鴨疫里默氏桿菌表面抗原d15截短重組蛋白致敏乳膠試劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鴨疫里默氏桿菌(RA)表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑，為表面包被有氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示的RA表面抗原D15截短重組蛋白的乳膠顆粒，該致敏乳膠試劑可通過乳膠凝集試驗對RA抗體進行快速檢測，且檢測特異性、重復(fù)性和敏感性良好，可用于制備RA抗體檢測試劑特別是RA抗體乳膠凝集檢測試劑盒；本發(fā)明還公開了RA表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑的制備方法，并對偶聯(lián)條件(如羧化乳膠偶聯(lián)濃度、RA表面抗原D15截短重組蛋白偶聯(lián)濃度、偶聯(lián)時間、封閉液濃度等)進行了探索和優(yōu)化，所建立的制備方法偶聯(lián)效率高，產(chǎn)品凝集效果好。
【專利說明】鴨疫里默氏桿菌表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程和檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種致敏乳劑試劑及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]鴨疫里默氏桿菌(Riemerella Anatipestifer, RA)病是一種主要侵害鴨、火雞和多種其它鳥類的接觸性傳染疾病，又稱為新鴨病、鴨疫綜合癥、鴨疫巴氏桿菌病和鴨傳染性漿膜炎等，是目前危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要傳染病之一。該病呈急性或慢性敗血癥過程，病理變化主要是纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎、干酪性輸卵管炎等。1-8周齡鴨高度敏感，惡劣的環(huán)境條件或并發(fā)感染更易引起該病的發(fā)生和流行，死亡率高。耐過鴨常生長不良，增重緩慢，失去飼養(yǎng)價值，而且該病在發(fā)病場能持續(xù)存在，引起不同批次的鴨感染發(fā)病，難于根治，給養(yǎng)鴨業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。
[0003]除藥物防治以外，目前已成功研制出弱毒疫苗、滅活疫苗和亞單位疫苗來控制RA病。因用藥物防治易造成菌株的耐藥性，鴨群反復(fù)發(fā)病，難于根治，而用疫苗來免疫接種，可以獲得較好的預(yù)防效果。由于RA的血清型多而復(fù)雜，國際公認有21個血清型，我國也存在10多個血清型，且各血清型之間缺乏有效的交叉免疫保護，這給RA的疫苗防治帶來一定困難。比較有效的方法是針對當(dāng)?shù)刂饕餍醒逍停x取相應(yīng)菌株研制疫苗，以達到更有效的防治效果。
[0004]外膜蛋白(OMPs)是革蘭陰性菌特有的一種結(jié)構(gòu)蛋白，很多革蘭陰性菌的OMPs具有良好的免疫原性，是亞單位疫苗的候選組成部分，是目前的研究熱點。RA的D15蛋白與副豬嗜血桿菌和流感嗜血桿菌外膜蛋白D15—樣，均屬于0mp85家族。0mp85為暴露于細菌表面且相對保守的外膜蛋白，為其他外膜蛋白的定位和折疊于外膜所必需；除細菌外膜外，0mp85在真核生物線粒體和葉綠體的外膜中也存在。0mp85家族蛋白在結(jié)構(gòu)上具有兩個重要特征:氨基酸序列N端位于周質(zhì)區(qū)，富含多肽轉(zhuǎn)運相關(guān)區(qū)域片段(polyp印tidetransport-associated domain, POTRA);而其C端的β桶狀區(qū)域則包埋于外膜中。多殺性巴氏桿菌、流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、杜克雷嗜血桿菌、痢疾桿菌等細菌均有屬于0mp85家族的外膜蛋白，并且在氨基酸序列上具有較高的相似性。近十年來，屬于0mp85家族的多種細菌外膜蛋白被確認與致病機理和免疫性相關(guān)。
[0005]對RA抗體的檢測是評價RA疫苗免疫效果及制定合理的免疫程序的關(guān)鍵。乳膠凝集試驗是以乳膠顆粒為載體，將抗原或抗體通過物理吸附法或化學(xué)交聯(lián)法等固定至載體上制得致敏乳膠試劑，再用以檢測對應(yīng)抗體或抗原的方法。由于具有快速敏感、簡單易行、無需昂貴儀器等優(yōu)點，該方法已廣泛用于多種動物疾病抗原抗體的檢測和流行病學(xué)調(diào)查。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種RA表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑，可通過乳膠凝集試驗檢測RA抗體，檢測具有特異性、重復(fù)性和敏感性；目的之二在于提供該致敏乳膠試劑的制備方法，偶聯(lián)效率高，產(chǎn)品凝集效果好；目的之三在于提供該致敏乳膠試劑在制備檢測試劑中的應(yīng)用。
[0007]經(jīng)研究，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0008]1.RA表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑，為表面包被有RA表面抗原D15截短重組蛋白的乳膠顆粒，所述RA表面抗原D15截短重組蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0009]2.RA表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑的制備方法，是利用水溶性碳二亞胺將RA表面抗原D15截短重組蛋白偶聯(lián)到羧化乳膠顆粒的表面而得。
[0010]進一步，所述RA表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑的制備方法具體包括以下步驟:取10界1:%乳膠原液,用0.lmol/L、pH9.6的碳酸鹽緩沖液離心洗漆,再用0.0lmol/L、pH7.4的磷酸鹽緩沖液離心洗滌并重懸，加入2wt% EDAC溶液，37°C振搖反應(yīng)使乳膠顆粒表面的羧基活化，離心棄上清，沉淀用0.0lmol/L、pH8.0的硼酸鹽緩沖液離心洗滌并重懸至濃度為0.5?2wt%，再加入等體積0.1125?0.225mg/mL的RA表面抗原D15截短重組蛋白溶液，37°C振搖反應(yīng)2?12小時使羧化乳膠與RA表面抗原D15截短重組蛋白偶聯(lián)，加Λ 0.lmol/L甘氨酸終止反應(yīng)，離心棄上清，沉淀用lwt%牛血清白蛋白(BSA)溶液封閉后，懸浮于含有穩(wěn)定劑、封閉劑和防腐劑的緩沖液中，即得RA表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑。
[0011]進一步，所述RA表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑的制備方法具體包括以下步驟:取10界1:%乳膠原液,用0.lmol/L、pH9.6的碳酸鹽緩沖液離心洗漆,再用0.0lmol/L、pH7.4的磷酸鹽離心洗滌并重懸，加入2wt% EDAC溶液，37°C振搖反應(yīng)使乳膠顆粒表面的羧基活化，離心棄上清，沉淀用0.0lmol/L、pH8.0的硼酸鹽緩沖液離心洗滌并重懸至濃度為lwt%，再加入等體積0.225mg/mL的RA表面抗原D15截短重組蛋白溶液，37°C振搖反應(yīng)6小時使羧化乳膠與RA表面抗原D15截短重組蛋白偶聯(lián)，加入0.lmol/L甘氨酸終止反應(yīng)，離心棄上清，沉淀用Iwt % BSA溶液封閉后，懸浮于含有5vol%甘油、lwt% BSA和0.1wt %疊氮鈉的0.01M、pH7.4的磷酸鹽緩沖液中，即得RA表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑。
[0012]進一步，所述RA表面抗原D15截短重組蛋白采用以下方法制備:將核苷酸序列如SEQID N0.2所示的RA表面抗原D15截短重組蛋白的編碼基因克隆入原核表達質(zhì)粒pET28a(+)中得到重組表達載體，將該重組表達載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中得到工程菌，將該工程菌接種于含卡那霉素即Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)過夜，次日取菌液按體積比1:50接入含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl = 0.4，加入IPTG至終濃度為0.6mmol，37°C誘導(dǎo)培養(yǎng)4小時，收集菌液，離心，沉淀用20mmol pH8.0的Tris-HCl緩沖液懸浮，置-20°C過夜后，加溶菌酶至終濃度為lmg/mL，4°C攪拌30分鐘，冰浴條件下超聲波間歇破碎菌體，離心，沉淀用洗液離心洗滌后，用尿素溶液溶解，進行鎳瓊脂糖凝膠親和層析純化，以含有300mmol咪唑的洗脫緩沖液為洗脫劑，收集蛋白洗脫液，透析復(fù)性，獲得攜帶組氨酸標(biāo)簽的RA表面抗原D15截短重組蛋白。
[0013]3.RA表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑在制備RA抗體檢測試劑中的應(yīng)用。
[0014]4.RA抗體乳膠凝集檢測試劑盒，含有RA表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑。
[0015]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明將RA表面抗原D15截短重組蛋白通過化學(xué)交聯(lián)法與羧化乳膠偶聯(lián)，制備了 RA表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑，該致敏乳膠試劑可通過乳膠凝集試驗對RA抗體進行快速檢測，且檢測特異性、重復(fù)性和敏感性良好，可用于制備RA抗體檢測試劑特別是RA抗體乳膠凝集檢測試劑盒；本發(fā)明對RA表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑的制備方法特別是偶聯(lián)條件(如羧化乳膠偶聯(lián)濃度、RA表面抗原D15截短重組蛋白偶聯(lián)濃度、偶聯(lián)時間、封閉液濃度等)進行了探索和優(yōu)化，所建立的制備方法偶聯(lián)效率高，產(chǎn)品凝集效果好。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進行說明:
[0017]圖1為D15截短基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中I為D15截短基因PCR產(chǎn)物，M 為 DNA Marker。
[0018]圖2為重組質(zhì)粒pJETl.2-tD15的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中M為DNA Marker, I為PJET1.2-tD15用BamH I和Hind III雙酶切后的產(chǎn)物，2為PCR產(chǎn)物。
[0019]圖3為重組表達質(zhì)粒pET28a_tD15的酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中M為DNAMarker，I 為 pE T28a_tD15 用 BamH I 和 Hind III雙酶切后的產(chǎn)物。
[0020]圖4為重組表達質(zhì)粒pET28a_tD15轉(zhuǎn)化菌株表達的RA表面抗原D15截短重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖；其中I為用IPTG誘導(dǎo)的pET_28a_tD15轉(zhuǎn)化菌株BL21經(jīng)超聲破碎后收集的上清；2為用IPTG誘導(dǎo)的pET-28a-tD15轉(zhuǎn)化菌株BL21經(jīng)超聲破碎后收集的沉淀；3為用IPTG誘導(dǎo)的pET-28a_tD15轉(zhuǎn)化菌株Rosetta經(jīng)超聲破碎后收集的上清；4為用IPTG誘導(dǎo)的pET-28a-tD15轉(zhuǎn)化菌株Rosetta經(jīng)超聲破碎后收集的沉淀；5為用IPTG誘導(dǎo)的pET-28a-tD15轉(zhuǎn)化菌株P(guān)lysS經(jīng)超聲破碎后收集的上清；6為用IPTG誘導(dǎo)的pET_28a_tD15轉(zhuǎn)化菌株P(guān)lysS經(jīng)超聲破碎后收集的沉淀；7為蛋白質(zhì)Marker ；8為空載體pET28a (+)轉(zhuǎn)化菌株BL21未用IPTG誘導(dǎo)；9為用IPTG誘導(dǎo)的空載體pET28a(+)轉(zhuǎn)化菌株BL21經(jīng)超聲破碎后收集的上清；10為用IPTG誘導(dǎo)的空載體pET28a(+)轉(zhuǎn)化菌株BL21經(jīng)超聲破碎后收集的沉淀。
[0021]圖5為不同IPTG濃度下pET28a-tD15轉(zhuǎn)化菌株BL21表達RA表面抗原D15截短重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖；其中M為蛋白質(zhì)Marker，1-6的IPTG終濃度依次為0.2,0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mmol/L0
[0022]圖6為不同誘導(dǎo)溫度下pET28a_tD15轉(zhuǎn)化菌株BL21表達RA表面抗原D15截短重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖；其中M為蛋白質(zhì)Marker，1-3的誘導(dǎo)溫度依次為37、30、25°C。
[0023]圖7為不同誘導(dǎo)時間下pET28a_tD15轉(zhuǎn)化菌株BL21表達RA表面抗原D15截短重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖；其中M為蛋白質(zhì)1&^1?^，1-6依次為誘導(dǎo)6、5、4、3、2、0小時。
[0024]圖8為Western blot檢測RA表面抗原D15截短重組蛋白的特異性，其中I為RA表面抗原D15截短重組蛋白，2為空載體pET-28a (+)的IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)物，M為蛋白質(zhì)Marker。
[0025]圖9為鎳瓊脂糖凝膠(Ni2+-NAT)親和層析純化RA表面抗原D15截短重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖，其中M為蛋白質(zhì)Marker，I為純化前的蛋白，2為純化后的RA表面抗原D15截短重組蛋白。
[0026]圖10為羧化乳膠最佳偶聯(lián)濃度的選擇，其中從左至右依次為乳膠濃度2%、乳膠濃度I %、陰性對照。
[0027]圖11為RA表面抗原D15截短重組蛋白最佳偶聯(lián)濃度的選擇，其中a從左至右依次為蛋白濃度0.9mg/mL、空白對照、蛋白濃度0.45mg/mL ；b從左至右依次為蛋白濃度0.225、0.1125、0.05625mg/mL。
[0028]圖12為封閉液最佳濃度的選擇，其中a從左至右依次為0% BSA封閉、0.01% BSA封閉、空白對照；b從左至右依次為0.1 % BSA封閉、I % BSA封閉、空白對照。
[0029]圖13為最佳偶聯(lián)時間的選擇，其中a從左至右依次為偶聯(lián)2h、4h、6h ；b從左至右依次為偶聯(lián)8h、10h、12h。
[0030]圖14為RA表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑與不同RA陽性血清的凝集反應(yīng)，其中從左至右依次為RA ATCCl 1845株鴨陽性血清、抗RA表面抗原D15截短重組蛋白鴨陽性血清、RA CH-1株鴨陽性血清。
【具體實施方式】
[0031]下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。優(yōu)選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照試劑制造廠商所建議的條件進行。
[0032]主要材料:質(zhì)粒pJETl.2-T購自加拿大富酶泰斯(fermentas)公司；質(zhì)粒pET28a(+)為Novagen公司產(chǎn)品;克隆宿主菌E.coli DH5 α、表達宿主菌E.coli BL21(DE3)和鴨疫里默氏桿菌RA CH-1株(血清I型)由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究中心提供。鴨疫里默氏桿菌RA ATCCl 1845株(血清6型)購自ATCC。
[0033]本實施例中出現(xiàn)的除特別說明外，均為質(zhì)量百分比)。Vol%表示體積百分比。
[0034]實施例1、RA表面抗原D15截短重組蛋白的制備
[0035]本發(fā)明擬制備的RA表面抗原D15截短重組蛋白(命名為tD15)的氨基酸序列如SEQ IDN0.1所示(即登錄號為AFR36094.1的RA D15第94位至第384位氨基酸序列)，其編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示(即登錄號為CP003787的RA D15基因第280位至第1152位核苷酸序列)。
[0036]1、RA tD15基因的克隆
[0037]根據(jù)RA tD 15 基因序列設(shè)計引物，上游引物 RA tD 15_F: 5 ’ -CGGATCCACAGAATATA-TGACCTACCCTAAC-3，(SEQ ID N0.3，劃線部分為 BamH I 位點);下游引物 RA tD15_R:5’_CCAAGCTTGGCGCCTATACATCTAAAATAC-3，(SEQ ID N0.4，劃線部分為 Hind III位點)。
[0038]提取RA基因組DNA:將RA CH-1株接種于含5%牛血清的胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)平板培養(yǎng)基中，37°C恒溫培養(yǎng)過夜，挑單個菌落于含5%牛血清TSB液體培養(yǎng)基中，37°C劇烈振蕩培養(yǎng)12h，取l-3mL培養(yǎng)液，5000g離心IOmin，棄上清，沉淀加入567 μ L TE，反復(fù)吹打，再加入30 μ L10% SDS和3 μ L20mg/mL蛋白酶K溶液，混勻，37°C水浴lh，再加入100 μ L5M NaCl,混勻,65°C水浴IOmin,再加入等體積氯仿/異戍醇，混勻，12000r/min離心5min,上清再加入等體積酚/氯仿/異戊醇，混勻，12000r/min離心5min，上清再加入0.6倍體積異丙醇，輕輕混勻，沉淀DNA30min, 12000r/min離心15min,棄上清,用lmL75vol %乙醇洗滌DNA，12000r/min離心5min，棄上清，37°C干燥后，用50 μ L TE溶解，_20°C保存?zhèn)溆谩?br>
[0039]以RA基因組DNA為模板，采用前述上、下游引物PCR擴增RA tD15基因。PCR反應(yīng)體系為:ddH207 y L，2XPCR mastermixlO μ L，模板 DNAl μ L, 10ymol/L 上、下游引物各 I μ L,總體積為 20 μ L0 PCR 反應(yīng)參數(shù)為:首先 950C 5min,然后 94°C 50s,58.4°C lmin、72°C lmin,共30個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。取PCR產(chǎn)物，進行I %瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖1所示，獲得了一條約873bp的特異性DNA條帶，與目標(biāo)DNA片段大小相符。將PCR產(chǎn)物用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒進行切膠回收純化。
[0040]將純化的PCR產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下與質(zhì)粒pJETl.2_T連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，抽提質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒pJET1.2-tD15。對重組質(zhì)粒pJETl.2-tD15進行BamH I /Hind III雙酶切鑒定，結(jié)果如圖2所示，pJETl.2_tD15用BamH I和Hind III雙酶切得到三條DNA片段，其中一條DNA片段與873bp的目的DNA片段大小相符，另一 DNA小片段與pJETl.2-tD15上另一個Hind III位點酶切下來的片段大小相符。將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒PJETl.2-tD15送上海英駿生物有限公司進行測序，結(jié)果顯示，T克隆所得的RA tD15基因序列如SEQ ID N0.2所示，與目標(biāo)序列完全一致。
[0041]2、重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建
[0042]用BamH I和Hind III雙酶切重組質(zhì)粒pJETl.2_tD15，回收目的DNA片段，與經(jīng)相同酶切的原核表達載體pET28a(+)連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，抽提質(zhì)粒，獲得重組表達質(zhì)粒pET28a-tD15。對重組表達質(zhì)粒pET28a_tD15進行BamH I和Hind III雙酶切鑒定，結(jié)果如圖3所示，pET28a_tD15經(jīng)BamH I和Hind III雙酶切后得到兩條DNA片段，其中DNA小片段與873bp的目的DNA片段大小相符。
[0043]3、重組表達工程菌的構(gòu)建
[0044]挑取含重組表達質(zhì)粒pET28a_tD15的DH5 α大腸桿菌，劃線接種于含Kan的LB瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)過夜，次日取單個菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)10?16小時，離心收集菌液，抽提質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化表達宿主菌E.coli BL2KDE3)感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，獲得含重組表達質(zhì)粒pET28a-tD15的BL21工程菌。
[0045]同法，將重組表達質(zhì)粒pET28a_tD15分別轉(zhuǎn)化表達宿主菌E.coli Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞與E.coli BL21(DE3)plysS感受態(tài)細胞，獲得含重組表達質(zhì)粒pET28a_tD15的Rosetta工程菌與含重組表達質(zhì)粒pET28a_tD15的PlysS工程菌。
[0046]4、重組表達工程菌的誘導(dǎo)表達
[0047]取含重組表達質(zhì)粒pET28a_tD 15的工程菌，同時設(shè)置空載體pET28a⑴轉(zhuǎn)化菌株為對照，接種于含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C振搖培養(yǎng)過夜,次日取菌液按體積比1:50轉(zhuǎn)接種于含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl = 0.4時，加入IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)，收集培養(yǎng)菌液，4°C、13000r/min離心5min,棄上清，菌體沉淀用20mL20mmolTris-HCl (pH8.0)懸浮，置_20°C過夜后，加溶菌酶至終濃度為lmg/mL，4°C攪拌30min，超聲波(冰浴)間歇破碎菌體(600w, 30sec/次，10次),4°C、10000r/min離心IOmin,取上清備用;沉淀用 IOmL 洗液(10mmol/L PBS+2mol/L 尿素+0.2% Triton X-100)于 4°C、10000r/min離心洗漆IOmin,重復(fù)洗漆三次后,用尿素溶液(10mmol/L PBS+8mol/L尿素)溶解備用。分別取前述備用的上清和用尿素溶液溶解的沉淀，加入40 μ L超純水和10 μ LlO X SDS上樣緩沖液，100°C水浴加熱變性lOmin，進行12% SDS-PAGE凝膠電泳，考馬斯亮藍染色。結(jié)果如圖4所示，空載體pET28a(+)轉(zhuǎn)化菌株BL21未用IPTG誘導(dǎo)時沒有特異性蛋白條帶出現(xiàn)，用IPTG誘導(dǎo)后也沒有特異性蛋白條帶出現(xiàn)，說明載體本身很小(可忽略不計)；PET28a-tD15轉(zhuǎn)化菌株Rosetta用IPTG誘導(dǎo)后也沒有特異性蛋白條帶出現(xiàn)，而pET28a_tD15轉(zhuǎn)化菌株BL21與pET28a-tD15轉(zhuǎn)化菌株P(guān)lysS用IPTG誘導(dǎo)后均在約34kDa處出現(xiàn)一條特異性蛋白條帶，與重組tD15/His-tag融合蛋白大小相符(由于pET28a(+)載體在多克隆位點的N端有6個His-tag，因此pET28a-tD15的表達產(chǎn)物實際為tD15與His_tag的融合蛋白)，其中pET28a-tD15轉(zhuǎn)化菌株BL21的重組tD15/His_tag融合蛋白表達量較高，說明E.coliBL21 (DE3)為優(yōu)選的表達宿主菌；此外，由于重組tD15/His-tag融合蛋白主要存在于經(jīng)超聲波破碎后收集的沉淀中，說明重組tD15/His-tag融合蛋白在菌體中是以不溶的包涵體形式存在。
[0048]IPTG濃度優(yōu)化:取含重組表達質(zhì)粒pET28a_tD15的BL21工程菌，接種于含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)過夜，次日取菌液按體積比1:50轉(zhuǎn)接種于含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至0D_ = 0.4時，加入IPTG至不同終濃度(分別為0.2,0.4,0.6、
0.8、1.0、1.2mmol/L)，37°C誘導(dǎo)培養(yǎng) 4h,收集 ImL 培養(yǎng)菌液，4°C、13000r/min 離心 2min,棄上清，沉淀加入40 μ L超純水和10 μ LlO X SDS上樣緩沖液，100°C水浴加熱變性lOmin，進行12% SDS-PAGE凝膠電泳。結(jié)果如圖5所示，隨IPTG濃度的增高，重組tD15/His_tag融合蛋白的誘導(dǎo)量有明顯變化，其中用0.6mmol/L IPTG誘導(dǎo)時表達量最高，因此優(yōu)選0.6mmol/L作為IPTG誘導(dǎo)表達濃度。
[0049]誘導(dǎo)溫度優(yōu)化:取含重組表達質(zhì)粒pET28a_tD15的BL21工程菌，接種于含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)過夜，次日取菌液按體積比1:50轉(zhuǎn)接種于含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl = 0.4時，加入IPTG至終濃度為0.6mmol/L，不同溫度(分別為25、30、37°C )誘導(dǎo)培養(yǎng)4h，收集ImL培養(yǎng)菌液，4°C、13000r/min離心2min，棄上清，沉淀加入40 μ L超純水和10 μ LlOX SDS上樣緩沖液，100°C水浴加熱變性lOmin，進行12%SDS-PAGE凝膠電泳。結(jié)果如圖6所示，重組tD15/His-tag融合蛋白的表達量在誘導(dǎo)溫度為25°C時較少，在誘導(dǎo)溫度為30°C和37°C時較高，因此，按照本領(lǐng)域通常的培養(yǎng)習(xí)慣，優(yōu)選37°C作為誘導(dǎo)溫度。
[0050]誘導(dǎo)時間優(yōu)化:取含重組表達質(zhì)粒pET28a_tD15的BL21工程菌，接種于含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)過夜，次日取菌液按體積比1:50轉(zhuǎn)接種于含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl = 0.4時，加入IPTG至終濃度為0.6mmol/L，37°C誘導(dǎo)培養(yǎng)不同時間(分別為Oh、2h、3h、4h、5h、6h)，收集ImL培養(yǎng)菌液，4°C、13000r/min離心2min，棄上清，沉淀加入40 μ L超純水和10 μ LlO X SDS上樣緩沖液，100°C水浴加熱變性lOmin，進行12% SDS-PAGE凝膠電泳。結(jié)果如圖7所示，誘導(dǎo)培養(yǎng)4h即有大量的重組tD15/His_tag融合蛋白表達，繼續(xù)增加誘導(dǎo)時間，蛋白表達量變化不大，因此優(yōu)選4h作為誘導(dǎo)時間。
[0051]5、重組 tD15/His_tag 融合蛋白的 Western-blot 鑒定
[0052]取含重組表達質(zhì)粒pET28a_tD15的BL21工程菌的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)菌液，同時設(shè)置空載體pET28a(+)轉(zhuǎn)化菌株BL21的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)菌液為對照，4°C、13000r/min離心，棄上清，沉淀加入40 μ L超純水和10 μ LlO X SDS上樣緩沖液，100°C水浴加熱變性lOmin，進行12% SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后將蛋白質(zhì)樣品從PAGE凝膠中轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，力口入12ml3% BSA轉(zhuǎn)膜緩沖液于36°C輕搖2h進行膜封閉，TBST洗膜3次，再加入0.5% BSA/PBST稀釋的兔抗RA (血清I型)血清作為一抗，37 °C溫和搖動Ih，棄一抗，PBST洗膜2次，再加入IOml1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗，37°C孵育lh，PBST洗膜3次，DAB顯色。結(jié)果見圖8，空載體pET28a(+)轉(zhuǎn)化菌株BL21的IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)物與RA血清無特異性的反應(yīng)條帶，而含重組表達質(zhì)粒pET28a-tD 15的BL21工程菌所表達的重組tD 15/Hi s-tag融合蛋白與RA血清有特異性的反應(yīng)條帶。
[0053]6、重組tD15/His_tag融合蛋白的大量制備、純化與復(fù)性
[0054]取含重組表達質(zhì)粒pET28a_tD15的BL21工程菌，接種于含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)過夜，次日取菌液按體積比1:50轉(zhuǎn)接種于含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl = 0.4時，加入IPTG至終濃度為0.6mmol/L，37°C誘導(dǎo)培養(yǎng)4h ;取誘導(dǎo)表達的菌液 500mL, 4°C、10000r/min 離心 lOmin,菌體沉淀用 40mL20mmol Tris-HCl (pH8.0)懸浮，置-20°C過夜后，加溶菌酶至終濃度為lmg/mL，4°C攪拌30min，超聲波(冰浴)間歇破碎菌體(200w, 30sec/次,5?10次),4 °C > 10000r/min離心IOmin,沉淀用2OmL洗液(10mmol/LPBS+2mol/L 尿素+0.2% Triton X-100)懸浮，4°C、10000r/min 離心 lOmin,沉淀用尿素溶液(lOmmol/L PBS+8mol/L尿素)溶解，4°C保存?zhèn)溆谩?br>
[0055]根據(jù)重組tD15/His_tag融合蛋白中His-tag對鎳離子的特殊親和作用，將前述沉淀的尿素溶液進行鎳瓊脂糖凝膠(Ni2+-NAT)親和層析純化。具體操作步驟為:用鎳瓊脂糖凝膠裝柱，柱床體積約為40mL ;用平衡緩沖液I約5個柱床體積平衡層析柱，流速為ImL/min ;將前述沉淀的尿素溶液約5mL加入層析柱中，流速為0.5mL/min ;用平衡緩沖液II洗2-5個柱床體積，流速為lmL/min ;分別用含50、300、500_01咪唑的洗脫緩沖液進行梯度洗脫，流速為lmL/min，收集各梯度洗脫峰，用SDS-PAGE檢測蛋白的分子量大小和純度。結(jié)果如圖8所示，300mmol咪唑洗脫峰中含有大量高純度的重組tD15/His_tag融合蛋白。
[0056]將純化的重組tD15/His_tag融合蛋白進行透析復(fù)性,用Bradford法測定蛋白濃度，稀釋至lmg/mL,分裝備用。
[0057]實施例2、RA表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑的制備與質(zhì)量鑒定
[0058]RA表面抗原D15截短重組蛋白可以作為抗原制備致敏乳膠試劑，再通過乳膠凝集試驗檢測RA抗體。
[0059]1、乳膠凝集試驗方法及結(jié)果判定
[0060]在一塊潔凈的凹載玻片上滴I滴(約20 μ L)待檢樣品溶液，再加I滴(約20 μ L)致敏乳膠試劑，攪拌混勻，搖動玻片使形成直徑為1.5?2.0cm的液面，3?5min內(nèi)置黑色背景下肉眼觀察，同時設(shè)置陽性對照和陰性對照。++++為100%乳膠凝集，顆粒較大并聚集在液滴邊緣，液體完全透明；+++為75%乳膠凝集，顆粒明顯，液體稍有混濁；++為50%乳膠凝集，顆粒較細，液體較混濁；+為少許乳膠凝集，液體混濁；一為不凝集，液滴成原有的均勻乳狀；最終以出現(xiàn)++以上者判為陽性。
[0061]2、致敏乳膠試劑的制備
[0062]取0.乳膠原液(乳膠直徑0.8 μ m)于1.5mL離心管中，用ImL0.lmol/L、ρΗ9.6的碳酸鹽緩沖液離心洗漆3次(每次14000g離心6min),再用ImL0.01mol/L、pH7.4的PBS同法離心洗滌3次，然后用0.625mL0.01mol/L,pH7.4的PBS重懸，轉(zhuǎn)移至2.5mL離心管中，逐滴加入0.625mL2% EDAC (以PBS為溶劑)，置水平搖床37°C低速作用不同時間后，14000g離心6min,棄上清,沉淀用ImL0.01mol/L、pH8.0的BBS離心洗漆3次(每次14000g離心6min)后,用相同BBS重懸至不同濃度,再加入等體積不同濃度的重組tD15/His_tag融合蛋白溶液，置水平搖床37°C低速作用不同時間后，加入0.05mL0.lmol/L甘氨酸(以BBS為溶劑)終止反應(yīng)，最后14000g離心10min，收集上清進行蛋白測定，沉淀用ImL不同濃度的BSA溶液(以BBS為溶劑)封閉后，懸浮于0.5mL儲存液(0.01M pH7.4磷酸鹽緩沖液+5vol %甘油+0.01 % BSA+0.1 %疊氮鈉)中，即得重組tD15/His_tag融合蛋白致敏乳膠試劑。
[0063](I)羧化乳膠最佳偶聯(lián)濃度的選擇
[0064]將與EDAC作用后的羧化乳膠用BBS重懸至不同濃度(3 %、2 %、I %、0.5 %、
0.1% )后與重組tD15/His-tag融合蛋白偶聯(lián)，按前述方法制備重組tD15/His-tag融合蛋白致敏乳膠試劑。再以該致敏乳膠試劑與RA陽性血清進行乳膠凝集試驗，通過測定偶聯(lián)效率和觀察凝集效果選擇羧化乳膠最佳偶聯(lián)濃度。偶聯(lián)效率通過偶聯(lián)反應(yīng)前后溶液中的蛋白濃度變化求得，即偶聯(lián)效率=(初始蛋白濃度-離心上清中蛋白濃度)/初始蛋白濃度X 100%。結(jié)果如表1和圖10所示，當(dāng)羧化乳膠濃度為1%時，與重組tD15/His-tag融合蛋白的偶聯(lián)效率最高，凝集效果最好。
[0065]表1羧化乳膠最佳偶聯(lián)濃度的選擇
[0066]
【權(quán)利要求】
1.鴨疫里默氏桿菌表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑，其特征在于，為表面包被有鴨疫里默氏桿菌表面抗原D15截短重組蛋白的乳膠顆粒，所述鴨疫里默氏桿菌表面抗原D15截短重組蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.權(quán)利要求1所述的鴨疫里默氏桿菌表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑的制備方法，其特征在于，是利用水溶性碳二亞胺將鴨疫里默氏桿菌表面抗原D15截短重組蛋白偶聯(lián)到羧化乳膠顆粒的表面而得。
3.如權(quán)利要求2所述的鴨疫里默氏桿菌表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑的制備方法，其特征在于，具體包括以下步驟:取10￥1:%乳膠原液,用0.lmol/L、pH9.6的碳酸鹽緩沖液離心洗滌，再用0.01mol/L、pH7.4的磷酸鹽緩沖液離心洗滌并重懸，加入2wt% EDAC溶液，37°C振搖反應(yīng)使乳膠顆粒表面的羧基活化，離心棄上清，沉淀用0.01mol/L、pH8.0的硼酸鹽緩沖液離心洗滌并重懸至濃度為0.5~2wt%，再加入等體積0.1125~0.225mg/mL的鴨疫里默氏桿菌表面抗原D15截短重組蛋白溶液，37°C振搖反應(yīng)2~12小時使羧化乳膠與鴨疫里默氏桿菌表面抗原D15截短重組蛋白偶聯(lián)，加入0.lmol/L甘氨酸終止反應(yīng)，離心棄上清，沉淀用lwt%牛血清白蛋白溶液封閉后，懸浮于含有穩(wěn)定劑、封閉劑和防腐劑的緩沖液中，即得鴨疫里默氏桿菌表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑。
4.如權(quán)利要求3所述的鴨疫里默氏桿菌表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑的制備方法，其特征在于，具體包括以下步驟:取10?丨％乳膠原液，用0.lmol/L、pH9.6的碳酸鹽緩沖液離心洗滌，再用0.01mol/L、pH7.4的磷酸鹽離心洗滌并重懸，加入2wt% EDAC溶液，37°C振搖反應(yīng)使乳膠顆粒表面的羧基活化，離心棄上清，沉淀用0.01mol/L、pH8.0的硼酸鹽緩沖液離心洗滌并重懸至濃度為lwt%，再加入等體積0.225mg/mL的鴨疫里默氏桿菌表面抗原D15截短重組蛋白溶液，37°C振搖反應(yīng)6小時使羧化乳膠與鴨疫里默氏桿菌表面抗原D15截短重組蛋白偶聯(lián),加入0.lmol/L甘氨酸終止反應(yīng),離心棄上清,沉淀用Iwt %牛血清白蛋白溶液封閉后，懸浮于含有5vol%甘油、lwt%牛血清白蛋白和0.1wt %置氣納的0.01M、pH7.4的磷酸鹽緩沖液中，即得鴨疫里默氏桿菌表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑。
5.如權(quán)利要求2至4任一項所述的鴨疫里默氏桿菌表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑的制備方法，其特征在于，所述鴨疫里默氏桿菌表面抗原D15截短重組蛋白采用以下方法制備:將核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示的鴨疫里默氏桿菌表面抗原D15截短重組蛋白的編碼基因克隆入原核表達質(zhì)粒pET28a(+)中得到重組表達載體，將該重組表達載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)中得到工程菌，將該工程菌接種于含卡那霉素即Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)過夜，次日取菌液按體積比1:50接入含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C振蕩培養(yǎng)至0D_ = 0.4，加入IPTG至終濃度為0.6mmol，37°C誘導(dǎo)培養(yǎng)4小時，收集菌液，離心，沉淀用20mmol pH8.0的Tris-HCl緩沖液懸浮，置_20°C過夜后，加溶菌酶至終濃度為lmg/mL, 4°C攪拌30分鐘，冰浴條件下超聲波間歇破碎菌體，離心，沉淀用洗液離心洗滌后，用尿素溶液溶解，進行鎳瓊脂糖凝膠親和層析純化，以含有300mmol咪唑的洗脫緩沖液為洗脫劑，收集蛋白洗脫液，透析復(fù)性，獲得攜帶組氨酸標(biāo)簽的鴨疫里默氏桿菌表面抗原D15截短重組蛋白。
6.權(quán)利要求1所述的鴨疫里默氏桿菌表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑在制備鴨疫里默氏桿菌抗體檢測試劑中的應(yīng)用。
7.鴨疫里默氏桿菌抗體乳膠凝集檢測試劑盒，其特征在于，含有權(quán)利要求1所述的鴨疫里默氏桿菌表面抗原 D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑。
【文檔編號】C07K14/195GK103926414SQ201410182317
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月30日
【發(fā)明者】程安春, 奉彬, 汪銘書, 朱德康, 陳孝躍 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)