一種聚合草葉蛋白的提取方法
【專利摘要】本發明公開了一種聚合草葉蛋白的提取方法，先用稀堿溶液使蛋白質溶解，分離出去不溶性高分子成分。再用酸調到等電點使蛋白質沉淀下來，除去非酸沉性可溶成分，進行洗滌，調pH值至中性，經均質，冷凍干燥等工藝制備成純度較高的蛋白質。結果表明：該方法效果較好，蛋白提取率高達63.42％。最佳提取條件是：NaOH溶液濃度為0.15mol/L，固液比為1∶40，浸提時間為100min，浸提溫度為60℃，提取率達63.42％。同時調節pH值在2.55～3.51之間沉淀聚合草中粗蛋白的效果最佳。
【專利說明】一種聚合草葉蛋白的提取方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于農業【技術領域】，涉及一種聚合草葉蛋白的提取方法。
【背景技術】
[0002]葉蛋白是從綠色植物的新鮮莖葉直接提取出來的蛋白質制品，是一種無毒無害的天然高級營養品，其產品的蛋白質含量在50% -80%之間。葉蛋白富含18中氨基酸，其中8種人體必需氨基酸的含量較高，是優良的蛋白質飼料，國內外大量動物飼喂實驗結果表明，葉蛋白完全可以代替豆柏和魚粉。此外，葉蛋白的制品中葉黃素的含量高達1000mg/kg-1300mg/kgo而葉黃素是禽、肉、皮、蛋黃的天然著色劑,在養禽業生產中意義重大。在國際市場上，葉蛋白中葉黃素的價格比葉蛋白中蛋白質的價格高出50%。葉蛋白制品還含有糖、脂肪、多種維生素、胡蘿卜素、及鐵、鎂、鈣、鋅、銅等礦物質元素，這些營養成分具有防病、治病、強身健體、防衰老等多種生理功能，是優良的添加劑。葉蛋白進入膳食結構后，將會降低膽固醇對身體的危害，符合食物結構回歸大自然的發展趨勢。無論對于飼料，還是對于食品或藥品都有極其廣闊的市場于效益空間，是一個極具開發價值的新興產業。
[0003]聚合草產量大，易于存活和栽培，成本低廉，又稱神奇草，還有許多生物學功能，可以用于治療皮膚病、胃潰瘍、便秘綜合癥、呼吸系統疾病等疾病，富含蛋白質，經氨基酸組分分析，聚合草蛋白質由18種氨基酸組成。其中，必需氨基酸8種，非必需氨基酸10種，氨基酸種類齊全，且必需氨基酸占總氨基酸含量的39.5%，高于淮山藥蛋白。具有很高的營養價值，是制備植物葉蛋白的優良植物原料，也是制備生物活性肽的良好蛋白來源。現有技術中關于聚合草葉蛋白的提取方法尚未發現有關報道。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于克服上述技術存在的缺陷，提供一種聚合草葉蛋白的提取方法，將對本地產的聚合草的基本營養成分進行測定，然后采用“堿溶酸沉”原理，通過對影響蛋白質提取率的料液比、浸提溫度、浸提時間及浸提液PH值進行單因素試驗，采用L9(34)正交試驗對聚合草葉蛋白的提取工藝條件進行優選，并對聚合草蛋白的氨基酸組成進行分析和氨基酸評分，以便為聚合草的深度和綜合開發利用提供數據支持，并為聚合草生物活性肽的制備奠定基礎。其具體技術方案為:
[0005]一種聚合草葉蛋白的提取方法，包括以下步驟:
[0006](I);試驗選取聚合草的莖和葉，用蒸餾水進行清洗，洗滌后經37°C恒溫烘干，經研磨進行粉碎；
[0007](2)按照固液比為I: 40 (g/mL)比加入濃度為0.1~0.15mol/L的NaOH溶液在為60°C下浸提IOOmin ；
[0008](3)在5000r/min下低溫離心，離心后取上清液調ρΗ2.55~3.51之間，至聚合草蛋白質等電點進行蛋白質沉淀，再次在5000r/min下低溫離心取沉淀，沉淀經低溫冷凍干燥得蛋白質。[0009]優選地，所述pH值應控制在2.55~3.51之間。
[0010]優選地，所述NaOH溶液濃0.1~0.15mol/L。
[0011]優選地，所述聚合草粗蛋白的固液比為1: 40(g/mL)。
[0012]優選地，所述聚合草粗蛋白的浸提溫度為60°C。
[0013]優選地，所述聚合草粗蛋白的浸提時間為lOOmin。
[0014]與現有技術相比，本發明的有益效果為:
[0015]聚合草是優良的葉蛋白和膳食纖維提取原料，可作優質蛋白源，傳統的“堿溶酸沉”法提取聚合草葉蛋白，設備、工藝簡單可行，適應工業化生產的需求。
【專利附圖】
【附圖說明】[0016]圖1為定氮蒸餾裝置圖。
[0017]圖2為聚合草粗蛋白等電點的確定。
[0018]圖3為NaOH溶液濃度對粗蛋白提取率的影響。
[0019]圖4為固液比對粗蛋白提取率的影響。
[0020]圖5為浸提溫度對粗蛋白提取率的影響。
[0021]圖6為浸提時間對粗蛋白提取率的影響。
【具體實施方式】
[0022]下面結合附圖和具體實施例對本發明的技術方案作進一步詳細地說明。
[0023]材料與方法
[0024]材料
[0025]聚合草采自山西農業大學家屬院，將鮮草洗凈，經60°C恒溫箱烘干后粉碎。
[0026]主要儀器與設備
[0027]酸度計(PHS-3C)，上海虹益儀器儀表有限公司；旋渦震蕩儀，上海精科實業有限公司；冰箱(BCD-183)，中國重慶五洲實業公司；臺式高速冷凍離心機，上海力中科學儀器有限公司；數顯恒溫水浴鍋(HH-4)，金壇市科析儀器有限公司；可見風光光度計(WFJ2100)，龍尼柯(上海)儀器有限公司；電子天平(BS224S)，北京賽多利斯儀器系統有限公司；以及凱式定氮裝置、氨基酸自動分析儀、真空泵、馬福爐、索氏提取器、恒溫干燥箱，DF205電熱鼓風干燥箱等儀器設備。
[0028]主要生化試劑和溶液配置
[0029]試劑
[0030]本研究所使用的試劑均為分析純，主要有鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、乙醇(95% )、磷酸、考馬氏亮藍G-250、硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸、硼酸、無水乙醚、石油醚、丙酮、重鉻酸鉀、蛋白酶、苯酚、檸檬酸鈉、茚三酮、乙酸鋰、二甲基亞銅、TRIS (三羥甲基氨基甲烷)、MES:2-(N-嗎啉代)乙烷磺酸等。
[0031]溶液
[0032]熱穩定α -淀粉酶溶液:于0°C _5°C冰箱儲存；
[0033]蛋白酶:用MES-TRIS緩沖液配成濃度為50mg/ml的蛋白酶溶液，現用現配，于0°C -5°c儲存；[0034]淀粉葡萄糖苷酶溶液:于0°C _5°C儲存；
[0035]酸洗娃藻土:取200g娃藻土于600ml的2mol/L鹽酸中，浸泡過夜,過濾,用蒸懼水洗至濾液為中性，置于525°C ±5°C馬福爐中灼燒灰分后備用；
[0036]0.05mol/L MES-TRIS 緩沖液:稱取 19.52gMES 和 12.2gTRIS,用 1.7L 蒸餾水溶解，用6mol/L氫氧化鈉調PH至8.2，加水稀釋至2L ；
[0037]3mol/L乙酸溶液:取172ml乙酸，加入700ml水，混勻后用水定容至IL ；
[0038]0.4g/L溴甲酚綠溶液:稱取0.1g溴甲酚綠于研缽中，加入1.4ml0.lmol/L氫氧化鈉研磨，加少許水繼續研磨，直至完全溶解，用水稀釋至250ml。
[0039]考馬斯亮蘭G-250蛋白顯色液:稱IOOmg考馬斯亮蘭G-250，溶于50ml95%的乙醇后，再加入120ml85%的磷酸，用水稀釋至I升。
[0040]方法
[0041]聚合草干葉中蛋白質含量的測定
[0042]參照GB5009.5-2010第一法凱氏定氮法測定[12]。其原理為食品中的蛋白質在催化加熱條件下被分解，產生的氨與硫酸結合生成硫酸銨。堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后以硫酸或鹽酸標準滴定溶液滴定，根據酸的消耗量乘以換算系數，即為蛋白質的含量。
[0043]試樣處理
[0044]稱取充分混勻的聚合草干葉0.2g~2g(約相當于30mg~40mg氮)，精確至
0.0Olg,移入干燥的100mL、250mL或500mL定氮瓶中，加入0.2g硫酸銅、6g硫酸鉀及20mL硫酸，輕搖后于瓶口放一小漏斗，將瓶以45°角斜支于有小孔的石棉網上。小心加熱，待內容物全部炭化，泡沫完全停止后，加強火力，并保持瓶內液體微沸，至液體呈藍綠色并澄清透明后，再繼續加熱0.5h~lh。取下放冷，小心加入20mL水。放冷后，移入IOOmL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混勻備用。同時做試劑空白試驗。
[0045]測定
[0046]按圖1裝好定氮蒸餾裝置，向水蒸氣發生器內裝水至2/3處，加入數粒玻璃珠，加甲基紅乙醇溶液數滴及數毫升硫酸，以保持水呈酸性，加熱煮沸水蒸氣發生器內的水并保持沸騰。向接收瓶內加入10.0mL硼酸溶液及I滴~2滴混合指示液，并使冷凝管的下端插入液面下，根據試樣中氮含量，準確吸取2.0mL~10.0mL試樣處理液由小玻杯注入反應室，以IOmL水洗滌小玻杯并使之流入反應室內，隨后塞緊棒狀玻塞。將10.0mL氫氧化鈉溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其緩緩流入反應室，立即將玻塞蓋緊，并加水于小玻杯以防漏氣。夾緊螺旋夾，開始蒸餾。蒸餾IOmin后移動蒸餾液接收瓶，液面離開冷凝管下端，再蒸餾lmin。然后用少量水沖洗冷凝管下端外部，取下蒸餾液接收瓶。以硫酸或鹽酸標準滴定溶液滴定至終點，其中2份甲基紅乙醇溶液與1份亞甲基藍乙醇溶液指示劑，顏色由紫紅色變成灰色，PH5.4 ;1份甲基紅乙醇溶液與5份溴甲酚綠乙醇溶液指示劑，顏色由酒紅色變成綠色，PH5.1。同時作試劑空白。
[0047]結果計算
[0048]聚合草干葉中的蛋白質的含量按式(I)進行計算。
[0049]
【權利要求】
1.一種聚合草葉蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步驟: (1);試驗選取聚合草的莖和葉，用蒸餾水進行清洗，洗滌后經37°c恒溫烘干，經研磨進行粉碎； (2)按照固液比為1: 40(g/mL)比加入濃度為0.1~0.15mol/L的NaOH溶液在為60°C下浸提 IOOmin ； (3)在5000r/min下低溫離心，離心后取上清液調pH2.55~3.51之間，至聚合草蛋白質等電點進行蛋白質沉淀，再次在5000r/min下低溫離心取沉淀，沉淀經低溫冷凍干燥得蛋白質。
2.根據權利要求1所述的聚合草葉蛋白的提取方法，其特征在于，所述pH值應控制在2.55~3.51之間。
3.根據權利要求1所述的聚合草葉蛋白的提取方法，其特征在于，所述NaOH溶液濃0.1 ~0.15mol/L。
4.根據權利要求1所述的聚合草葉蛋白的提取方法，其特征在于，所述聚合草粗蛋白的固液比為1: 40(g/mL)。
5.根據權利要求1所述的聚合草葉蛋白的提取方法，其特征在于，所述聚合草粗蛋白的浸提溫度為60°C。
6.根據權利要求1所述的聚合草葉蛋白的提取方法，其特征在于，所述聚合草粗蛋白的浸提時間為IOOmin 。
【文檔編號】C07K14/415GK103897049SQ201410153957
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月14日 優先權日:2014年4月14日
【發明者】李寶霞, 霍乃蕊, 董雙濤, 宋金玉, 杜月連, 劉精嬋, 賈文雅 申請人:李寶霞