分泌抗柑橘碎葉病毒單抗雜交瘤細(xì)胞株及其單抗應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種分泌抗柑橘碎葉病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其單抗的應(yīng)用。克隆了柑橘碎葉病毒(CTLV)的外殼蛋白基因，利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了該病毒的外殼蛋白，用表達(dá)純化的蛋白為抗原免疫BALB/c小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合、篩選、克隆，獲得1株能穩(wěn)定傳代并分泌抗CTLV特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞株6C5，其保藏號(hào)為CGMCCNo.8779。該單克隆抗體腹水間接ELISA效價(jià)均達(dá)到10-7，抗體類型及亞類均為IgG1，kappa鏈。利用單抗建立的檢測(cè)柑橘中CTLV的dot-ELISA方法，當(dāng)病葉1:640倍稀釋(w/v,g/mL)時(shí)仍能檢測(cè)到病毒。分泌抗CTLV單抗雜交瘤細(xì)胞及其單抗的獲得和相關(guān)血清學(xué)檢測(cè)方法的建立為該柑橘病毒病的診斷、預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)及科學(xué)防控提供技術(shù)和物質(zhì)支撐。
【專利說明】分泌抗柑橘碎葉病毒單抗雜交瘤細(xì)胞株及其單抗應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種分泌抗柑橘碎葉病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其單抗的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]柑橘碎葉病毒(Citrus tatter leaf virus, CTLV)引起的柑橘碎葉病在我國(guó)分布廣泛，臺(tái)灣、浙江、廣西、湖南、湖北和四川等省(區(qū))均有分布，為我國(guó)繼柑橘衰退病和裂皮病之后的一種重要的柑橘病毒病。起源于我國(guó)的柑橘品種溫州蜜桔和北京檸檬被認(rèn)為是該病毒的最初來源，因北京檸檬的感病接穗在厚皮萊蒙植株上，能引起葉片黃斑、變小、葉緣破碎，故稱碎葉病。在我國(guó)的臨近地區(qū)如韓國(guó)、日本、菲律賓CTLV的發(fā)生也極其普遍，在南非、美國(guó)和澳大利亞的北京檸檬上檢測(cè)到了 CTLV。CTLV病毒為發(fā)狀病毒屬(JJeipillovirus)成員，是侵染柑橘的重要病原之一。CTLV病毒粒子為曲桿狀，大小約為600-700 nmX 13-15nm。致死溫度為60-70°C (lOmin)，稀釋終點(diǎn)10-4-10-5，體外保毒期為4-8 d。它主要通過嫁接和受污染的工具傳播，實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)昆諾黎、豇豆和大豆的種子可以傳播CTLV，至今還未發(fā)現(xiàn)昆蟲傳播介體。碎葉病毒在柑橘類植物中有廣泛的寄主，在本地早、早橘、朱紅、北京檸檬、文旦柚、蕉柑、興津早溫、宮川早溫、紅心柚、冰糖橙、大紅甜橙、雪柑、暗柳、新會(huì)橙、改良橙、森田臍橙、貢柑、砂糖柑等品種中都鑒定到CTLV。在日本發(fā)現(xiàn)野百合也是CTLV的寄主。人工汁液摩擦接種條件下，CTLV侵染豇豆、菜豆、黃瓜、煙草、向日葵、莧色藜、昆諾黎和克里夫蘭煙。柑橘碎葉病毒在昆諾黎的接種葉片表現(xiàn)黃色斑點(diǎn)，上部未接種葉片表現(xiàn)出明脈或皺縮，在克里夫蘭煙上表現(xiàn)為系統(tǒng)斑駁、花葉，在豇豆上表現(xiàn)為局部枯斑，在雞冠花上表現(xiàn)為局部環(huán)斑。CTLV在多種柑橘品種上存在隱癥現(xiàn)象，只有在一些敏感品種上才出現(xiàn)癥狀，且不同品種、不同接種條件和不同接種方式都會(huì)引起癥狀上存在一定差異。為了掌控柑橘發(fā)病狀況，強(qiáng)化我國(guó)柑橘碎葉病早期監(jiān)測(cè)和預(yù)警，科學(xué)指導(dǎo)防控，急需建立檢測(cè)柑橘中CTLV的高通量的檢測(cè)方法，而目前沒有這種高通量的檢測(cè)方法，僅用低效率的電鏡觀察、RT-PCR方法、核酸電泳等方法進(jìn)行小樣本檢測(cè)。本發(fā)明以原核表達(dá)的CTLV衣殼蛋白(CP)為抗原通過雜交瘤技術(shù)制備了 I株抗CTLV的特異性單克隆抗體，以制備的單抗為核心建立了檢測(cè)CTLV的高通量的血清學(xué)方法，并成功應(yīng)用于田間CTLV的檢測(cè)，從而為我國(guó)柑橘碎葉病毒病早期監(jiān)測(cè)和預(yù)警，防控策略提供物質(zhì)和技術(shù)支持。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種分泌抗柑橘碎葉病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其單抗應(yīng)用。
[0004]分泌抗柑橘碎葉病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株6C5,它能分泌抗柑橘碎葉病毒的特異性單克隆抗體，雜交瘤細(xì)胞株6C5保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC N0.8779。
[0005] 抗柑橘碎葉病毒的單克隆抗體腹水間接ELISA效價(jià)達(dá)10'抗體類型及亞類為IgGU kappa鏈，該單克隆抗體能與柑橘碎葉病毒27kD的外殼蛋白亞基有特異性免疫結(jié)合反應(yīng)。
[0006]抗柑橘碎葉病毒的單克隆抗體僅與柑橘碎葉病毒有特異性免疫反應(yīng)，而與柑橘衰退病毒、柑橘裂皮病類病毒、蕪菁花葉病毒、番爺花葉病毒、煙草花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、黃瓜花葉病毒、香蕉線條病毒、香蕉苞片嵌紋病毒均不發(fā)生免疫反應(yīng)；
抗柑橘碎葉病毒單克隆抗體在柑橘碎葉病毒檢測(cè)上的應(yīng)用是以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學(xué)檢測(cè)方法和免疫學(xué)試劑盒。
[0007]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的有益效果:1)提供的雜交瘤細(xì)胞株6C5分泌抗柑橘碎葉病毒特異性單克隆抗體，以該單抗為核心建立的TAS-ELISA和dot-ELISA等免疫學(xué)方法及用這些方法建立的試劑盒能高度特異、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)柑橘碎葉病毒；2)利用本發(fā)明所制備的單克隆抗體檢測(cè)柑橘碎葉病毒，不需要昂貴的電子顯微鏡、PCR儀等設(shè)備；3)利用本發(fā)明所制備的單克隆抗體，可有效地用于田間柑橘類樣品中的柑橘碎葉病毒的檢測(cè)。
【專利附圖】
【附圖說明】[0008]圖1是dot-ELISA方法檢測(cè)柑橘CTLV的靈敏度分析；
圖2是dot-ELISA方法檢測(cè)柑橘田間樣品中CTLV的結(jié)果；
生物保藏
雜交瘤細(xì)胞株6C5保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，郵編:100101，保藏日期為:2014年I月22日，保藏號(hào)為CGMCC N0.8779。
【具體實(shí)施方式】
[0009]分泌抗柑橘碎葉病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株6C5于2014年I月22日保藏于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC N0.8779，它能分泌抗柑橘碎葉病毒的單克隆抗體。
[0010]抗柑橘碎葉病毒的單克隆抗體腹水間接ELISA效價(jià)均達(dá)10'抗體類型及亞類均為IgGl、kappa鏈，該單克隆抗體能與柑橘碎葉病毒27kD的外殼蛋白亞基有特異性免疫結(jié)合反應(yīng)。
[0011]抗柑橘碎葉病毒的單克隆抗體僅與柑橘碎葉病毒有特異性免疫反應(yīng)，而與柑橘衰退病毒、柑橘裂皮病類病毒、蕪菁花葉病毒、番爺花葉病毒、煙草花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、黃瓜花葉病毒、香蕉線條病毒、香蕉苞片嵌紋病毒均不發(fā)生免疫反應(yīng)。
[0012]抗柑橘碎葉病毒單克隆抗體在該病毒檢測(cè)上的應(yīng)用是以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學(xué)檢測(cè)方法和免疫學(xué)試劑盒。
[0013]本發(fā)明提供的雜交瘤細(xì)胞株6C5能大量分泌抗柑橘碎葉病毒單抗，且其分泌的單抗特異性強(qiáng)、效價(jià)高、穩(wěn)定性好。以該單抗為核心建立了檢測(cè)CTLV的高通量的血清學(xué)方法及其試劑盒，可成功應(yīng)用于田間CTLV的檢測(cè)，從而為我國(guó)柑橘碎葉病早期監(jiān)測(cè)和預(yù)警，科學(xué)指導(dǎo)防控提供物質(zhì)和技術(shù)支持。
[0014]下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0015]一、雜交瘤細(xì)胞獲得及其單克隆抗體的制備1.免疫原及檢測(cè)抗原的制備
根據(jù)已報(bào)道的CTLV編碼外殼蛋白基因序列(登錄號(hào):FJ223212)設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物:CP-F (5' -TTGgfi^r<XATGAGTTTGGAAGACGTGCT~3'，劃線部分為 Bam/7 / 酶切位點(diǎn)和 CP-R (5' -TAAAG^TTCTAACCCTCCAGTTCC-3'，劃線部分為Xho I酶切位點(diǎn))，并由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。利用Trizol法提取柑橘病樣的總RNA，以總RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，37°C，15min逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，98°C 5min滅活酶后將cDNA保存于4°C或者_(dá)20°C待用。以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，即上述反轉(zhuǎn)錄的cDNA模板?μL，5XPrimeSTARTM Buffer (含Mg2+)ΙΟμΙ,?ΝΤΡ Mix 4μ1,PrimeSTARTM DNA PolymeraseC2.5 U/μ L)0.5μ1，上下游引物各 ?μL，最后加無菌雙蒸水補(bǔ)足反應(yīng)終體積為50μ1。PCR反應(yīng)參數(shù)如下:預(yù)變性94°C 2 min,變性940C 30 S，退火54°C 45 s,延伸72°C 45 s，循環(huán)擴(kuò)增35次，最后72°C延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物于0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，并用PCR凝膠回收試劑盒(AxyGEN)回收DNA片段，具體操作參照產(chǎn)品試劑盒說明書進(jìn)行。將純化的PCR產(chǎn)物末端加A與克隆載體pMD-18Tvector連接，重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-CP，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH 5α的感受態(tài)細(xì)胞中，用質(zhì)粒提取試劑盒(AxyGEN)提取重組質(zhì)粒，對(duì)提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，并通過測(cè)序驗(yàn)證重組克隆載體PMD18-T-CP中所攜帶的CP基因序列及讀碼框的正確性，序列分析軟件為DNAstar、NCB1-BLAST，所用的數(shù)據(jù)庫(kù)為GeneBank等。重組質(zhì)粒pMD18-T_CP中CP基因片段經(jīng)BanvY J和Xho /雙酶切后定向插入經(jīng)同樣酶切的pET-28a表達(dá)載體中。PCR、酶切篩選陽(yáng)性克隆，并通過測(cè)序驗(yàn)證重組原核表達(dá)載體pET-28a-CP中所攜帶CP基因序列未突變且讀碼框正確。并把原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-CP 42°C熱擊轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21 (DE3)中，挑取單菌落接種到含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過夜，按1:100的比例將培養(yǎng)物接種于含氨芐青霉素的新鮮LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至0D600~0.5，加入終濃度為I mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4 h，離心收集菌體。部分菌體加入I X SDS-PAGE上樣緩沖液懸浮，沸水中變性5-10 min, 12 000 rpm離心后取上清10 μL進(jìn)行12.5% SDS-PAGE電泳分析，其余菌體經(jīng)超聲波破碎，收集上清按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行用Ni2+-NTA親和層析柱純化目的蛋白。SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)純化到了大小為27kD的重組蛋白條帶，純度達(dá)到90%。以純化的重組CP蛋白作為免疫原和檢測(cè)抗原。
[0016]2.免疫動(dòng)物
用純化的CTLV CP蛋白免疫四周齡體重18-20g BALB/C雌性小鼠:純化的CP蛋白以生理鹽水稀釋與等體積福氏完全佐劑混合，充分乳化后，經(jīng)背腹部皮下多點(diǎn)注射0.2ml每只，間隔3周，取與一免等量抗原和等體積的福氏不完全佐劑充分乳化后，第二次腹腔注射
0.2ml每只，過3周后用加倍劑量的抗原進(jìn)行腹腔注射，3天后取脾細(xì)胞進(jìn)行融合。
[0017]3.細(xì)胞融合
取上述免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)按6:1的比例，在無血清的RPM1-1640 (Gibco)培養(yǎng)基中混勻，1500rpm離心5min，去除培養(yǎng)基，用50 % PEG (Sigma，分子量1500)作為融合劑，在37°C下水浴下加入1ml，使其融合2min，用無血清的RPM1-1640培養(yǎng)基終止融合后1500rpm離心5min，沉淀用HAT培養(yǎng)基懸浮，分裝到96孔含有飼養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞板中，37°C，5 % C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0018]4.雜交瘤細(xì)胞、陽(yáng)性孔的篩選及其克隆
細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后，用HAT培養(yǎng)基換液一次，第10天用HT培養(yǎng)基換液，等到融合細(xì)胞覆蓋孔底10%-50%時(shí)，以CTLV CP重組蛋白和感病葉子汁液為檢測(cè)抗原包被ELISA板，用常規(guī)間接ELISA方法篩選陽(yáng)性孔，共獲50多個(gè)陽(yáng)性孔。選擇7個(gè)呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)的細(xì)胞孔進(jìn)行有限稀釋法克隆，獲得I株能分泌抗CTLV的特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞株6C5。經(jīng)6個(gè)月以上體外傳代和多次凍存復(fù)蘇后，細(xì)胞株能良好生長(zhǎng)，并穩(wěn)定分泌抗體。經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，用于腹水制備和液氮保存。
[0019]5.單克隆抗體的特異性檢測(cè)
用感染蕪菁花葉病毒(TuMV)、番茄花葉病毒(ToMV)、煙草花葉病毒(TMV)、馬鈴薯X病毒(PVX)、馬鈴薯Y病毒(PVY)、黃瓜花葉病毒(CMV)、香蕉線條病毒(BSV)、香蕉苞片嵌紋病毒(BBrMV)、柑橘衰退病毒(CTV)和柑橘裂皮病類病毒(CEV)的病葉汁包被ELISA板，以相應(yīng)的健葉提取液作陰性對(duì)照，以感染柑橘碎葉病毒病葉為陽(yáng)性對(duì)照，用ACP-ELISA法測(cè)定單抗的特異性反應(yīng)。ACP-ELISA方法具體為上述病毒感染的病葉用液氮研磨成粉末，按1: 30(w/v, g /mL)加入ELISA包被液研磨后IOOul/孔包被ELISA板，4°C過夜或37°C 2小時(shí)，使其吸附于聚苯乙烯ELISA板孔；PBST洗滌三次后用3%的脫脂奶粉或1% BSA或4%牛血清封閉30-60min;加入單抗IOOul/孔，37°C 1-2小時(shí)；PBST洗滌三次后加入稀釋10000倍的堿性磷酸脂酶(AP)標(biāo)記兔抗鼠IgG 二抗(Sigma公司)100ul/孔，37°C 1-2小時(shí)，PBST洗滌四次后，用PNPP底物顯色，2mol/L氫氧化鈉終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀讀取OD4tl5的值，以與陰性O(shè)D值比值大于2.1為陽(yáng)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6C5單抗對(duì)CTLV有特異性反應(yīng)，而與柑橘衰退病毒、柑橘裂皮病類病毒、蕪菁花葉病毒、番爺花葉病毒、煙草花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、黃瓜花葉病毒、香蕉線條病毒、香蕉苞片嵌紋病毒和健康植物均無免疫反應(yīng)。
[0020]6.單克隆抗體腹水制備及純化
取8周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷(Sigma)，7_10天后腹腔注入5-10 X IO5個(gè)雜交瘤細(xì)胞，注射后7-10天可見小鼠腹部明顯膨大，采取腹水，3000rpm離心3min，收集上清液，即為單克隆抗體腹水。取I倍體積腹水加2倍體積0.06M PH4.8醋酸緩沖液稀釋，加辛酸(30ul/ml腹水),室溫下邊加邊攪拌，4°C澄清I小時(shí)，12000rpm離心20min,收集上清，再用50%飽和硫酸銨沉淀免疫球蛋白，4°C放置2小時(shí)，3000rpm離心20min，沉淀用2倍體積的PBS溶液溶解，在4°C流動(dòng)透析24小時(shí)后即獲純化的腹水抗體，-70°C保存。
[0021]7.單克隆抗體的類型和亞類鑒定及其腹水效價(jià)測(cè)定
將純化的單抗腹水與Sigma公司的標(biāo)準(zhǔn)抗BALB/C小鼠IgG1、IgG2aUgG2bUgG3^IgM抗體作雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述單抗的抗體類型和亞類為IgGl、kappa鏈。用間接ELISA方法檢測(cè)單抗腹水效價(jià)，結(jié)果為上述單抗腹水效價(jià)達(dá)到10 一 70
[0022]二、病毒免疫學(xué)檢測(cè)方法及其試劑盒 1.檢測(cè)CTLV的TAS-ELISA檢測(cè)方法
1.1.TAS-ELISA方法的操作流程:
1)抗CTLV的兔抗血清1:4000倍稀釋后(原核表達(dá)的CTLVCP重組蛋白免疫兔子獲得)IOOul/孔包被聚苯乙烯板，370C，2-4h或4°C，過夜；
2)PBST洗滌三次后加1-10%的脫脂奶粉或1-3% BSA或3_6%牛血清封閉200ul/孔于 37°C 封閉 30-60min ；
3)加入檢測(cè)樣品IOOul/孔。以CTLV病葉為陽(yáng)性對(duì)照，以相應(yīng)的健康樣品為作陰性對(duì)照，37°C 1-2h ；4)洗滌后用封閉液稀釋5000倍的單抗腹水IOOul/孔，37°Cl_2h
5)PBST洗滌后加入10000倍稀釋的AP標(biāo)記兔抗鼠IgG二抗(Sigma) IOOul/孔，37°C
1-2h
6)PBST洗滌后加PNPP底物于室溫顯色5-30min，肉眼觀察底物顏色變成黃綠色的孔為陽(yáng)性，2mol/L氫氧化鈉終止反應(yīng)后，用680型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)405nm的OD值，以P/N>
2.1作為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)。
[0023]1.2.TAS-ELISA檢測(cè)方法最適條件的確定:
采用TAS-ELISA方陣試驗(yàn)進(jìn)行，即橫向分別加用包被緩沖液從1: 100至1: 102400倍比稀釋的兔抗CTLV血清；加入CTLV病葉汁；縱向分別加用封閉液從1: 5至1:2048000倍比稀釋單抗腹水；AP標(biāo)記的兔抗鼠IgG 二抗(Sigma公司產(chǎn)品)1: 10000倍稀釋；按TAS-ELISA方法流程進(jìn)行操作。結(jié)果為CTLV的兔抗血清及單抗的最適稀釋度分別為I: 5000、I: 8000。
[0024]2.3.TAS-ELISA方法檢測(cè)靈敏度的確定
在兔抗血清和單抗腹水最適工作濃度下，將CTLV病葉汁用PBS倍比稀釋后進(jìn)行TAS-ELISA測(cè)定，結(jié)果表明TAS-ELISA檢測(cè)病葉達(dá)到1:6000倍稀釋(w/v，g /mL)，說明本方法具有很好的靈敏度。
[0025]2.dot-ELISA方法的建立及田間檢測(cè)應(yīng)用
2.1 dot-ELISA方法的操作流程:
將柑橘葉片稱重后用液氮研磨成粉末，按1:10~30 (w/v, g /!!11^)加入0.01 mol/LPBS (pH7.4)后研磨；病汁液5000 rpm離心3 min;取3 μ I上清點(diǎn)到硝酸纖維素膜(NC)上，同時(shí)設(shè)置健康和感病柑橘葉汁分別作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照；室溫干燥10~20 min; NC膜浸入到含5%脫脂奶粉的PBST (含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封閉液中室溫封閉30 min ； NC膜放入適度稀釋的單抗中室溫孵育30~60 min ;用PBST洗膜3~4次，每次3 min ； NC膜放入適度稀釋的AP酶標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗中室溫孵育30~60 min; PBST洗膜4~5次，每次3 min; 66 μ L NBT和33 μ L BCIP底物(Promega)加入到10 ml底物緩沖液(0.1 mol/L Tris C1、0.1 mol/L NaCl、0.025 mol/L MgCl、ρΗ9.5)混勻，膜放入底物液中反應(yīng)，肉眼觀察結(jié)果。待陽(yáng)性對(duì)照顯色明顯，而陰性沒有任何顯色時(shí)自來水漂洗終止反應(yīng)，拍照記錄結(jié)果。
[0026]2.2用方陣試驗(yàn)確定檢測(cè)柑橘病葉的dot-ELISA單抗和酶標(biāo)二抗的最適工作濃度，試驗(yàn)表明6C5單抗及酶標(biāo)二抗的最適工作濃度分別為1:5000和1:8000倍稀釋。以上述抗體的最適工作濃度建立檢測(cè)CTLV的dot-ELISA方法。靈敏度分析表明，當(dāng)柑橘葉片稀釋到1:640倍(w/v, g/mL)時(shí)，以6C5單抗建立的dot-ELISA檢測(cè)均呈現(xiàn)紫色的陽(yáng)性斑點(diǎn)，即其檢測(cè)病葉的靈敏度達(dá)到1:640倍稀釋(圖1)。
[0027]2.3建立的dot-ELISA方法的田間檢測(cè)應(yīng)用
用建立的dot-ELISA方法對(duì)2012、2013年采自浙江、重慶等田間疑似發(fā)病柑橘樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，50個(gè)柑橘科植物檢測(cè)樣品中有41個(gè)樣品產(chǎn)生紫色的陽(yáng)性斑點(diǎn)，部分樣品的檢測(cè)結(jié)果如圖2。陽(yáng)性樣品進(jìn)一步用RT-PCR分析，結(jié)果表明所有的dot-ELISA陽(yáng)性樣品均檢測(cè)到CTLV特異性的PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物核酸測(cè)序表明陽(yáng)性樣品感染CTLV。說明該dot-ELISA方法能準(zhǔn)確、可靠地用于柑橘類樣品中柑橘碎葉病毒的檢測(cè)。[0028]3柑橘碎葉病毒dot-ELISA檢測(cè)試劑盒
1)試劑盒主要成分:
CTLV單克隆抗體I管0.2 ml
AP標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗I管0.1 ml
NBT/BCIP底物各I瓶分別為2 ml和Iml
陽(yáng)性對(duì)照(含CTLV柑橘葉片汁液)I管2 ml
陰性對(duì)照(健康柑橘葉片汁液)I管2 ml
抗體稀釋液(IOX) I瓶80ml 以上試劑均保存于4°C下 硝酸纖維素膜(NC) 10張
2)檢測(cè)柑橘樣品的操作步驟:
a.將柑橘葉片稱重后用液氮研磨成粉末，按1:10~30(w/v, g /mL)加入0.01 mol/L PBS (pH7.4)后研磨；
b.病汁液5000rpm離心3 min;
c.取3μ I上清點(diǎn)到NC上，同時(shí)設(shè)置健康和感病柑橘葉汁分別作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照，室溫干燥10-20 min;
d.NC膜浸入到含5%脫脂奶粉的PBST (含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封閉液中室溫封閉30 min ；
e.NC膜放入1:2000倍稀釋的單抗中室溫孵育30-60 min ；
f.用PBST洗膜3~4次，每次3min ； NC膜放入1:3000稀釋的AP酶標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗中室溫孵育30~60 min;
g.PBST洗膜4~5次，每次3 min; 66 μ L NBT和33 μ L BCIP底物加入到10 ml底物緩沖液(0.1 mol/L Tris C1、0.1 mol/L NaCl、0.025 mol/L MgCl、ρΗ9.5)混勻，膜放入底物液中反應(yīng)，肉眼觀察結(jié)果；
h.待陽(yáng)性對(duì)照顯色明顯(紫色)，而陰性沒有任何顯色時(shí)自來水漂洗終止反應(yīng)，拍照記錄結(jié)果。
[0029]3)保存及有效期于2~8°C避光保存，有效期12個(gè)月。
[0030]4)緩沖液配方:
磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01 mol/L, ρΗ7.4):
NaCl8 g
KCl0.2 g
KH2PO40.2 g
Na2HPO412H203g
疊氮化鈉0.2 g
加蒸餾水950 ml溶解后調(diào)pH至7.4，定容至1000 ml，ELISA洗滌液(0.01 mol/LPBSTM000 ml 0.01mol/L PBS 中加 0.5 ml Tween-20，ELISA 封閉液:0.01 mol/L PBST 中加入脫脂奶粉至終濃度5% (W/V)。
【權(quán)利要求】
1.一種分泌抗柑橘碎葉病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株6C5，其特征在于能分泌抗柑橘碎葉病毒的特異性單克隆抗體，雜交瘤細(xì)胞株6C5保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC N0.8779。
2.一種如權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株6C5分泌的抗柑橘碎葉病毒的單克隆抗體，其特征在于該單克隆抗體腹水間接ELISA效價(jià)達(dá)10'抗體類型及亞類為IgGl、kappa鏈，該單克隆抗體能與柑橘碎葉病毒27kD的外殼蛋白亞基有特異性免疫結(jié)合反應(yīng)。
3.如權(quán)利要求2所述的雜交瘤細(xì)胞株6C5分泌的抗柑橘碎葉病毒的單克隆抗體，其特征在于該單克隆抗體僅與柑橘碎葉病毒有特異性免疫反應(yīng)，而與柑橘衰退病毒、柑橘裂皮病類病毒、蕪菁花葉病毒、番爺花葉病毒、煙草花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、黃瓜花葉病毒、香蕉線條病毒、香蕉苞片嵌紋病毒均不發(fā)生免疫反應(yīng)。
4.一種如權(quán)利要求2所述的抗柑橘碎葉病毒單克隆抗體在柑橘碎葉病毒檢測(cè)上的應(yīng)用，其特征在于以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學(xué)檢測(cè)方法和免疫學(xué)試劑盒。
【文檔編號(hào)】C07K16/10GK103911350SQ201410107759
【公開日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2014年3月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月21日
【發(fā)明者】吳建祥, 周雪平, 宋西嬌, 洪健 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)