一種來源于鳀魚蒸煮廢棄液的抗菌肽及其分離方法
【專利摘要】本發明涉及一種來源于鳀魚蒸煮廢棄液的抗菌肽及其分離方法，應用食品級酶制劑對鯤魚蒸煮廢棄液濃縮物進行酶解，采用模擬細胞膜平衡透析聯用高效液相色譜法對其中的抗菌肽進行分離，分析純化所得肽的氨基酸序列并驗證其活性。結果表明該抗菌肽為十肽，其氨基酸序列為GLSRLFTALK。該肽對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等七種指示菌均有抑菌活性。GLSRLFTALK由酶水解獲得，具有安全性高、抗菌性強的特點，在醫藥、食品和飼料行業具有潛在利用價值。該方法利用抗菌肽的模擬細胞膜結合特性，實現了靶向性分離，克服了常規肽分離的步驟多、耗時長的缺點。該發明以魚類加工廢水為原料，減少了環境污染，增加了產品附加值。
【專利說明】一種來源于鍉魚蒸煮廢棄液的抗菌肽及其分離方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種來源于鯤魚蒸煮廢棄液的抗菌肽及其分離方法，屬于食品生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]鯤魚是一種集群性中上層小型低值海魚，廣泛分布于我國黃海、東海海域，富含蛋白質和油脂，具有較高的營養價值。其體內含較多蛋白水解酶，捕撈后極易發生自溶腐爛，因此俗稱“離水爛”、“爛船丁”。鍉魚捕撈后需立即進行蒸煮處理，后續再加工成傳統鯤魚干制品一海蜒。其蒸煮廢棄液中含蛋白質、氨基酸、核苷酸等營養和風味物質，具有極大的開發利用前景。然而，目前針對鯤魚蒸煮廢棄液的加工利用較少，主要處置方式是直接排放丟棄，造成資源浪費和環境污染。將鍉魚蒸煮廢棄液進行回收并高值化利用，對充分開發海洋資源、實現現代海產品高值化加工及解決環境污染問題具有重要意義。
[0003]傳統抗生素的非理性使用導致的多重耐藥菌的出現，已成為全球公共衛生難題。抗菌肽作為抗生素家族的一個新成員，能特異性作用于病原菌，對宿主無毒或毒性小。其具有廣譜抗菌活性，對細菌、真菌甚至某些癌細胞、病毒也有抑制活性。且因其獨特的抗菌機制，抗菌肽不易產生耐藥性。大量相關研究表明，抗菌肽有望成為高效、安全的新型抗菌劑，在醫藥、食品、化妝品、飼料等行業中具有極大的應用潛力。
[0004]抗菌肽的制備方法目前主要包括直接提取法、基因工程法、化學合成法和蛋白酶解法。因蛋白酶解法具有反應條件溫和、過程易于控制，原料方便易得、安全性高等優點，被研究者認為可能是批量生產抗菌肽最有前途的方法之一。但蛋白酶解產物組分復雜，傳統的活性單肽分離方法常采用多步色譜結合活性鑒定的方法，即在每步分離過程中都要驗證每個組分的活性，步驟繁瑣、耗時長、成本高。已有研究表明，基于抗菌肽與細胞膜的親和作用采用細胞膜親和色譜法快速篩選抗菌肽是可行的(一種快速準確發現、鑒定及制備蛋白質水解物源抗菌肽的方法，專利申請號201110406867.3)。然而，細胞膜親和色譜法中的細胞膜需固定于特定載體上以制備成相應的固定相，與載體的結合在空間上會一定程度干擾細胞膜與目標肽的結合，因而在實際應用中受到一定程度的限制。傳統的平衡透析是研究小分子與生物大分子結合平衡的一種經典方法，生物大分子與其潛在結合目標物共同置于透析袋中，當兩者之間建立一種結合平衡狀態時，與生物大分子結合的小分子被束縛于透析袋中，而未結合的小分子可以自由通過透析袋。目前尚未見采用平衡透析法分離抗菌的相關報道。
【發明內容】
[0005]本發明所要解決的技術問題是提供一種來源于鍉魚蒸煮廢棄液的抗菌肽，該抗菌肽可應用于醫藥、食品、化妝品和飼料行業中。
[0006]本發明所要解決的第二個技術問題是針對上述【背景技術】提供一種來源于鯤魚蒸煮廢棄液的抗菌肽的分離方法。[0007]本發明為解決上述第一個技術問題所采用的技術方案為:該來源于鯤魚蒸煮廢棄液的抗菌肽，其特征在于其為十肽化合物，其氨基酸序列為GLSRLFTALK(Gly-Leu-Ser-Arg-Leu-Phe-Thr-Ala-Leu-Lys)，質譜技術檢測出其分子離子峰 m/zll05.67Da[M+H]+。
[0008]本發明為解決上述第二個技術問題所采用的技術方案為:一種來源于鯤魚蒸煮廢棄液的抗菌肽的分離方法，其特征在于包括以下步驟:
[0009]I)鯤魚蒸煮廢棄液經旋蒸濃縮至原體積的1/10~1/20，采用蛋白酶(0.02~
0.04g酶/g粗蛋白)于溫度55~65°C條件下水解4~6h，酶解結束后，90~100°C煮沸滅酶8~lOmin，隨后將其快速冷卻至室溫；8000~lOOOOg，20~30min離心取上清，置于_86°C超低溫冰箱中預凍，預凍4~6h后進行真空冷凍干燥(-55~-45 °C，0.03~0.2mBar)，凍干后于-18~-20°C保存留用；
[0010]2)將步驟I)得到的鯤魚蒸煮廢棄液濃縮后水解產物采用超純水配成10~25mg/ml水溶液，采用高效液相凝膠滲透色譜法測定其相對分子量分布；
[0011]3)將細菌培養至對數期，離心取菌體，重懸于Tris-HCl緩沖液(10~25mM，PH7.5)中，采用氯仿-甲醇(I: 2，V/V)溶液提取其細胞膜脂，氯仿相懸蒸成膜后經Tris-HCl緩沖液(10~25mM，pH7.2)水化，超聲處理至透明，制備細菌模擬細胞膜懸液；
[0012]4)將步驟3)中得到的細菌模擬細胞膜懸液(50~60mg/ml)和步驟I)中得到的鯤魚蒸煮廢棄液濃縮后水解產物(10~25mg/ml)等體積置于透析袋中，于Tris-HCl緩沖液(10~25mM，pH7.2)中進行透析；以細菌模擬細胞膜懸液(50~60mg/ml)和Tris-HCl緩沖液(10~25mM，pH7.2)等體積置于相同透析袋中進行透析為對照；
[0013]5)將步驟4)中得到的樣品平衡透析液和對照平衡透析液經反相高效液相色譜技術進行分析，收集制備兩者的差異峰，并以金黃色葡萄球菌為指示菌驗證其抗菌能力，對抗菌活性最強的組分采用質譜技術分析其氨基酸序列。
[0014]步驟4)中所述透析袋的截留分子量的選擇需根據步驟2)所測得的水解產物的分子量分布來確定，透析袋的截留分子量需大于水解產物的最大分子量。
[0015]作為優選，步驟I)中所述的蛋白酶為復合蛋白酶Protamex,酶活力> 90U/mg,其水解條件為PH6.5，溫度55±2°C，水解時間6h。
[0016]作為優選，步驟2)中所述的高效液相凝膠滲透色譜法的色譜條件為:凝膠柱為丁5敁6120005歡1^柱，300父7.5_;流動相:乙腈/水/三氟乙酸，45/55/0.1 (V/V);洗脫速度:0.5ml/min ;柱溫:30°C ;紫外檢測波長:220nm。步驟5)中所述的反相高效液相色譜法的色譜條件為:色譜柱為Waters symmetry C18, 250X4.6mm ;流動相:A水(含0.1%三氟乙酸)和B乙腈；洗脫程序:0~26min內乙腈濃度從10%增加至80%，洗脫速度0.5ml/min ;紫外檢測波長:215nm。
[0017]與現有技術相比，本發明方法的優勢體現在:
[0018]1、本專利技術是以食品加工副產物為原料，可實現變廢為寶的增值化效應。
[0019]2、本專利技術以模擬細胞膜平衡透析技術為核心技術，模擬細胞膜在分離體系中不受任何束縛，克服了傳統細胞膜色譜法中膜與載體的結合干擾其與目標肽結合的缺點，能最大程度的反應抗菌肽與細菌磷脂膜之間的相互作用。該法簡化了抗菌肽的靶向性分離步驟，降低了生產成本。
[0020]3、通過抑菌試驗證實，本專利產品對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、肺炎鏈球菌、痢疾志賀菌、綠膿桿菌和鼠傷寒沙門氏菌均有抑菌活性。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1是鍉魚蒸煮廢棄液濃縮后水解產物的分子量分布圖。
[0022]圖2是鯤魚蒸煮廢棄液濃縮后水解產物與模擬細胞膜互作樣品平衡透析液和對照平衡透析液的RP-HPLC比較圖譜。
[0023]圖3是GLSRLFTALK的氨基酸分析質譜圖。
圖4是來源于鍉魚蒸煮廢棄液的抗菌肽分離工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0024]以下結合附圖實施例進一步闡述本發明。
[0025]I)鮑魚蒸煮廢棄液經旋蒸濃縮至原體積的1/10,采用復合蛋白酶Protamex (0.02酶/g粗蛋白)于PH6.5、溫度55±2°C條件下水解6h，酶解結束后，100°C煮沸滅酶IOmin，隨后將其快速冷卻至室溫；8000g，20min離心取上清，置于_86°C超低溫冰箱中預凍6h，之后進行真空冷凍干燥(_55°C，0.2mBar)，凍干后得鍉魚蒸煮廢棄液濃縮后水解產物，于-20°C保存留用；
[0026]
[0027]
[0028]
[0029]2)將鯤魚蒸煮廢棄液濃縮后水解產物采用超純水配成10mg/ml水溶液，采用高效液相凝膠滲透色譜法測定其相對分子量分布(圖1)，測得其最大分子量為21687Da。其色譜條件為:凝膠柱為了5敁61200051乂1^柱，300\7.5mm;流動相:乙腈/水/三氟乙酸，45/55/0.1 (V/V);洗脫速度:0.5ml/min ;柱溫:30°C ;紫外檢測波長:220nm ；
[0030]3)將金黃色葡萄球菌培養至對數期，離心取菌體，重懸于Tris-HCl緩沖液(25mM，pH7.5)中，采用氯仿-甲醇(I: 2，V/V)溶液提取其細胞膜脂，氯仿相懸蒸成膜后經Tris-HCl緩沖液(10mM，pH7.2)水化，超聲處理至透明，制備金黃色葡萄球菌模擬細胞膜懸液；
[0031]4)將金黃色葡萄球菌模擬細胞膜懸液(60mg/ml)和鍉魚蒸煮廢棄液濃縮后水解產物(25mg/ml)等體積置于截留分子量為25000的透析袋中，于Tris-HCl緩沖液(10mM，pH7.2)中進行透析；以金黃色葡萄球菌模擬細胞膜懸液(60mg/ml)和Tris-HCl緩沖液(IOmM, pH7.2)等體積置于截留分子量為25000的透析袋中進行透析為對照樣；
[0032]5)將樣品平衡透析液和對照平衡透析液經反相高效液相色譜技術進行分析，其色譜條件為:色譜柱為Waters symmetry C18, 250 X 4.6mm ;流動相:A水(含0.1%三氟乙酸)和B乙腈；洗脫程序:0~26min內乙腈濃度從10%增加至80%，洗脫速度0.5ml/min ;紫外檢測波長:215nm。收集制備兩者的差異峰(圖2)，并以金黃色葡萄球菌為指示菌驗證其抗菌能力；
[0033]6)對抗菌活性最強的組分采用質譜技術分析其氨基酸序列，測得其氨基酸序列為 GLSRLFTALK (Gly-Leu-Ser-Arg-Leu-Phe-Thr-Ala-Leu-Lys),其分子離子峰 m/z 1105.67Da[M+H].(圖 3)。[0034]7) 分別以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、肺炎鏈球菌、痢疾志賀菌、綠膿桿菌和鼠傷寒沙門氏菌為指示菌，對GLSRLFTALK進行抑菌活性檢測，結果表明該肽對以上細菌均有抑菌活性，最小抑菌濃度在16~256μ g/ml之間，說明其具有較強的抑菌活性和較寬的抑菌譜。
【權利要求】
1.一種來源于鯤魚蒸煮廢棄液的抗菌肽，其特征在于該抗菌肽為十肽化合物，其氨基酸序列為 GLSRLFTALK (Gly-Leu-Ser-Arg-Leu-Phe-Thr-Ala-Leu-Lys),質譜技術檢測出其分子離子峰m/zll05.67Da[M+H]+，此抗菌肽序列為一種新的抗菌肽序列。
2.一種來源于鯤魚蒸煮廢棄液的抗菌肽的分離方法，其特征在于，采用模擬細胞膜平衡透析聯用高效液相色譜法對鯤魚蒸煮廢棄液濃縮后的水解產物進行靶向性分離，收集抗菌活性最強的組分，得到目標單肽。具體步驟為: 1)鯤魚蒸煮廢棄液經旋蒸濃縮至原體積的1/10~1/20，采用蛋白酶(0.02~0.04g酶/g粗蛋白)于溫度55~65°C條件下水解4~6h，酶解結束后，90~100°C煮沸滅酶8~IOmin,隨后將其快速冷卻至室溫；8000~lOOOOg，20~30min離心取上清，置于_86°C超低溫冰箱中預凍，預凍4~6h后進行真空冷凍干燥(-55~-45 °C, 0.03~0.2mBar),凍干后于-18~-20°C保存留用； 2)將步驟I)得到的鍉魚蒸煮廢棄液濃縮后水解產物采用超純水配成10~25mg/ml水溶液，采用高效液相凝膠滲透色譜法測定其相對分子量分布； 3)將細菌培養至對數期，離心取菌體，重懸于Tris-HCl緩沖液(10~25mM，pH7.5)中，采用氯仿-甲醇(I: 2，V/V)溶液提取其細胞膜脂，氯仿相懸蒸成膜后經Tris-HCl緩沖液(10~25mM，pH7.2)水化，超聲處理至透明，制備細菌模擬細胞膜懸液； 4)將步驟3)中得到的細菌模擬細胞膜懸液(50~60mg/ml)和步驟I)中得到的鯤魚蒸煮廢棄液濃縮后水解產物(10~25mg/ml)等體積置于透析袋中，于Tris-HCl緩沖液(10~25mM，pH7.2)中進行透析；以細菌模擬細胞膜懸液(50~60mg/ml)和Tris-HCl緩沖液(10~25mM，pH7.2)等體積置于相同透析袋中進行透析為對照； 5)將步驟4)中得到的樣品平衡透析液和對照平衡透析液經反相高效液相色譜技術進行分析，收集制備兩者的差異峰，并以金黃色葡萄球菌為指示菌驗證其抗菌能力，對抗菌活性最強的組分采用質譜技術分析其氨基酸序列。
3.根據權利要求1所述的抗菌肽，其特征在于對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、肺炎鏈球菌、痢疾志賀菌、綠膿桿菌和鼠傷寒沙門氏菌均有抑菌活性。
4.根據權利要求2所述的抗菌肽的分離方法，其特征在于所述鯤魚蒸煮廢棄液為黃海魚昆魚(Engraulis japonicus)蒸煮廢棄液。
【文檔編號】C07K1/14GK103936832SQ201410162659
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月23日 優先權日:2014年4月23日
【發明者】張暉, 唐文婷, 齊希光, 王立, 錢海峰 申請人:江南大學