一種直接檢測呋喃它酮代謝物amoz的樹狀半抗原、樹狀抗原及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種直接檢測呋喃它酮代謝物AMOZ的樹狀半抗原、樹狀抗原及其應用。樹狀半抗原是將AMOZ的乙醛酸衍生物偶聯在四分支聚酰胺-胺的活性氨基末端得到，基于該樹狀半抗原制備人工抗原，再以人工抗原制備抗體。通過本發明的人工抗原能夠獲得直接針對AMOZ的高質量抗體，抗體的效價為1:64000，基于該抗體所建立的化學發光酶聯免疫分析方法（CLEIA）對AMOZ的最低檢測限為0.112ng/mL，半抑制濃度為15.26ng/mL，可以直接用于AMOZ的檢測，克服了傳統方案的AMOZ半抗原、人工抗原制備出的抗體特異性差，不能直接識別AMOZ本身的缺點。本發明的樹狀半抗原、人工抗原及抗體在食品中AMOZ的殘留檢測上具有廣泛的應用前景，同時該半抗原的制備思路可以為其他類似的小分子化合物的半抗原設計提供借鑒。
【專利說明】一種直接檢測呋喃它酮代謝物AMOZ的樹狀半抗原、樹狀抗原及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于食品安全免疫檢測【技術領域】，更具體地，涉及一種直接檢測呋喃它酮代謝物AMOZ的樹狀半抗原、樹狀抗原及其應用。
【背景技術】
[0002]硝基呋喃類抗生素具有殺菌能力強、抗菌譜廣、價格低廉等優點，被廣泛應用于臨床和動物養殖業。近年來研究表明硝基呋喃類藥物及其代謝物對人類具有很大毒性，歐盟已于1995年禁止在食用動物中使用硝基呋喃類抗生素，又在1997年將所有的硝基呋喃類抗生素全部列為違禁藥物，我國亦于2002年頒布了禁止使用硝基呋喃類抗生素的禁令。由于硝基呋喃類藥物代謝速度很快，在生物體內數小時便可降解，而代謝產物可與細胞膜蛋白結合形成穩定結合物，長期存在于生物體內，因而目前對硝基呋喃類藥物殘留的檢測主要集中在對其代謝物含量的測定。3-氨基-5-嗎啉甲基-2-惡唑烷酮(AMOZ)是抗生素呋喃它酮的代謝產物，具有潛在致畸、致癌性，作為非法使用硝基呋喃類抗生素的一種指示物，建立其快速、簡單、廉價、有效的檢測方法十分必要。
目前國內外檢測AMOZ的方法主要有色譜方法及其聯用技術、分光光度法、免疫分析法等。前兩種屬于儀器分析檢測技術，存在著周期長、專業性強、費用高等不足，難以適應許多場合快速檢測的需要，在應用上不能廣泛推廣。基于抗原-抗體特異性識別的免疫分析方法具有快速、靈敏、準確等優點，特別適用于現場進行高通量篩選實驗。但是，大量實踐證明:當化合物(半抗原 )的分子量〈300 Da時，其高特異性高親和力的抗體制備難度增大。AMOZ分子量很小(201.22 Da),即使將其與載體蛋白偶聯，其高特異性高親和力抗體的制備難度也相對很大，因而，目前報道的免疫檢測方法在檢測之前大都需對AMOZ進行衍生化處理作間接檢測，存在著前處理操作復雜繁瑣、成本高及回收率偏低等不足，限制了其應用，并且，該類免疫檢測方法大多停留在酶聯免疫吸附分析(ELISA)上，靈敏度較低。
[0003]目前，研究報道的能夠對AMOZ進行直接檢測的免疫檢測方法相對很少。2009年，Pimpitak等人報道了一種檢測強化蝦樣品中AMOZ殘留量的方法。他們將AMOZ與3-羧酸苯甲醛衍生化制備免疫半抗原CPAM0Z，通過抗原制備、動物免疫以及單克隆抗體制備獲得單克隆抗體，該抗體雖然能夠識別ΑΜ0Ζ，但是識別靈敏度低，比其對半抗原CPAMOZ的靈敏度低23倍。基于該抗體他們建立了間接檢測AMOZ的免疫分析方法，即在檢測前對其進行衍生化(將AMOZ與2-硝基苯甲醛衍生化為ΝΡΑΜ0Ζ)，衍生化的時間需要十多個小時，十分費時。2012年，Yan等人報道了一種直接檢測肉類中AMOZ殘留量的免疫分析方法。他們將呋喃環上的硝基氨基化了的呋喃它酮作為免疫半抗原與載體蛋白通過戊二醛偶聯制備免疫原，通過動物免疫獲得了可以特異性識別AMOZ的多克隆抗體，基于該抗體建立了直接檢測肉類中AMOZ殘留量的ELISA方法，檢測限為0.4ng/g，可用于AMOZ殘留量的測定。但是，上述兩種方案制備的抗體對AMOZ的父本呋喃它酮均存在嚴重的交叉現象，并且對呋喃它酮的特異性識別能力要遠高于對AMOZ的識別(交叉反應率分別為338%和289%)，易導致樣品檢測結果的假陽性。
[0004]在建立小分子化合物免疫分析方法的過程中，半抗原的設計合成是首要并且是關鍵步驟，半抗原的優劣直接影響到獲得的抗體質量。目前采用常規的半抗原制備方案獲得的AMOZ抗體均存在特異性差、親和力低的問題。
【發明內容】
[0005]本發明要解決的技術問題是克服傳統的AMOZ免疫分析技術中均需對其進行衍生化處理的缺陷，提供一種可以用于對呋喃它酮代謝物AMOZ進行直接檢測的樹狀半抗原、人工樹狀抗原。
[0006]本發明的第二個目的是提供所述AMOZ樹狀半抗原、人工樹狀抗原的制備方法。
[0007]本發明的第三個目的是提供一種可以對AMOZ進行直接快速檢測的免疫分析方法。
[0008]本發明的目的通過以下技術方案予以實現:
一種AMOZ樹狀半抗原，是通過將AMOZ的乙醛酸衍生物偶聯在四分支聚酰胺-胺的活性氨基末端得到的。所述AMOZ的乙醛酸衍生物具有式(I )所示分子結構:
【權利要求】
1.一種直接檢測呋喃它酮代謝物AMOZ的樹狀半抗原，其特征在于，所述樹狀半抗原是將AMOZ的乙醛酸衍生物偶聯在四分支聚酰胺-胺的活性氨基末端得到，樹狀半抗原的結構如式(III)所示:
2.權利要求1所述用于直接檢測呋喃它酮代謝物AMOZ的樹狀半抗原的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: S1.制備AMOZ的乙醛酸衍生物:將AMOZ和乙醛酸分別溶于無水乙醇中，攪拌條件下將乙醛酸的乙醇溶液滴加到AMOZ乙醇溶液中，攪拌過夜；ΑΜ0Ζ和乙醛酸的摩爾比為1:1.2，反應結束，真空抽濾，依次用乙醇和乙醚洗滌，得具有式(I )所示分子結構的AMOZ的乙醛酸衍生物； S2.制備四分支聚酰胺-胺:乙二胺與丙烯酸甲酯作為原料，反應遵循Michael加成和酰胺化縮合反應，以乙二胺為核，一端氨基用叔丁氧羰基(Boc)保護，與丙烯酸甲酯進行Michael加成反應，得到Boc-Eddp-OCH3 ;將乙二胺的一端氨基用荷甲氧羰酰基(Fmoc )保護，將Boc-Eddp-OCH3與過量Fmoc保護的乙二胺進行酰胺化縮合反應，得到 Boc-Eddp-(Fmoc- Ethylenediamine)2，去 Boc 保護得到 H-Eddp-(Fmoc-Ethylenediamine) 2 ;將 H-Eddp- (Fmoc- Ethylenediamine) 2 進一步與 Boc-Eddp-OCH3 進行酸胺化縮合反應，得到 Boc-Eddp-(Eddp) 2_ (Fmoc- Ethylenediamine) 4，去 Fmoc 保護得到四分支聚酰胺-胺； S3.將四分支聚酰胺-胺與過量AMOZ的乙醛酸衍生物進行酰胺化縮合反應，得到Boc-Eddp-(Eddp) 2_(AMOZ-2-1minoacetyl-Ethylenediamine)4，脫去 Boc 氨基保護基，得到式(III)所示分子結構的AMOZ樹狀半抗原。
3.一種直接檢測呋喃它酮代謝物AMOZ的人工樹狀抗原，其特征在于，具有式(V)所示分子結構:
4.權利要求3所述用于直接檢測呋喃它酮代謝物AMOZ的人工樹狀抗原的制備方法，其特征在于，采用戊二醛偶聯法將權利要求1中所述具有式(III)所示分子結構的AMOZ樹狀半抗原與載體蛋白偶聯制備得到。
5.根據權利要求4所述制備方法，其特征在于，包括如下步驟:將具有式(III)所示分子結構的AMOZ樹狀半抗原溶于PBS緩沖溶液中，與含有lOmg/mL載體蛋白的PBS緩沖溶液混合，攪拌過程中逐滴加入適量2.5%的戊二醛水溶液，室溫避光反應3h，4°C用PBS透析2天，每天更換透析液3次；所述AMOZ樹狀半抗原與載體蛋白的摩爾比為60:1。
6.根據權利要求4或5所述的制備方法，其特征在于所述載體蛋白為牛血清蛋白、匙孔血藍蛋白或卵清蛋白。
7.權利要求3所述AMOZ的人工樹狀抗原在制備AMOZ抗體或在檢測AMOZ中的應用。
8.一種直接檢測呋喃它酮代謝物AMOZ的快速免疫分析方法，其特征在于，包括如下步驟: S1.將權利要求3具有式(V)所示分子結構的AMOZ人工抗原免疫動物制備AMOZ的多克隆抗體； S2將具有式(VI)所示分子結構人工包被抗原作為包被原包被在微孔板上，將步驟SI制備得到的AMOZ的多克隆抗體加入微孔板中；
【文檔編號】C07K14/795GK103951630SQ201410154388
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月17日 優先權日:2014年4月17日
【發明者】徐振林, 沈玉棟, 孫遠明, 劉鳳銀, 肖治理, 楊金易, 雷紅濤, 王弘 申請人:華南農業大學