巴利森苷對照品的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種巴利森苷對照品的制備方法，從天麻中提取分離巴利森苷粗品，再經制備液相色譜純化制得巴利森苷對照品。本發明制備的巴利森苷對照品純度符合國家標準，路線相對簡單、可靠、易得。對其穩定性進行考察，對照品易吸潮分解，室溫干燥儲存含量變化不大，可作為對照品的生產、儲存、運輸的條件。本發明為巴利森苷對照品的制備提供了一種新的技術，為天麻質量控制的深入研究提供了技術支撐。
【專利說明】巴利森苷對照品的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種分離純化技術，尤其是一種巴利森苷對照品的制備方法。
【背景技術】
[0002]夭露(Gastrodia」為蘭科多年生草本植物,分布于全國大部分地區,主產于云南、貴州、四川、陜西及河南等地，在日本、韓國也有廣泛分布。其干燥塊莖亦稱天麻，是一味常用而較名貴的中藥。天麻性平，味甘，有平肝息風止痙的功能。主治頭痛眩暈，肢體麻木，小兒驚風，癲癇抽搐，破傷風。近年來的研究發現天麻還具有增智、健腦、延緩衰老的作用，對老年性癡呆癥有一定的療效。
[0003]目前一般認為天麻素是天麻重要的活性成分，“2010年版中國藥典附錄”中天麻質量標準的制定，也是以天麻素作為重要的參考指標。多項有關天麻素的藥理研究報道，天麻素并沒有表現出與其傳統藥效相關的藥理活性。雖然用幾個化學成分作為指標控制天麻的質量有失偏頗，但是目前天麻對照品只能購買到天麻素、對羥基苯甲醇、香蘭素等結構較簡單、價廉的合成品，用其評價名貴中藥天麻局限性明顯。而天麻成分中較具特征的巴利森苷類化合物及多芳環化合物沒有對照品，很難再深入開展研究。
【發明內容】
[0004]本發明所要解決的技術問題是提供一種巴利森苷對照品的制備方法，采用本發明技術能從天麻中分離獲得純度極高的巴利森苷對照品。
[0005]本發明是這樣實現的:巴利森苷對照品的制備方法，包括以下步驟
I)將天麻粉加入質量百分比為70%的乙醇中，回流提取溫度75°C~80°C，過濾提取液；將提取液進行減壓濃縮回收酒精，向濃縮液中加入石油醚萃取脫脂，萃取至萃取液無色透明，分離的水層用大孔吸附樹脂層析柱分離，用乙醇-水梯度洗脫，洗脫梯度為純水、10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、乙醇，收集20%乙醇部分，再經硅膠柱層析分離，以氯仿-甲醇梯度洗脫，氯仿:甲醇為50:1~1: 1，V:V，在氯仿與甲醇的體積比為3:1的洗脫部分獲得巴利森苷粗品。
[0006]2)將巴利森苷粗品用色譜甲醇溶解后，經制備液相色譜分離純化，流動相為乙腈-7K，乙腈與水的體積比為15:85(色譜柱為C18反相硅膠柱，流速15mL/min，柱溫25°C)，收集液經冷凍干燥后，獲得白色粉末狀結晶，即為巴利森苷對照品。
[0007]天麻與乙醇的料液比為1:10到1:20。
[0008]回流提取為3次，3次提取的時間依次為3小時、3小時及2小時，合并3次提取液。
[0009]減壓濃縮的壓力為0.05MPa，溫度為75°C，濃縮時間為45min。
[0010]向濃縮液中加入石油醚萃取脫脂時，濃縮液與石油醚的體積比為1:3，反復萃取5~8次。
[0011]為了證明本發明的實驗效果，進行了如下實驗:
I材料與儀器1.1材料
1.1.1供試材料
天麻(Gastrodia elata B1.)購于貴陽藥材公司，經貴州大學熊源新教授鑒定為蘭科植物天麻。
[0012]1.1.2試劑與儀器
柱色譜硅膠(青島海洋化工產)；柱色譜大孔樹脂(日本三菱公司)；薄層色譜硅膠(青島海洋化工產)；乙腈為色譜純級，其它試劑均為分析純級。FW100型高速萬能粉碎機(泰斯特儀器有限公司):HZT-B5000電子天平(福州華志科學儀器有限公司)；HH-4數顯恒溫水浴鎘(上海浦東物理光學儀器產);RE-52AA旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器產)；SHB-1IIS循環式多用真空泵(鄭州長城科工有限公司)；101-1型電熱鼓風干燥箱(北京科偉永興儀器有限公司)；1200型高效液相色譜儀(安捷倫):1200型制備液相色譜儀(安捷倫)；WRS-1B型數字熔點儀(上海精科)。
[0013]2方法與結果
2.1巴利森苷的提取分離
取天麻粉2 Kg用20 L質量百分比為70%的乙醇回流提取3次，回流提取溫度75°C~80°C，提取時間分別為3 h、3 h、2 h，合并3次提取液，向濃縮液中加入石油醚萃取脫脂，萃取至萃取液無色透明，分離的水層用大孔吸附樹脂層析柱分離，用乙醇-水梯度洗脫，洗脫梯度為純水、10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、乙醇，收集20%乙醇部分，再經硅膠柱層析分離，以氯仿-甲醇梯度洗脫，氯仿:甲醇為50:1~1:1，V:V，在氯仿與甲醇的體積比為3:1的洗脫部分獲得巴利森苷粗品。
[0014]2.1.2巴利森苷的純化
將巴利森苷粗品用色譜甲醇溶解后，經制備液相色譜分離純化，流動相為乙腈-水，乙腈與水的體積比為15:85 (色譜柱為C18反相硅膠柱，流速15mL/min，柱溫25°C)，收集液經冷凍干燥后，獲得白色粉末狀結晶，即為巴利森苷對照品。
[0015]巴利森苷對照品的提取、分離、純化工藝流程圖如圖1所示。
[0016]2.2純度檢測
2.2.1巴利森苷的TLC純度檢測
取巴利森苷對照品，加甲醇配制成I mL含I mg的對照品溶液，按薄層色譜法試驗，取上述溶液2、5、10、15、20、25 μ L點于同一硅膠G薄層板上，分別以氯仿:甲醇:冰乙酸(2:1:0.05)薄層色譜圖見圖2 ;丙酮:甲醇:冰乙酸(6:1:0.02)薄層色譜圖見圖3 ;乙酸乙酯:丙酮:甲醇:冰乙酸(4:2:1:0.03)為展開劑，薄層色譜圖見圖4 ;展開、取出、晾干，分別在紫外燈下觀察(254 nm)、鵬顯、硫酸顯色劑顯色后觀察記錄結果。由圖2、圖3、圖4可知，在3種展開劑和3種不同的顯色劑中，對照品斑點清晰除對照品顯色單一斑點外，不應有其它斑點，自制的巴利森苷對照品溶液隨著濃度增加，仍呈現單一斑點且圓整性好，說明對照品純度較高。
[0017]2.3 HPLC 含量測定
2.3.1供試品溶液的制備
分別精密稱取巴利森苷對照品適量，加甲醇制成每ImL含Img的溶液，即得。
[0018]2.3.2 測定法以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，巴利森苷以乙腈-水(15:85，K: K)為流動相，檢測波長為222 nm ;流速:1.0 mL/min ;柱溫:30°C;進樣量:5 μ L。色譜條件下測定，面積歸一化法計算其純度。巴利森苷對照品的含量為99.37%。理論塔板數按巴利森苷峰計算不低于8000，對稱因子均大于0.9，HPLC色譜圖見圖4。
[0019]2.4穩定性試驗
將巴利森苷對照品置棕色玻璃瓶中，分別對其的溫度、光照、進行穩定性考察，量測定方法分別在0、3、5、7、10天測定含量。
[0020]2.4.1溫度考察
由于前期工作總結得出，巴利森苷對溫度比較敏感，容易分解，所以條件選擇為室溫、冷藏、冷凍。結果見表1
2.4.2光照考察
光照考察條件為照度4500 lx、25°C條件下按含量測定方法，結果見表1。對照品的儲存條件為干燥、室溫10天內含量變化不大，巴利森苷對照品含量穩定。
【權利要求】
1.一種巴利森苷對照品的制備方法，其特征在于:包括以下步驟 1)將天麻粉加入質量百分比為70%的乙醇中，回流提取溫度75°C~80°C，過濾提取液；將提取液進行減壓濃縮回收酒精，向濃縮液中加入石油醚萃取脫脂，萃取至萃取液無色透明，分離的水層用大孔吸附樹脂層析柱分離，用乙醇-水梯度洗脫，洗脫梯度為純水、10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、乙醇，收集20%乙醇部分，再經硅膠柱層析分離，以氯仿-甲醇梯度洗脫，氯仿:甲醇為50:1~1: 1，V:V，在氯仿與甲醇的體積比為3:1的洗脫部分獲得巴利森苷粗品； 2)將巴利森苷粗品用色譜甲醇溶解后，經制備液相色譜分離純化，流動相為乙腈-水，乙腈與水的體積比為15:85，色譜柱為C18反相硅膠柱，流速15mL/min，柱溫25°C，收集液經冷凍干燥后，獲得白色粉末狀結晶，即為巴利森苷對照品。
2.根據權利要求1所述的巴利森苷對照品的制備方法，其特征在于:天麻粉與乙醇的料液比為1:10~20。
3.根據權利要求1所述的巴利森苷對照品的制備方法，其特征在于:回流提取為3次，3次提取的時間依次為3小時、3小時及2小時，合并3次提取液。
4.根據權利要求1所述的巴利森苷對照品的制備方法，其特征在于:減壓濃縮的壓力為0.05MPa，溫度為75°C，濃縮時間為45min。
5.根據權利要求1所述的巴利森苷對照品的制備方法，其特征在于:向濃縮液中加入石油醚萃取脫脂時，濃縮液與石油醚的體積比為1:3，反復萃取5~8次。
【文檔編號】C07H1/08GK103896999SQ201410150002
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月15日 優先權日:2014年4月15日
【發明者】周英, 陳琳, 郭豐敏, 聶昌平, 彭禮軍 申請人:貴州大學