜介質(zhì)，并且兩步色譜的回收接近30%，使得以工業(yè)化規(guī)模可溶性表達(dá)純化N端截短的PCV 0RF2蛋白成為可能，而且整個(gè)工藝過(guò)程中，均未涉及到變性劑，純化過(guò)程和組裝過(guò)程均不會(huì)對(duì)蛋白的構(gòu)象產(chǎn)生影響和破壞病毒樣顆粒的中和表位，這樣生產(chǎn)的病毒樣顆粒具有高度的免疫原性，免疫機(jī)體后會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的中和抗體，對(duì)免疫動(dòng)物起到很好的保護(hù)性效果。
[0023]本研究在大腸桿菌中以可溶性表達(dá)N端截短的PCV2 0RF2蛋白，并在此基礎(chǔ)上，建立了一套高效、適宜放大的PCV2疫苗中試生產(chǎn)工藝。建立了一套N端截短的PCV2 VLP疫苗質(zhì)量研究體系，并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)大腸桿菌來(lái)源的N端截短的PCV2 VLP疫苗的有效性，穩(wěn)定性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。
[0024]本發(fā)明中相關(guān)術(shù)語(yǔ)的說(shuō)明及解釋
[0025]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)”是指由大腸桿菌(菌株)與載體組成，其中大腸桿菌(菌株)來(lái)源于市場(chǎng)上可得到的，在此舉例但不限于:GI698，ER2566，BL21(DE3)，B834(DE3)，BLR (DE3)。
[0026]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“載體”一詞指的是，可將某編碼蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白獲得表達(dá)的一種核酸運(yùn)載工具。載體可以通過(guò)轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)導(dǎo)或者轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，使其攜帶的遺傳物質(zhì)元件在宿主細(xì)胞中獲得表達(dá)。舉例來(lái)說(shuō)，載體包括:質(zhì)粒，噬菌體，柯斯質(zhì)粒等等。
[0027]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“疫苗用賦形劑或載體”是指選自一種或多種，包括但不限于:pH調(diào)節(jié)劑，表面活性劑，佐劑，離子強(qiáng)度增強(qiáng)劑。例如，pH調(diào)節(jié)劑舉例但不限于磷酸鹽緩沖液，表面活性劑包括陽(yáng)離子，陰離子或者非離子型表面活性劑。舉例但不限于:TWeen-80。佐劑舉例但不限于氫氧化鋁，氟氏完全佐劑。離子強(qiáng)度增強(qiáng)劑舉例但不限于氯化鈉。
[0028]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“色譜層析”包括但不限于:離子交換色譜(例如陽(yáng)離子交換色譜)、疏水相互作用色譜、吸附層析法(例如羥基磷灰石色譜)、凝膠過(guò)濾(凝膠排阻)層析、親和層析法。
[0029]根據(jù)本發(fā)明，在本發(fā)明獲得的N端截短的PCV2 0RF2蛋白的方法中，緩沖液是指可在一定范圍內(nèi)維持PH值穩(wěn)定的溶液，包括但不限于，Tris緩沖液，磷酸鹽緩沖液，HEPES緩沖液，MOPS緩沖液等等。
[0030]根據(jù)本發(fā)明，所述原核宿主細(xì)胞破碎包括但不限于通過(guò)勻漿器破碎、均質(zhì)機(jī)破碎、超聲波處理、研磨、高壓擠壓、溶菌酶處理中的一項(xiàng)或者多項(xiàng)方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0031]根據(jù)本發(fā)明，在本發(fā)明獲得的N端截短的PCV2 0RF2蛋白的方法中，所用的鹽包括但不限于是中性鹽，特別是堿金屬鹽、銨鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽，硫酸鹽，碳酸氫鹽，磷酸鹽或磷酸氫鹽，特別是NaCl、KC1、NH4C1、(NH4)2SO4中的一種或幾種，優(yōu)選NaCl。
[0032]根據(jù)本發(fā)明，N端截短的PCV2 0RF2蛋白類病毒顆粒如下獲得:將上述純度至少50% N端截短的PCV2 0RF2蛋白溶液通過(guò)例如色譜層析進(jìn)一步分離，得到純化的N端截短的PCV2 0RF2蛋白溶液。N端截短的PCV2 0RF2的類病毒顆粒組裝的方式包括但不限于本領(lǐng)域已知技術(shù)，例如，透析，超濾或者層析等。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0033]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述:
[0034]圖1為各個(gè)截短的PCV2 0RF2蛋白經(jīng)過(guò)純化后的SDS-PAGE結(jié)果。I，經(jīng)本發(fā)明純化所得PCV2N3C蛋白上樣2 μ I ;2，經(jīng)本發(fā)明純化所得PCV2N6C蛋白上樣2 μ I ;3，經(jīng)本發(fā)明純化所得？(^2_(:蛋白上樣2 4 1 ;4，經(jīng)本發(fā)明純化所得PCV2N12C蛋白上樣2μ I ;5，經(jīng)本發(fā)明純化所得PCV2N15C蛋白上樣2 μ I ;6，經(jīng)本發(fā)明純化所得PCV2N18C蛋白上樣2 μ I ;7，經(jīng)本發(fā)明純化所得PCV2N21C蛋白上樣2μ I ;8，經(jīng)本發(fā)明純化所得PCV2N24C蛋白上樣2 μ I ;9，經(jīng)本發(fā)明純化所得PCV2N27C蛋白上樣2 μ I。
[0035]圖2為本發(fā)明所得的PCV2N3C VLPs病毒樣顆粒透射電鏡觀察(40，000倍)結(jié)果。視野中可見大量半徑為9nm左右的病毒樣顆粒，顆粒實(shí)際大小與理論大小相符，表觀狀態(tài)均勻一致。
[0036]圖3為本發(fā)明所得的PCV2N6C VLPs病毒樣顆粒透射電鏡觀察(40，000倍)結(jié)果。視野中可見大量半徑為9nm左右的病毒樣顆粒，顆粒實(shí)際大小與理論大小相符，表觀狀態(tài)均勻一致。
[0037]圖4為本發(fā)明所得的PCV2N9C VLPs病毒樣顆粒透射電鏡觀察(40，000倍)結(jié)果。視野中可見大量半徑為9nm左右的病毒樣顆粒，顆粒實(shí)際大小與理論大小相符，表觀狀態(tài)均勻一致。
[0038]圖5為本發(fā)明所得的PCV2N12C VLPs病毒樣顆粒透射電鏡觀察(40，000倍)結(jié)果。視野中可見大量半徑為9nm左右的病毒樣顆粒，顆粒實(shí)際大小與理論大小相符，表觀狀態(tài)均勻一致。
[0039]圖6為本發(fā)明所得的PCV2N15C VLPs病毒樣顆粒透射電鏡觀察(40，000倍)結(jié)果。視野中可見大量半徑為9nm左右的病毒樣顆粒，顆粒實(shí)際大小與理論大小相符，表觀狀態(tài)均勻一致。
[0040]圖7為本發(fā)明 所得的PCV2N18C VLPs病毒樣顆粒透射電鏡觀察(40，000倍)結(jié)果。視野中可見大量半徑為9nm左右的病毒樣顆粒，顆粒實(shí)際大小與理論大小相符，表觀狀態(tài)均勻一致。
[0041]圖8為本發(fā)明所得的PCV2N21C VLPs病毒樣顆粒透射電鏡觀察(40，000倍)結(jié)果。視野中可見大量半徑為9nm左右的病毒樣顆粒，顆粒實(shí)際大小與理論大小相符，表觀狀態(tài)均勻一致。
[0042]圖9為本發(fā)明所得的PCV2N24C VLPs病毒樣顆粒透射電鏡觀察(40，000倍)結(jié)果。視野中可見大量半徑為9nm左右的病毒樣顆粒，顆粒實(shí)際大小與理論大小相符，表觀狀態(tài)均勻一致。
[0043]圖10為本發(fā)明所得的PCV2N27C VLPs病毒樣顆粒透射電鏡觀察(40，000倍)結(jié)果。視野中可見大量半徑為9nm左右的病毒樣顆粒，顆粒實(shí)際大小與理論大小相符，表觀狀態(tài)均勻一致。
[0044]圖 11 為 PCV2N3C VLPs, PCV2N6C VLPs, PCV2N9C VLPs, PCV2N12C VLPs, PCV2N15CVLPs，PCV2N18C VLPs，PCV2N21C VLPs，PCV2N24C VLPs，PCV2N27C VLPs 接種兔后不同階段血清總抗體滴度。在初免三個(gè)星期后，總抗滴度即有明顯上升，在經(jīng)過(guò)一次加強(qiáng)免疫后，抗體的滴度即能達(dá)到IO7的高水平。
[0045]注:PCV2_N3C表示N端截短3個(gè)氨基酸表達(dá)的病毒樣顆粒；PCV_N6C表示N端截短6個(gè)氨基酸表達(dá)的病毒樣顆粒；以此類推，PCV-N9C、PCV-N12C、PCV-N15C、PCV-N18C、PCV-N21C、PCV-N24C、PCV-N27C，分別表示 N 端截短 9、12、15、18、21、24、27 個(gè)氨基酸表達(dá)的
的病毒樣顆粒?！揪唧w實(shí)施方式】
[0046]以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)上述方案做進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例是用于說(shuō)明本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中采用的實(shí)施條件可以根據(jù)具體廠家的條件做進(jìn)一步調(diào)整，未注明的實(shí)施條件通常為常規(guī)實(shí)驗(yàn)中的條件。
[0047]材料及試劑:本發(fā)明中涉及基因合成的由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成，pET載體購(gòu)于Novagen公司，50L發(fā)酵罐購(gòu)于上海保興生物公司，其它試劑及藥品為普通市售產(chǎn)品O
[0048]實(shí)施例1:具有序列1-9的N端截短的PCV2 0RF2基因的蛋白表達(dá)
[0049]1.1用做模板的PCV2 0RF2基因片段的制備
[0050]經(jīng)過(guò)大腸桿菌密碼子優(yōu)化的PCV2 0RF2基因全長(zhǎng)由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。所合成的基因片段全長(zhǎng)為702bp。在此人工合成的PCV2 0RF2基因片段的基礎(chǔ)上制備本發(fā)明N端截短的PCV2 0RF2基因的模板。
[0051]1.2N端截短的PCV2 0RF2基因的非融合表達(dá)載體的構(gòu)建
[0052]以前一步驟所合成的PCV2 0RF2全長(zhǎng)基因片段用做PCR反應(yīng)的模板。分別以PCV2-N3F, PCV2-N6F, PCV2-N9F, PCV2-N12F, PCV2-N15F, PCV2-N18F, PCV2-N21F, PCV2-N24F 和PCV2-N27F為正向引物，以PCV2-R為反向引物，擴(kuò)增獲得N端截短的PCV2 0RF2基因。正向弓丨物的5’端引入限制性內(nèi)切酶Nde I位點(diǎn)及保護(hù)性堿基，其中Nde I位點(diǎn)序列為CATATG，ATG為大腸桿菌系統(tǒng)中的 起始密碼子；反向引物的5’端引入限制性內(nèi)切酶Xho I位點(diǎn)及保護(hù)性堿基，其中Xho I位點(diǎn)序列為CTCGAG。
[0053]
【權(quán)利要求】
1.一系列N端截短的PCV2 0RF2基因，其經(jīng)過(guò)優(yōu)化后的核苷酸序列如Seq ID N0.1、2、3、4、5、6、7、8、9 所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的截短的PCV20RF2基因，其中該基因表達(dá)的蛋白能夠在大腸桿菌內(nèi)自組裝成病毒樣顆粒。
3.九種截短的PCV2 0RF2 衣殼蛋白，具有如 Seq ID N0.10、11、12、13、14、15、16、17、18所示的序列。
4.含有權(quán)利要求1所述基因的表達(dá)載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體,所述表達(dá)載體為適于在大腸桿菌中表達(dá)的載體。
6.含有權(quán)利要求4表達(dá)載體的細(xì)胞。
7.一種制備純化截短PCV2 ORF2基因表達(dá)的衣殼蛋白的方法，包括如下步驟: (1)在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中可溶表達(dá)截短的PCV2-ORF2基因， (2)將表達(dá)了截短的PCV2ORF2衣殼蛋白的大腸桿菌破碎，分離得到上清液， (3)用含有氯化鉀的硫酸銨分級(jí)分離，結(jié)合色譜層析純化目的蛋白。
8.九種經(jīng)過(guò)截短的PCV2ORF2類病毒顆粒，其中該類病毒顆粒含有權(quán)利要求1或2基因表達(dá)的蛋白或者包含權(quán)利要求3的蛋白。
9.一種用 于預(yù)防PCV2感染的疫苗，其包括:(I)權(quán)利要求8的PCV20RF2病毒樣顆粒，及疫苗用賦形劑或載體。
10.一種預(yù)防PCV2感染的方法，其包括將含預(yù)防有效量的權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)的PCV2ORF2衣殼蛋白或權(quán)利要求8的病毒樣顆粒的疫苗或預(yù)防有效量的權(quán)利要求9的疫苗給予需要預(yù)防PCV2感染的豬。
【文檔編號(hào)】C07K1/30GK104017813SQ201410243261
【公開日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2014年6月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月3日
【發(fā)明者】袁于人, 莫小兵 申請(qǐng)人:斯澳生物科技（蘇州）有限公司