一種制備冬蟲夏草多糖肽的方法
【專利摘要】本發明涉及一種制備冬蟲夏草多糖肽的方法，取以冬蟲夏草純粉為原料的水提取液，將其濃縮、離心、透析、截留而獲得的含有高分子量多糖肽。用濃度為1％的冬蟲夏草多糖肽溶液，緩慢滴加無水乙醇至1∶0.5(V/V)，離心，分級沉淀，干燥得第1級成分為冬蟲夏草多糖肽1。取上清液再滴加無水乙醇至1︰1(V/V)同上處理，收集33～50％的沉淀，干燥得第2級成分為冬蟲夏草2；將上清液繼續再加乙醇至1︰1.5(V/V)，得第3級成分冬蟲夏草3，取冬蟲夏草3以1∶10比例加水微熱溶解，通過多次柱分離，透析12～20h，取袋內液濃縮，沉淀，離心，收集沉淀部分，冷凍干燥，得冬蟲夏草多糖肽。本發明自行制備冬蟲夏草多糖肽對照品，可將其應用于該類產品的測定。
【專利說明】一種制備冬蟲夏草多糖肽的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種多糖肽，尤其是一種制備冬蟲夏草多糖肽的方法。
【背景技術】
[0002] 冬蟲夏草是極為名貴的補益藥和保健極品，因含有蟲草素、蟲草酸、腺苷、蟲草多 糖、S0D等多種已知和尚在被發現生物活性物質以及氨基酸、多種微量元素和維生素等有 效成分，具有鎮靜、止咳化痰和抑制腫瘤細胞生長、增加機體對健身防病有著特有免疫的功 效，是與人參、鹿茸齊名的三大珍品。
[0003] 肽是蛋白質的初級形式，幾乎涉及人體激素、神經、生長、生殖等生命的全過程，具 有調節機體功能，維持生命活動的活性物質。
[0004] 多糖肽是一種糖蛋白，是多糖與蛋白質的結合體。一般含有很高比例的多糖，它們 被看做是糖胺多糖，具有很高的分子量，由雙糖的重復單元組成。多糖肽具有很強生物活 性，初步研究多糖肽能增強機體免疫功能，具有抗腫瘤作用和抗氧化作用。
[0005] 冬蟲夏草是我國青藏高原雪域地帶特有的一種天然、野生、具有珍貴知識產權的 蟲草，也稱極草。任何人工培育蛹蟲草或蟲草菌絲體都無法與其相提并論，更不能被冠以 "冬蟲夏草"。自行制備冬蟲夏草多糖肽對照品（純度大于95%)，并將其應用于該類產品 的測定，該研究尚未見記載。
【發明內容】
[0006] 本發明目的是提供一種制備冬蟲夏草多糖肽的方法，自行制備冬蟲夏草多糖 肽對照品（純度大于95% )，并將其應用于該類產品的測定，且通過蒸發光散射檢測器 (HPLC-ELSD)對冬蟲夏草樣品中的多糖肽成分進行定性與定量分析。
[0007] 本發明采用如下技術方案：一種制備冬蟲夏草多糖肽的方法，該方法包括以下步 驟：
[0008] 步驟1 :取以冬蟲夏草純粉為原料的水提取液，將其濃縮、離心、透析、截留而獲得 的含有高分子量多糖肽；
[0009] 步驟2 :取步驟1中濃度為1 %的含有高分子量多糖肽的冬蟲夏草多糖肽溶液， 在不斷攪拌中緩慢滴加無水乙醇至體積百分比為1 : 0.5 (V/V)，置:TC?5°C溫度下存放 12-20h，用10000-12000rpm離心，用無水乙醇分級沉淀，收集33%乙醇沉淀部分，置冰箱真 空干燥得第1級成分為冬蟲夏草多糖肽1 ;
[0010] 步驟3:取步驟2中的冬蟲夏草多糖肽1上清液再滴加無水乙醇至1 : 1(V/V)，用 無水乙醇分級沉淀，收集33?50%的沉淀，置:TC?5°C溫度下存放12-20h，真空干燥后得 第2級成分為冬蟲夏草2;將冬蟲夏草2上清液繼續再加乙醇至1 : 1.5 (V/V)，得第3級成 分冬蟲夏草3,置真空干燥得冬蟲夏草多糖肽粗品。
[0011] 步驟4 :取冬蟲夏草多糖肽粗品以1 : 10比例（V/V)加水微熱溶解，離心去雜，通 過聚丙烯胺凝膠至少2次柱分離，用含50mol ?L-lNaCl的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液， 透析12?20h，取袋內液濃縮，用三倍無水乙醇沉淀，離心，收集沉淀部分，在-16°C?-20°C 溫度下干燥，得淺褐色粉末狀物質為冬蟲夏草多糖肽。
[0012] 經HPLC制備單峰，并用HPLC-PDA/ELSD檢測結果為冬蟲夏草多糖肽單峰，純度在 95%以上。
[0013] 上述步驟⑷中采用10000-12000rpm離心去雜。
[0014] 上述步驟（4)中含50mol · LlaCl的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液其pH = 5. 8-6. 0,濃度為0· 2mol/L時效果最佳。
[0015] 上述步驟（4)中聚丙烯胺凝膠采用Bio-Gel系列時效果最佳。
[0016] 上述對本發明結構和方法的描述可知，和現有技術相比，本發明具有如下優點：其 一，本發明自行制備冬蟲夏草多糖肽對照品（純度大于95%)，可將其應用于該類產品的測 定。其二，本發明可通過蒸發光散射檢測器（HPLC-ELSD)對冬蟲夏草樣品中的多糖肽成分 進行定性與定量分析。其三，本發明樣品前處理簡單快捷、省時省力，有利于冬蟲夏草產品 中多糖肽成分的準確定性與定量。其四，本發明的方法操作簡便，回收率高，重復性好，結果 準確可靠，有利于冬蟲夏草產品中保健功能因子的鑒定分析。
【具體實施方式】
[0017] 實施例一：
[0018] 一種制備冬蟲夏草多糖肽的方法，該方法包括以下步驟：
[0019] 步驟1 :取以冬蟲夏草純粉為原料的水提取液，將其濃縮、離心、透析、截留而獲得 的含有高分子量多糖肽；
[0020] 步驟2 :取步驟1中濃度為1 %的含有高分子量多糖肽的冬蟲夏草多糖肽溶液，在 不斷攪拌中緩慢滴加無水乙醇至體積百分比為1 : 0.5(v/v)，置：TC溫度下存放12h，用 lOOOOrpm離心，用無水乙醇分級沉淀，收集33 %乙醇沉淀部分，置冰箱真空干燥得第1級成 分為冬蟲夏草多糖肽1 ;
[0021] 步驟3:取步驟2中的冬蟲夏草多糖肽1上清液再滴加無水乙醇至1 : 1(V/V)，用 無水乙醇分級沉淀，收集33?50%的沉淀，置:TC溫度下存放12h，真空干燥后得第2級成 分為冬蟲夏草2;將冬蟲夏草2上清液繼續再加乙醇至1 : 1.5 (V/V)，得第3級成分冬蟲夏 草3,置真空干燥得冬蟲夏草多糖肽粗品。
[0022] 步驟4 :取冬蟲夏草多糖肽粗品以1 : 10比例加水微熱溶解，采用lOOOOrpm離心 去雜，通過聚丙烯胺凝膠至少2次柱分離，用含50mol ?PNaCl的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉 緩沖液，透析12h，取袋內液濃縮，用三倍無水乙醇沉淀，離心，收集沉淀部分，在-16°C溫 度下干燥，得淺褐色粉末狀物質為冬蟲夏草多糖肽。
[0023] 經HPLC制備單峰，并用HPLC-PDA/ELSD檢測結果為冬蟲夏草多糖肽單峰，純度在 95%以上。
[0024] 步驟⑷中含50mol · LlaCl的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液其pH = 5. 8,濃 度為0.2mol/L時效果較佳。
[0025] 步驟（4)中聚丙烯胺凝膠采用Bio-Gel系列時效果最佳。
[0026] 本發明自行制備冬蟲夏草多糖肽對照品（純度大于95% )，可將其應用于該類產 品的測定。本發明可通過蒸發光散射檢測器（HPLC-ELSD)對冬蟲夏草樣品中的多糖肽成分 進行定性與定量分析。本發明樣品前處理簡單快捷、省時省力，有利于冬蟲夏草產品中多糖 肽成分的準確定性與定量。本發明的方法操作簡便，回收率高，重復性好，結果準確可靠，有 利于冬蟲夏草產品中保健功能因子的鑒定分析。
[0027] 實施例二：
[0028] 步驟1 :取以冬蟲夏草純粉為原料的水提取液，將其濃縮、離心、透析、截留而獲得 的含有高分子量多糖肽；
[0029] 步驟2 :取步驟1中濃度為1 %的含有高分子量多糖肽的冬蟲夏草多糖肽溶液，在 不斷攪拌中緩慢滴加無水乙醇至體積百分比為1 : 〇.5(V/V)，置4°C溫度下存放16h，用 llOOOrpm離心，用無水乙醇分級沉淀，收集33%乙醇沉淀部分，置冰箱真空干燥得第1級成 分為冬蟲夏草多糖肽1 ;
[0030] 步驟3:取步驟2中的冬蟲夏草多糖肽1上清液再滴加無水乙醇至1 : 1(V/V)，用 無水乙醇分級沉淀，收集33?50%的沉淀，置4°C溫度下存放16h，真空干燥后得第2級成 分為冬蟲夏草2;將冬蟲夏草2上清液繼續再加乙醇至1 : 1.5 (V/V)，得第3級成分冬蟲 夏草3,置真空干燥得冬蟲夏草多糖肽粗品。
[0031] 步驟4 :取冬蟲夏草多糖肽粗品以1 : 10比例加水微熱溶解，采用llOOOrpm離心 去雜，通過聚丙烯胺凝膠4次柱分離，用含50mol 的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖 液，透析16h，取袋內液濃縮，用三倍無水乙醇沉淀，離心，收集沉淀部分，在-18°C溫度下干 燥，得淺褐色粉末狀物質為冬蟲夏草多糖肽。
[0032] 經HPLC制備單峰，并用HPLC-PDA/ELSD檢測結果為冬蟲夏草多糖肽單峰，純度在 95%以上。
[0033] 步驟⑷中含50mol · LlaCl的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液其pH = 5. 9,濃 度為0.2mol/L時效果較佳。
[0034] 步驟（4)中聚丙烯胺凝膠采用Bio-Gel系列時效果最佳。
[0035] 該冬蟲夏草多糖肽可在測定冬蟲夏草產品質量中應用。
[0036] 實施例三：
[0037] -種制備冬蟲夏草多糖肽的方法，該方法包括以下步驟：
[0038] 步驟1 :取以冬蟲夏草純粉為原料的水提取液，將其濃縮、離心、透析、截留而獲得 的含有高分子量多糖肽；
[0039] 步驟2 :取步驟1中濃度為1 %的含有高分子量多糖肽的冬蟲夏草多糖肽溶液，在 不斷攪拌中緩慢滴加無水乙醇至體積百分比為1 : 〇.5(V/V)，置5°C溫度下存放20h，用 12000rpm離心，用無水乙醇分級沉淀，收集33 %乙醇沉淀部分，置冰箱真空干燥得第1級成 分為冬蟲夏草多糖肽1 ;
[0040] 步驟3:取步驟2中的冬蟲夏草多糖肽1上清液再滴加無水乙醇至1 : 1(V/V)，用 無水乙醇分級沉淀，收集33?50%的沉淀，置5°C溫度下存放20h，真空干燥后得第2級成 分為冬蟲夏草2;將冬蟲夏草2上清液繼續再加乙醇至1 : 1.5 (V/V)，得第3級成分冬蟲夏 草3,置真空干燥得冬蟲夏草多糖肽粗品。
[0041] 步驟4 :取冬蟲夏草多糖肽粗品以1 : 10比例加水微熱溶解，采用12000rpm離心 去雜，通過聚丙烯胺凝膠6次柱分離，用含50mol 的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖 液，透析20h，取袋內液濃縮，用三倍無水乙醇沉淀，離心，收集沉淀部分，在-20°C溫度下干 燥，得淺褐色粉末狀物質為冬蟲夏草多糖肽。
[0042] 經HPLC制備單峰，并用HPLC-PDA/ELSD檢測結果為冬蟲夏草多糖肽單峰，純度在 95%以上。
[0043] 上述步驟（4)中含50mol ?PNaCl的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液其pH = 6. 0， 濃度為〇. 2mol/L時效果較佳。
[0044] 步驟（4)中聚丙烯胺凝膠采用Bio-Gel系列時效果最佳。
[0045] 該冬蟲夏草多糖肽可在測定冬蟲夏草產品質量中應用。
[0046] 上述僅為本發明的【具體實施方式】，但本發明的設計構思并不局限于此，凡利用此 構思對本發明進行非實質性的改動，均應屬于侵犯本發明保護范圍的行為。
【權利要求】
1. 一種制備冬蟲夏草多糖肽的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟： (1) 取以冬蟲夏草純粉為原料的水提取液，將其濃縮、離心、透析、截留而獲得的含有高 分子量多糖肽； (2) 取步驟（1)中濃度為1 %的含有高分子量多糖肽的冬蟲夏草多糖肽溶液，在不斷 攪拌中緩慢滴加無水乙醇至體積百分比為1 : 0. 5,置3°C?5°C溫度下存放12-20h，用 10000-12000rpm離心，用無水乙醇分級沉淀，收集33%乙醇沉淀部分，置冰箱真空干燥得 第1級成分為冬蟲夏草多糖肽1 ; (3) 取（2)步驟中的冬蟲夏草多糖肽1上清液再滴加無水乙醇至體積百分比為1 : 1， 用無水乙醇分級沉淀，收集33?50%的沉淀，置:TC?5°C溫度下存放12-20h，真空干燥后 得第2級成分為冬蟲夏草2 ;將冬蟲夏草2上清液繼續再加乙醇至體積百分比為1 : 1. 5， 得第3級成分冬蟲夏草3,置真空干燥得冬蟲夏草多糖肽粗品； (4) 取冬蟲夏草多糖肽粗品以1 : 10比例加水微熱溶解，離心去雜，通過聚丙烯胺凝 膠至少2次柱分離，用含50mol · L-lNaCl的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，透析12? 20h，取袋內液濃縮，用三倍無水乙醇沉淀，離心，收集沉淀部分，在-16°C?-20°C溫度下干 燥，得淺褐色粉末狀物質為冬蟲夏草多糖肽。
2. 按照權利要求1所述的一種制備冬蟲夏草多糖肽的方法，其特征是：經HPLC制備單 峰，并用HPLC-PDA/ELSD檢測結果為冬蟲夏草多糖肽單峰，純度在95%以上。
3. 按照權利要求1所述的一種制備冬蟲夏草多糖肽的方法，其特征是：所述步驟（4) 中采用10000-12000rpm離心去雜。
4. 按照權利要求1所述的一種制備冬蟲夏草多糖肽的方法，其特征是：所述步驟（4) 中的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液其pH = 5. 8-6. 0,濃度為0. 2mol/L時效果最佳。
5. 按照權利要求1所述的一種制備冬蟲夏草多糖肽的方法，其特征是：所述步驟（4) 中聚丙烯胺凝膠采用Bio-Gel系列時效果最佳。
【文檔編號】C07K1/36GK104151395SQ201410213401
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年5月20日 優先權日:2014年5月20日
【發明者】黃宏南, 林冬梅, 王賽貞, 羅虹建, 林樹錢 申請人:黃宏南