一種碳-13同位素標(biāo)記的溴化膦化合物及制備方法和應(yīng)用的制作方法【專利摘要】本發(fā)明涉及一種結(jié)構(gòu)式(I)的碳-13同位素標(biāo)記的溴化膦化合物及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明所述的碳-13同位素標(biāo)記的溴化膦化合物(C13-TMPP-Ac-OSu)與C12-TMPP-Ac-OSu配合使用，通過質(zhì)譜分析在從頭測序鑒定多肽的同時(shí)，利用含有兩種不同標(biāo)記物的同一多肽在質(zhì)譜中出現(xiàn)的2個(gè)信號峰強(qiáng)度進(jìn)行定量分析，從而實(shí)現(xiàn)多肽的從頭測序與蛋白質(zhì)定量分析的同步進(jìn)行，其分析方法簡單，穩(wěn)定性好，精確度高?！緦＠f明】—種碳-13同位素標(biāo)記的溴化膦化合物及制備方法和應(yīng)用【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及一種碳-13同位素標(biāo)記的溴化膦化合物及制備方法和蛋白質(zhì)定量應(yīng)用，屬于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析領(lǐng)域?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]基于現(xiàn)代生物質(zhì)譜的蛋白質(zhì)定量分析技術(shù)已經(jīng)成為目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究必不可少的重要工具，可聞效測定細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組的動態(tài)變化、研究蛋白質(zhì)功能、揭不細(xì)胞生物機(jī)理、尋找疾病蛋白標(biāo)記物和藥物靶標(biāo)。近年來各種基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)定量策略和方法層出不窮，如雙向凝膠電泳定量方法(twodimensionalelectrophoresis,2-DE)、體內(nèi)同位素代謝標(biāo)記法(stableisotopelabelingwithaminoacidsincellculture,SILAC)、同位素化學(xué)標(biāo)記法(isobarictagsforrelativeandabsolutequantification,iTRAQ)>同位素標(biāo)簽標(biāo)記定量法(isotopecodedaffinitytag,ICAT)等?；谫|(zhì)譜的同位素標(biāo)記定量方法是目前蛋白質(zhì)質(zhì)譜定量分析的重要方法，其核心是輕同位素試劑(如C12和N14)和重同位素試劑(如C13和N15)分別化學(xué)性標(biāo)記從不同疾病及其對照組蛋白質(zhì)酶切消化的肽段N末端，輕重標(biāo)記的2種樣品同比例混合后，使用LC-MS/MS分析，同時(shí)定量并鑒定所有的肽段.[0003]但是，這些基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)穩(wěn)定同位素標(biāo)記定量分析方法都是針對現(xiàn)有的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行后續(xù)的蛋白質(zhì)鑒定和定量，對于很多基因組未測序的物種的蛋白質(zhì)鑒定及定量分析無能為力。[0004]多肽從頭測序方法(peptidedenovosequencing)能解決現(xiàn)有基于質(zhì)譜的多肽序列分析方法主要依賴已有的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫，對于數(shù)據(jù)庫中不存在的蛋白序列鑒定無能為力的問題，在近年來逐漸受到人們重視。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道《High-confidencedenovopeptidesequencingusingpositivechargederivatizationandtandemMSspectramerging.》(AnM,ZouX，WangQ,ZhaoX，WuJ,XuLM,ShenHY,XiaoX,HeD,JiJ.AnalChem.2013May7；85(9):4530-7.),((Efficientandcleanchargederivatizationofpeptidesforanalysisbymassspectrometry.》(AnM,DaiJ,WangQ,TongY,JiJ.RapidCommunMassSpectrom.2010Jull5；24(13):1869-74.)使用(N_玻拍酸亞胺基氧代羰基甲基)三(2，4，6-三甲氧苯基)溴化膦((N-Succinimidyloxycarbonylmethyl)tris(2,4,6-trimethoxyphenyl)phosphoniumbromide,TMPP-Ac-OSu)專一地對蛋白質(zhì)N端進(jìn)行化學(xué)標(biāo)記，結(jié)合質(zhì)譜檢測分析實(shí)現(xiàn)多肽序列的從頭測序，達(dá)到精確和高可信度鑒定蛋白的目的。而且，TMPP-Ac-OSu對多肽N端的特異標(biāo)記能簡化質(zhì)譜MS/MS串聯(lián)譜圖，在基因組未測序種屬中蛋白質(zhì)的從頭測序方面具有重要應(yīng)用。[0005]但是，目前商品化的TMPP-Ac-OSu試劑為C12標(biāo)記(C12-TMPP-Ac_0Su)，基于此標(biāo)記試劑的質(zhì)譜分析僅能獲得高可信度的從頭測序鑒定，不能同時(shí)進(jìn)行蛋白質(zhì)定量比較分析。[0006]因此，開發(fā)一種在多肽從頭測序的同時(shí)實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)定量的方法能很好填補(bǔ)這一缺陷，在蛋白質(zhì)序列鑒定和定量分析領(lǐng)域具有十分重要的意義?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0007]為了克服上述技術(shù)缺陷，本發(fā)明提供了一種碳-13同位素標(biāo)記的溴化膦化合物(C13-TMPP-Ac-0Su)，將其標(biāo)記的多肽與商品化C12_TMPP-Ac-0Su標(biāo)記的多肽按照同比例混合后，通過質(zhì)譜分析可在從頭測序鑒定該多肽的同時(shí)，對多肽蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析，從而同時(shí)實(shí)現(xiàn)多肽的從頭測序和其蛋白質(zhì)定量。[0008]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:[0009]一種碳-13同位素標(biāo)記的溴化膦化合物，結(jié)構(gòu)式⑴如下:[0010]【權(quán)利要求】1.一種碳-13同位素標(biāo)記的溴化膦化合物，其特征在于，結(jié)構(gòu)式(I)如下:2.一種溴化膦化合物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟:1)在無水丙酮中，間苯三酚與13C標(biāo)記的硫酸二甲酯在催化劑無水碳酸鉀作用下回流反應(yīng)，生成(I'，1"Λ"'-13C3)-1，3，5-三甲氧苯；2)無水無氧條件下，(I'Λ"Λ"'-13C3)-1，3，5-三甲氧苯與重蒸過的三氯化磷在無水氯化鋅作用下回流反應(yīng)，生成三[(P，1"Λ"'-13C3)-2，4，6-三甲氧苯基]膦；3)在無水二氯甲烷冰浴中，溴乙酰溴與N-羥基琥珀酰亞胺在吡啶作用下，生成溴乙酸-N-琥珀酰亞胺酯；4)溴乙酸-N-琥珀酰亞胺酯與三[(I'，1",I"'-13C3)-2，4，6-三甲氧苯基]膦反應(yīng)得到式(I)結(jié)構(gòu)的目標(biāo)產(chǎn)物。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，在步驟I)中，所述13C標(biāo)記的硫酸二甲酯需每隔10-15分鐘加入其總用量的1/4。4.一種蛋白質(zhì)定量分析試劑，其特征在于，由權(quán)利要求1所述的結(jié)構(gòu)式(I)溴化膦化合物制得。5.權(quán)利要求4所述蛋白質(zhì)定量分析試劑在多肽從頭測序及蛋白質(zhì)定量分析中的應(yīng)用。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述多肽從頭測序及蛋白質(zhì)定量分析方法包括如下步驟:1)蛋白酶解；2)TMPP正電荷衍生:取兩份標(biāo)準(zhǔn)蛋白BSA酶解肽段產(chǎn)物分別加入C12-TMPP-Ac-0Su試劑和C13-TMPP-Ac-0Su試劑，再各加入碳酸氫鈉緩沖液，反應(yīng)15-30分鐘，加入三氟乙酸終止反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物分別命名為C12-TMPP標(biāo)記和C13-TMPP標(biāo)記；3)將C12-TMPP標(biāo)記與C13-TMPP標(biāo)記分別按照1:1比例混合；4)質(zhì)譜分析:取Ipmol混合后的正電荷衍生后肽段樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析，對含有兩種不同標(biāo)記物的同一多肽在質(zhì)譜中出現(xiàn)的兩個(gè)信號峰強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述肽段樣品的梯度洗脫條件:B溶液經(jīng)過6分鐘的線性梯度從5%升到17%，再經(jīng)過75分鐘線性梯度從17%升到25%，流量為500納升每分鐘。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述質(zhì)譜分析條件:毛細(xì)管的溫度為200度，噴霧電壓為2千伏，離子透鏡值為250。【文檔編號】C07F9/572GK103980311SQ201410205986【公開日】2014年8月13日申請日期:2014年5月15日優(yōu)先權(quán)日:2014年5月15日【發(fā)明者】紀(jì)建國,王青松,安明瑞申請人:北京大學(xué)