一種抗zen卵黃抗體及其制備方法
【專利摘要】本發明屬于免疫學【技術領域】，具體涉及一種抗ZEN（玉米赤霉烯酮）的卵黃抗體及其制備方法。抗ZEN的卵黃抗體通過將人工合成ZEN-BSA抗原對蛋雞免疫接種，收集雞蛋，從蛋黃中分離純化獲得ZEN卵黃抗體。本發明所提供的抗ZEN卵黃抗體針對ZEN抗原，特異性高、效價比高，可替代現有的鼠源性的單克隆抗體；所提供的抗ZEN卵黃抗體的制備方法相對于現有的鼠源性的單克隆抗體，其成本低、產量大，利于ZEN快速反應檢測體系的建立，因而在農產品及食品安全檢測中具有積極的應用意義。
【專利說明】一種抗ZEN卵黃抗體及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于免疫學【技術領域】，具體涉及一種抗ZEN (玉米赤霉烯酮)的卵黃抗體及其制備方法。
【背景技術】
[0002]ZEN (zearalenone,玉米赤霉烯酮)又稱F-2毒素，為2,4-二羥基苯甲酸內酯類化合物，具有很高的雌激素活性，主要是由侵染玉米、小麥、大麥、燕麥和高粱等作物的禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌等產生的一種非留類雌激素型真菌毒素，對人類和動物可產生多種毒副作用，例如，具有較強生殖毒性和致畸作用，可引起動物發生雌激素亢進癥，導致動物不孕或流產，對豬、家禽和反芻動物影響較大，給畜牧業帶來很大經濟損失；此外，ZEN還具有細胞毒性、免疫毒性、肝毒性和潛在致癌性等，嚴重威脅人類健康。由于ZEN在谷物中污染的普遍性和對人畜的高度危害，截止2004年，已有27個國家和地區對玉米赤霉烯酮在食品和飼料中的含量進行了限制，歐盟于2007年制定了統一的限量標準，規定谷物和玉米中ZEN的含量分別不能超過0.lmg/kg和0.35mg/kg，我國規定人食用的小麥、面粉、玉米和玉米(渣)中ZEN含量不能超過eOyg/kg。因此，建立對ZEN快速、準確、簡便的檢測方法非常重要。
[0003]目前測定谷物、飼料等中ZEN的方法主要有薄層層析法(thin-layerchromatography, TLC)、氣相色譜法(gas chromatography, GC)、液相色譜法(liquidchromatography, LC)、高效液相色譜法(HPLC)等,這些檢測方法有許多弊端，比如需要昂貴的儀器設備、大量的樣品前處理、復雜的操作程序以及專業的操作人員。
[0004]近年來基于抗原、抗體反應技術建立的使用膠體金免疫層析技術(colloidalgold immunochromatographic assay, GICA)和酶聯免疫吸附技術使得對ZEN的檢測具有簡便、快速、特異、靈敏、不需特殊設備和人員培訓、結果判斷直觀等優點，因而特別適合于廣大基層大批量檢測及大面積 普查。然而無論是GICA法還是酶聯免疫吸附技術，其檢測試劑盒的技術關鍵都需要人工制備針對ZEN的單克隆抗體，目前針對ZEN的單克隆抗體多為鼠源性，其制備復雜，產量低，生產分離成本高，因而很大程度限制了 ZEN快速檢測體系的建立。
[0005]卵黃免疫球蛋白(Immunoglobulin of egg yolk, IgY)，又稱卵黃抗體，是母雞血液中的免疫球蛋白傳遞至雞卵黃并在子雞孵育過程中和孵育后對子雞起保護作用的免疫球蛋白，IgY的結構與IgG相似，具有典型的IgG空間構象，可與特異性抗原結合，很多方面優于哺乳動物的IgGjn IgY具有不與人類補體以及類風濕因子結合等免疫學特性。IgY的功能性試驗、體外模擬試驗以及臨床應用證實，通過抗原免疫產蛋母雞獲得的特異性抗體IgY可用于制備生物診斷試劑和治療制劑等，并且雞卵黃抗體(IgY)具有以下優點:母雞易于飼養，收集雞蛋方便；無需抽動物血、無損傷，符合現代動物保護原則；而且具有產率高、成本低、穩定性好、特異性強等特點，因此在免疫診斷、疾病預防等方面具有廣泛的應用前景。然而現有技術中，尚未見到有關抗ZEN卵黃抗體及其制備的有關報道。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于提供一種抗ZEN卵黃抗體及其制備方法，從而可以加快ZEN快速檢測反應體系的建立。
[0007]本發明采取的技術方案如下:
一種抗ZEN卵黃抗體，采用以下方法步驟制備:
(1)利用Thouvenot法和碳二亞胺法，人工合成ZEN-BSA(玉米赤霉烯酮-牛血清蛋白)抗原；
(2)將人工合成ZEN-BSA抗原對蛋雞免疫接種，免疫3飛次后收集雞蛋；具體包括以下步驟:
(2-1)將步驟(1)制備的ZEN-BSA抗原粉末溶于PBS (磷酸鹽緩沖液，pH7.4)中，然后將溶解有ZEN-BSA的PBS與佐劑乳化制得免疫用ZEN-BSA抗原；
所述PBS的濃度為0.lmol/L ;所述佐劑為弗氏佐劑；
所述ZEN-BSA抗原粉末溶于PBS時按ImgZEN-BSA溶于1mLPBS的比例制備；
所述溶解有ZEN-BSA的PBS與佐劑按1:1的體積比例制備；
(2-2)將步驟(2-1)制得的免疫用ZEN-BSA抗原免疫接種蛋雞3飛次；
所述蛋雞為23周齡健康產蛋母雞；
所述免疫接種方法為皮下和肌肉多位點接種；
所述免疫接種4次，第一次免疫接種一至兩周后免疫接種第2次，以后每隔7~12天免疫接種一次；
所述免疫接種，第一次免疫接種所用佐劑為弗氏完全佐劑，第二次、第三次、第四次免疫接種所用佐劑為弗氏不完全佐劑；
(2-3)免疫接種蛋雞完成后2~3周收集雞蛋，持續收集1-2個月，收集的雞蛋4°C保存；
(3)從步驟(2)獲得雞蛋中分離純化ZEN卵黃抗體，具體包括以下步驟:
(3-1)將步驟(2)中獲得的的雞蛋外殼消毒，打蛋收集蛋黃；
所述消毒采用75%酒精擦拭或用0.5%新潔爾滅浸泡l0-20min ；
(3-2)將步驟(3-1)中的蛋黃加入無菌雙蒸水稀釋，充分混勻，調節pH值，4°C條件下12~24小時；
所述蛋黃與無菌雙蒸水的體積比為1: 7~10 ；
所述PH值為5.0~6.0 ；
(3-3)將步驟(3-2)混合液過夜后離心，收集得到N升上清液；
所述離心為4°C條件下,8000~12000rpm離心10~25min ；
(3-4)將步驟(3-3)收集的上清液緩慢加入硫酸銨，混勻溶解；4°C放置12~24h，離心棄上清，收集沉淀；
所述硫酸銨加入量根據所獲上清的體積決定，加入硫酸銨后使硫酸銨按質量分數計終濃度為50% ；
所述離心為4°C 1000Orpm離心10~20min ；
(3-5)將步驟(3-4)收集的沉淀用去離子水稀釋溶解恢復到N升后，加入硫酸鈉，混勻溶解，置室溫(18~25°C )過夜，離心棄上清，用去離子水溶解沉淀恢復至N升后，親和層析柱純化，濾膜除菌，即得無菌抗ZEN卵黃抗體提取液；
所述硫酸鈉加入量，加入硫酸鈉后使硫酸鈉按質量分數計終濃度為14% ；
所述離心為25°C 1000Orpm離心10~20min ；
所述親和層析柱為 HiTrapTM IgY Purification HP ；
所述濾膜孔徑為0.22μπι;
(3-6)將步驟(3-5)所得無菌抗ZEN卵黃抗體提取液真空冷凍干燥可得抗ZEN卵黃抗體干粉成品，干粉成品保存于_70°C。[0008]本發明所提供的抗ZEN卵黃抗體針對ZEN抗原，特異性高、效價比高，可替代現有的鼠源性的單克隆抗體；所提供的抗ZEN卵黃抗體的制備方法相對于現有的鼠源性的單克隆抗體，其成本低、產量大，利于ZEN快速反應檢測體系的建立，因而在農產品及食品安全檢測中具有積極的應用意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0009]圖1為本發明所制備的IgY提取液與ZEN特異性結合實驗檢測圖。
【具體實施方式】
[0010]下面結合實施例對本發明做進一步的解釋說明。
[0011]實施例1
抗ZEN卵黃抗體，采用以下方法步驟制備:
1、利用Thouvenot法和碳二亞胺法，人工合成ZEN-BSA (玉米赤霉烯酮-牛血清蛋白)抗原；具體包括以下步驟:
A.參考Thouvenot法合成ZEN半抗原
將12mgZEN (以色列fermantek公司)溶于2ml吡卩定中，力卩入2OmgCMO(carboxymathyloxime,羧甲基輕胺半鹽酸鹽),室溫攪拌反應24h, 45°C條件下真空干燥,干燥后殘留物溶于6mL超純水，用Imol/LNaOH調pH至8.0，然后用苯萃取3次，每次用量6mL，除去水相中未反應的ZEN，將除去未反應ZEN的溶液再用lmol/LHCL調節pH至3.0，用乙酸乙酯萃取4次，每次用量10mL，收集萃取液，將萃取液真空干燥，得ZEN-CMO (玉米赤霉烯酮-6-羧甲基肟)半抗原；此次制備得到ZEN-CMO 23.65mg。
[0012].利用碳二亞胺法將ZEN-CMO與BSA(牛血清蛋白，美國Sigma公司)偶聯制備ZEN-BSA
將 3.0mgZEN-CMO 溶于 ImLDMF (dimethylformamide, 二甲基甲酸胺)中，再加入
1.8mgNHS (N-hydroxysuccinimide, N-羧基丁二酸亞胺)、1.8mgEDC (l-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)，室溫攪拌反應過夜，將反應液5000r/min離心10min,取上清液備用。
[0013]將8.6mgBSA用1.2mLPBS (磷酸鹽緩沖液，pH7.4)溶解，然后將上清液緩慢加入，室溫攪拌過夜得偶聯物。
[0014]C.將步驟B所得偶聯物，用0.015 mol/L、pH 7.4的PBS透析3 d，每天換3次透析液，最終所得透析物5000r/min離心10min,取上清,真空干燥，即得到ZEN-BSA粉末，本次制備得到ZEN-BSA 9.02mg，分裝保存于_20°C備用。[0015]2、將步驟I中人工合成ZEN-BSA抗原對蛋雞免疫接種，免疫4次后后收集雞蛋；具體包括以下步驟:
(1)將步驟I中制備的ZEN-BSA抗原粉末溶于PBS(磷酸鹽緩沖液，pH7.4)中，然后將溶解有ZEN-BSA的PBS與佐劑乳化制得免疫用ZEN-BSA抗原；
所述PBS的濃度為0.lmol/L ；
所述佐劑為弗氏佐劑，弗氏佐劑購自美國Sigma公司；
所述ZEN-BSA抗原粉末溶于PBS時按ImgZEN-BSA溶于ImLPBS的比例制備；
所述溶解有ZEN-BSA的PBS與佐劑按1:1的體積比比例制備；
(2)將步驟(1)制得的免疫用ZEN-BSA抗原免疫接種蛋雞4次；
所述蛋雞為22周齡健康產蛋母雞；產蛋母雞品種為來杭產蛋母雞，購自吉林農業大學養雞場；
所述免疫接種為皮下和肌肉多位點接種；
所述免疫接種4次，第一次免疫接種后兩周免疫接種第2次，以后每隔9天免疫接種一
次； 所述免疫接種，第一次免疫接種所用佐劑為弗氏完全佐劑；第二次、第三次、第四次免疫接種所用佐劑為弗氏不完全佐劑；
(3)免疫接種蛋雞完成后2周收集雞蛋，本次免疫10只來杭雞，持續收集雞蛋50天，共收集雞蛋319枚，4°C保存。
[0016]人工合成ZEN-BSA抗原對蛋雞免疫接種同時，采用相同程序對相同數量的雞接種生理鹽水，按照相同程序收集雞蛋，保存作為陰性對照。
[0017]3、分離純化ZEN卵黃抗體，具體包括以下步驟:
(4)將步驟(3)的雞蛋外殼消毒，打蛋收集蛋黃；本次使用10枚雞蛋；
所述消毒采用75%酒精消毒；
(5)將步驟(4)的蛋黃加入無菌雙蒸水稀釋，充分混勻，調節pH值，4°C條件下過夜；
所述蛋黃與雙蒸水的質量比為1:9 ；
所述PH值為5.2 ;
(6)將步驟(5)過夜后混合液離心，收集得到上清液1500mL；
所述離心為4°C條件下,9000rpm離心15min ；
(7)將步驟(6)收集的上清液緩慢加入硫酸銨，混勻溶解，至硫酸銨飽和度為50%；4°C過夜,4? 1000Orpm離心15min,棄上清，收集沉淀；
根據所獲上清的體積加入硫酸銨，使終濃度為50%，本次加入硫酸銨750g ；
(8)將步驟(7)收集的沉淀用去離子水稀釋溶解到1500mL，加入硫酸鈉，使硫酸鈉終濃度為14%，混勻，置室溫(18-25°C)過夜，25°C 1000Orpm離心15min，棄上清，用去離子水溶解沉淀至1500mL，親和層析柱純化，濾膜除菌，即得無菌抗ZEN卵黃抗體提取液；
所述硫酸鈉復溶所用硫酸鈉為質量分數，本次加入硫酸鈉210g ；
所述親和層析柱為HiTrapTM IgY Purification HP ;親和層析柱購自美國通用電氣公
司；
所述濾膜孔徑為0.22μπι;
(9)為便于長期保存，將步驟(8)所得無菌抗ZEN卵黃抗體提取液真空冷凍干燥可得抗ZEN卵黃抗體干粉成品，干粉成品保存于_70°C。
[0018]實施例2
為檢測實施例1制備的ZEN卵黃抗體的抗體效果，發明人做了進一步的檢測實驗。實驗過程如下:
1、對實施例1步驟(8)中制備的無菌抗ZEN卵黃抗體提取液的濃度進行測定對實施例1步驟(8)中親和層析柱后的ZEN卵黃抗體提取液進行濃度測定，采用雙波長紫外分光光度法測定親和層析柱純化后IgY在260 nm和280 nm的吸收值，按下式計算IgY濃度: IgY 濃度(mg /ml)= 1.45 X A280 — 0.74X A2600
[0019]紫外分光光度法測定結果顯示，經親和層析純化后，IgY含量為5.17mg/ml。
[0020]2、對實施例1步驟(8)中制備的無菌抗ZEN卵黃抗體提取液效價測定
步驟(8)中制備的無菌抗ZEN卵黃抗體提取液效價測定采用間接ELISA法，具體過程如下:
取實施例1中制備的0.25mg ZEN-BSA加入100mL 0.lmol/L ρΗ7.4的PBS溶液，溶解混勻，在96孔深孔板(美國Sigma公司沖，每孔加入100 μ I，經方陣滴定法確定ZEN-BSA抗原包被濃度為 2.5μ g/ml，4°C過夜，取出甩干，然后用 PBST (PBS 0.01mol/l,0.5%Tween_20，pH7.4)洗滌3次，拍干。然后每孔加入200 μ I含有3%脫脂奶粉的PBS封閉，37°C恒溫孵育Ih取出，甩干后用PBST洗漆3次,拍干。
[0021]把步驟(8)中制備的IgY含量為5.17mg/ml無菌抗ZEN卵黃抗體提取液，用PBS分別做 1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1: 128000、1:256000 稀釋，分別取100 μ I加入第I孔、第2孔、第3孔、第4孔、第5孔、第6孔、第7孔、第8孔。重復做5排。
[0022]以實施例1步驟2中給雞接種生理鹽水組所收集雞蛋提取的IgY作為陰性對照，相同程序處理。
[0023]加入IgY提取液后的深孔板37°C孵育I h，然后用PBST洗滌3次，每次間隔I min。然后每孔加入100 μ I兔抗雞HRP標記的二抗(1: 12000)，37°C恒溫孵育lh，取出甩干后用PBST洗滌3次，拍干。然后每孔加入100 μ I TMB顯色液，37 1:避光顯色15 min ;用酶標儀(普朗酶標儀9602)測定A45tl值，測定結果如下表:
【權利要求】
1.一種抗ZEN卵黃抗體，其特征在于，該抗體采用以下步驟制備: (1)利用Thouvenot法和碳二亞胺法，人工合成ZEN-BSA抗原； (2)將人工合成ZEN-BSA抗原對蛋雞免疫接種，免疫3-5次后收集雞蛋；具體包括以下步驟: (2-1)將步驟(1)制備的ZEN-BSA抗原粉末溶于PBS中，然后將溶解有ZEN-BSA的PBS與佐劑乳化制得免疫用ZEN-BSA抗原； (2-2)將步驟(2-1)制得的免疫用ZEN-BSA抗原免疫接種蛋雞3-5次； (2-3)免疫接種蛋雞完成后2~3周收集雞蛋，持續收集1-2個月，收集的雞蛋4℃保存； (3)從步驟(2)獲得雞蛋中分離純化ZEN卵黃抗體；具體包括以下步驟: (3-1)將步驟(2)獲得的雞蛋外殼消毒，打蛋收集蛋黃； (3-2)將步驟(3-1)收集的蛋黃加入無菌雙蒸水稀釋，充分混勻，調節pH值，4℃條件下靜置12~24小時； (3-3)將步驟(3-2)的混合液離心，收集得到N升上清液； (3-4)將步驟(3-3)收集的上清液緩慢加入硫酸銨，混勻溶解；4℃放置12~24h，離心棄上清，收集沉淀； (3-5)將步驟(3-4)收集的沉淀用去離子水稀釋溶解恢復到N升后，加入硫酸鈉，混勻溶解，置室溫過夜，離心棄上清，用去離子水溶解沉淀恢復至N升后，親和層析柱純化，濾膜除菌，即得無菌抗ZEN卵黃抗體提取液； (3-6)將步驟(3-5)所得無菌抗ZEN卵黃抗體提取液真空冷凍干燥得抗ZEN卵黃抗體干粉成品。
2.如權利要求1所述抗ZEN卵黃抗體，其特征在于，步驟(2)中所述蛋雞為23周齡健康產蛋母雞。
3.如權利要求1所述抗ZEN卵黃抗體，其特征在于，步驟(2)中所述免疫為皮下和肌肉多位點接種免疫,免疫4次，第一次免疫接種一至兩周后免疫接種第2次，以后每隔7~12天免疫接種一次。
4.如權利要求1所述抗ZEN卵黃抗體，其特征在于，步驟(3-5)中所述親和層析柱為HiTrapTM IgY Purification HP ;所述濾膜孔徑為 0.22 μ m。
5.權利要求1所述抗ZEN卵黃抗體的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: (1)利用Thouvenot法和碳二亞胺法，人工合成ZEN-BSA抗原； (2)將人工合成ZEN-BSA抗原對蛋雞免疫接種，免疫3-5次后后收集雞蛋；具體包括以下步驟: (2-1)將步驟(1)制備的ZEN-BSA抗原粉末溶于PBS中，然后將溶解有ZEN-BSA的PBS與佐劑乳化制得免疫用ZEN-BSA抗原； (2-2)將步驟(2-1)制得的免疫用ZEN-BSA抗原免疫接種蛋雞3-5次； (2-3)免疫接種蛋雞完成后2~3周收集雞蛋，持續收集1-2個月，收集的雞蛋4℃保存； (3)從步驟(2)獲得雞蛋中分離純化ZEN卵黃抗體；具體包括以下步驟: (3-1)將步驟(2)獲得的雞蛋外殼消毒，打蛋收集蛋黃； (3-2)將步驟(3-1)收集的蛋黃加入無菌雙蒸水稀釋，充分混勻，調節pH值，4℃條件下靜置12~24小時；(3-3)將步驟(3-2)的混合液離心，收集得到N升上清液； (3-4)將步驟(3-3)收集的上清液緩慢加入硫酸銨，混勻溶解；4°C放置12~24h，離心棄上清，收集沉淀； (3-5)將步驟(3-4)收集的沉淀用去離子水稀釋溶解恢復到N升后，加入硫酸鈉，混勻溶解，置室溫過夜，離心棄上清，用去離子水溶解沉淀恢復至N升后，親和層析柱純化，濾膜除菌，即得無菌抗ZEN卵黃抗體提取液； (3-6)將步驟(3-5)所得無菌抗ZEN卵黃抗體提取液真空冷凍干燥得抗ZEN卵黃抗體干粉成品。
6.如權利5所述抗ZEN卵黃抗體的制備方法，其特征在于，步驟(3-2)中所述蛋黃與雙蒸水的體積比為1: 7~10 ;所述pH值為5.0-6.0。
7.如權利5所述抗ZEN卵黃抗體的制備方法，其特征在于，步驟(3-4)中硫酸銨按質量分數計，根據所獲上清的體積加入硫酸銨時，硫酸銨最終質量分數為50%。
8.如權利5所述抗ZEN卵黃抗體的制備方法，其特征在于，步驟(3-5)中硫酸鈉按質量分數計，根據所獲上清的體積加入硫酸鈉時，硫酸鈉最終質量分數為14%。
9.如權利5所述抗ZEN卵黃抗體的制備方法，其特征在于，步驟(3-5)中所述親和層析柱為 HiTrapTM IgY Purification HP ;所述濾膜孔徑為 0.22 μ m。
【文檔編號】C07K16/14GK103880952SQ201410124272
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月31日 優先權日:2014年3月31日
【發明者】劉英杰, 陳娟, 黃永偉, 劉云 申請人:河南大學