靶向性抗腫瘤融合蛋白質lpo的制備和應用的制作方法

靶向性抗腫瘤融合蛋白質lpo的制備和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了靶向性抗腫瘤融合蛋白質LPO，它是將人工合成的目的基因片段LHRH-PEA轉膜肽-ONC（簡稱為LPO），插入PET28a質粒中，轉化至大腸桿菌BL21（DE3）中，表達的融合蛋白，經實驗證明融合蛋白LPO對有LHRH受體的，包括結腸癌LOVO細胞、肺癌A549細胞、口腔癌KB細胞、前列腺癌PC-3M細胞等腫瘤細胞系均有明顯的抑制作用，而對無LHRH受體的淋巴瘤Hut102和白血病HL60則無抑制作用，具有靶向特異性，安全可靠。
【專利說明】靶向性抗腫瘤融合蛋白質LPO的制備和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬生物【技術領域】，具體地說是靶向性抗腫瘤融合蛋白質LPO及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]隨著社會的發展與科技進步，人類逐漸擺脫了普通傳染病的困擾，惡性腫瘤(癌癥)業已成為人類生命的最大殺手。世界衛生組織最新研究數據顯示，到2020年全球癌癥發病率將增加50%，即每年將新增1500萬癌癥患者。不僅如此，癌癥的死亡人數也在全球迅猛上升。2007年全球有760萬人死于癌癥，預計2030年這個數字將會增加到1320萬，據國家衛計委發布的權威報告稱我國新發癌癥和因癌癥死亡病例數分別占全球的20%和24%。所以，惡性腫瘤的治療成了當今醫學的重要任務。
[0003]核糖核酸酶(RNase)普遍存在于自然環境和人體內，它們可以通過降解細胞內的核糖核酸而殺死細胞。肝臟細胞內大約含20余種核酸內切酶和外切酶，它們參與RNA代謝、細胞成熟及凋亡、促進新生血管形成、主動防御RNA病毒等生物學作用。盡管核糖核酸酶大量存在，但由于核糖核酸酶抑制劑(RI)的抑制作用，并未對組織細胞造成傷害。
[0004]RNase A超家族主要成員有RNase A、人胰臟核糖核酸酶、嗜曙紅細胞衍生神經毒素、嗜曙紅陽離子蛋白 、血管生成因子、牛精液核糖核酸酶和兩棲類核糖核酸酶(如豹蛙酶和牛蛙凝集素)等。RNase A超家族通過降解RNA發揮作用，其家族成員具有相似的氨基酸序列和三級結構，一般含有4對二硫鍵(血管生成因子含有3對二硫鍵)，并且都含有相同的催化三聯體，包括2個組氨酸和I個賴氨酸。由于該家族的許多成員來源于人或哺乳動物，它們的免疫原性比來源于植物或微生物的要低。
[0005]豹蛙酶，起初叫做P-30蛋白，后注冊名為Onconase(簡稱ONC)，在十九世紀70年代時，Shogen和Yoon最先在北極豹蛙的胚胎內分離提出一些帶有抗癌活性的提取物。于1987年，Alfacell M分離純化出其主要活性成分。那些活性物質是一種小的(大約12kDa)母性起源(目前大量存在于未受精的卵母細胞中)的堿性蛋白。它完整的結構在Shailendra K.Saxena等人的實驗室中被確定。它由104個氨基酸殘基組成，相對分子質量為1183?a，等電點為9.7，其序列與胰臟核糖核酸酶A (RNase A，EC 3.1.27.5)和核糖核酸酶超A家族的其他成員十分的相似，與RNase A有30%的堿基序列同源，并且三級結構相似，是已知的胰核糖核酸酶超家族成員中最小的單結構域蛋白。單就核糖核酸酶活性而言，RNase A要高于豹蛙酶和牛精液核糖核酸酶(BS-RNase)，但由于受到RI的抑制，RNase A對腫瘤細胞沒有殺傷效果；兩棲類動物體內的RNase A由于可以避開RI，故有殺傷腫瘤細胞作用。尤其是豹蛙酶，是首個進入III期臨床研究的核糖核酸酶類藥物，主要用于治療惡性間皮瘤，目前治療非小細胞肺癌的研究也已經進入了臨床II期試驗階段。
[0006]ONC與已知的RNase A結構相似，由2個反向平行的β片層和3個α螺旋結構組成了的腎形核結構，其酶活性中心是一個保守的催化三聯體。RobertF.Gahl等人在試驗中發現ONC氧化折疊過程中會形成穩定的中間體，這樣可以保持它的有效活性形式。Daniel E.Holloway等人第一個報告了在IOOK和復雜硫酸根離子中，ONC在原子分辨率下的晶體結構，在一個質量足夠大的電子密度圖中明顯的顯示出了幾個非平面的肽鍵，可以非常容易確定其活性中心的大多數氨基酸殘基。
[0007]為了確定ONC蛋白質中負責毒性的氨基酸殘基，You-Di Liao等人從染色體組克隆豹娃的rpr基因，并在大腸桿菌BL21 (DE3)中進行了多種形式的表達。表達方法一:將甲硫氨酸排列在ONC重組體的N-末端，結果發現該重組蛋白熱穩定性減小且催化活性和抗原性降低。他們利用依賴內源性大腸桿菌甲硫氨酸氨基肽酶和apelB信號肽切割兩種方式生產了沒有甲硫氨酸的0NC，發現重組蛋白與天然來源的ONC的物理、化學、生物特性基本相符。同時證明在ONC的N-末端具有尿苷-鳥嘌呤底物偏愛性的焦谷氨酸，完整且外露的N-末端焦谷氨酸對豹蛙酶的細胞毒性有較大的幫助作用。
[0008]與RNase A相比，ONC特有的結構特征是它N端的內酰胺和C端的二硫鍵。豹蛙酶N端Gln反向折疊緊靠N端螺旋，與側鏈Lys9的氮基和C端β片層上Val96的羰基基團形成氫鍵網絡。Didnato等證明將Met加到豹蛙酶N端后，突變體對所有RNA的催化作用和對腫瘤細胞的毒性都顯著降低，說明該環化結構對豹蛙酶的核糖核酸酶活性和細胞毒性至關重要。整個蛋白分子含有4個二硫鍵，其中Cys87-Cysl04形成的C端二硫鍵只存在于兩棲類的RNase A中，是穩定其酶活性的一個重要結構域。ONC是一種結構穩定性很強的蛋白，在PH6.0時變性溫度可以達到90°C，藥物體內半衰期也可長達3h。除了 N端內酰胺和C端二硫鍵外，酶分子內部的疏水環境也起到了穩定構象的作用，這很有可能是導致它的RNA酶活性和腎毒性的重要原因。突變體(M23L)-ONC完全保留了抗腫瘤活性，有可能降低腎毒性但穩定性有所降低。
[0009]YouNeng Wu等人用I125標記0NC，并使ONC結合在人工培養的9L神經膠質瘤細胞的特殊結合位置。經Scatchard方法分析標記結果,證明ONC與9L神經膠質瘤細胞的結合位點有兩個，其解離常數分別為Kd = 6.2 ΧΙΟ—8和Kd = 2.5 ΧΙΟ—7。每細胞可以結合3 X IO5個ONC分子，低位結合位點的解離常數與IC50相似，ONC結合在細胞上擴大培養，溫度從4 °C升高到37°C，可以增加細胞對ONC毒性的敏感性。代謝抑制劑、疊氮鈉和脫氧葡萄糖可以抑制ONC的細胞毒性，而莫能菌素可以使細胞毒性增大十倍。因為對于ONC毒性來說，ONC分子烷基化是核糖核酸酶活性的必要條件，可以增強抑制細胞內蛋白合成能力。在9L細胞中ONC抑制蛋白質合成恰巧與細胞內的降解相符合，作用靶標均為28s和18sRNA亞基。與核糖核酸酶A相比，ONC能抵抗兩種RNA酶的降解，一種是胎盤核糖核酸酶，另一種是ACETM抑制劑。
[0010]Robert F.Gahl等人證明了 ONC是一種特殊的RNA酶，它具有選擇性細胞毒性。ONC的細胞毒性依賴于AP-2/網格蛋白介導的內吞作用，通過內吞小泡的內化作用進入細胞，降解細胞的RNA從而殺死細胞。Intae Lee等在A549人肺癌移植的裸鼠身上研究核糖核酸酶ONC的抗癌作用時發現ONC是通過分解t-RNA來阻止蛋白質合成作用方式來殺死腫瘤細胞的，這也許可以作為一種替代順鉬治療肺癌的新型方式。
[0011]ONC能夠明顯地抑制A549腫瘤細胞的生長，且具有顯著的劑量依賴性。在動物實驗中，多次給予小劑量的ONC比一次性大劑量有效，而且副作用少。ONC與順鉬聯合用藥的方式能更加顯著的減少腫瘤細胞生長,但對 于相對較大的腫瘤體來講,ONC可以抑制腫瘤細胞的生長，然而順鉬則不能。[0012]Shailendra K.Saxena等研究表明ONC的細胞毒性主要是針對tRNA的降解。他們將ONC加入到正在生長的哺乳動物細胞培養基中能產生諸如細胞抑制性、細胞毒性和抗病毒活性作用，ONC進入活的哺乳動物細胞中可以有選擇性的并且不被察覺的分解tRNA。此外，ONC可以在體外專一性的利用網織紅細胞裂解液和純凈RNA底物，而在體內顯示出對tRNA降解的驚人專一丨生,而rRNA和mRNA卻完好無損。
[0013]Mihail S.1ordanov等在研究ONC誘導細胞凋亡的分子決定簇時，表明其對細胞的毒性機制不同于蛋白質合成抑制作用。ONC作用的細胞出現凋亡，同時伴隨細胞皺縮，細胞核固縮乃至破裂(核裂解)，核內DNA發生裂解，同時激活半胱-天冬氨酸酶，現有證據證明ONC存在一種誘導細胞凋亡的機制，該凋亡機制可以獨立抑制蛋白合成。使用半胱-天冬氨酸酶抑制劑節氧羰基-Val-Ala-Asp (OMe,奧美拉唑)氟酮(zVADfmk),在一定的濃度時可以完全阻止ONC引起的細胞凋亡。由此可見，ONC對細胞的毒性作用只要表現在兩方面:首要作用是降解細胞的tRNA抑制細胞蛋白質合成，引起細胞死亡，次要作用啟動細胞的凋亡機制，引起細胞凋亡。因此，ONC可以作為強有力的抗癌藥物候選蛋白。由于ONC通過內吞作用進入細胞，對細胞的選擇性較差，在成藥性研究方面不得不考慮其對人體正常細胞的殺傷而引起較大的副作用。
[0014]基于上述原因，我們在藥物設計方面進行了較大改進，為使ONC在體內發揮最大的腫瘤細胞殺傷作用，減小副作用，必須使ONC分子有效地選擇腫瘤細胞，同時增加ONC進入細胞的效率。
[0015]基于受體-配基的特異性結合理念，使用LHRH受體的配基LHRH(亦稱為GnRH)的類似物進行靶向抗腫瘤藥物的導向組分加以利用成為當前抗腫瘤藥物設計的一個重要方向。
[0016]使用LHRH的激動劑和抑制劑進行性腺依賴性前列腺癌治療已經有30余年的歷史，如1982年Schally等撰文說明應用合成的LHRH激動劑類似物治療前列腺癌獲得了重大成就，一方面減輕了患者物理去勢的精神負擔，而且獲得了滿意的腫瘤抑制和治療作用。
[0017]在癌組織表面高親和力的`LHRH受體是通過一些未知的原因演變而來的。這種假設已經在鼠身上初步得到證實，在正常的倉鼠胰腺細胞膜上用RLA法測不到LHRH受體，經誘導產生胰腺腫瘤后，在相應的細胞膜上測到了高親和力的LHRH受體，而且在成瘤初期即可檢測到。通過RT-PCR法、免疫組化定位法和放射性配體分析法(RLA)等多種方法檢測證明了 LHRH受體是癌組織、細胞的新靶標。Kakar (1995)在乳腺癌和前列腺癌組織及子宮內膜癌和卵巢癌組織和細胞株中發現了與垂體相似的高親和力LHRH受體，并提出86%的前列腺癌、50%的乳腺癌及80%的卵巢癌和子宮內膜癌有高親和力LHRH受體分布。
[0018]我們通過長期新藥研究工作和國外眾多文獻證明促黃體激素釋放激素受體(LHRHR，亦稱為促性腺激素釋放激素受體，GnRHR)在腫瘤組織細胞表面呈特異性分布，已確認為腫瘤的新靶標。
[0019]以LHRH為靶向的抗腫瘤藥物的設計是基于配基-受體特異性結合及受體在腫瘤細胞表面超表達的事實而確立的。
[0020]人LHRHR是由328個氨基酸組成的單鏈蛋白質，它形成胞外和胞內環形結構相連的7個跨膜區，具有G蛋白偶聯受體的結構特點。LHRH受體最早發現于垂體，承接下丘腦產生的促黃體激素釋放激素(LHRH)，促使垂體分泌促性腺激素LH和FSH，后兩者作用于性腺，從而發揮對性腺功能的調節作用。近年來隨著對LHRH及其受體研究的深入，越來越多的臨床和實驗證據表明LHRH受體在癌組織中呈現特異性廣泛分布。
[0021]Bono等(2002)研究了前列腺癌變及良性標本上LHRHR的分布及特征，同時測定并比較了多種組織中LHRH受體mRNA的表達，結果顯示86%的癌變標本膜蛋白對[DTrp6]LHRH表現特異性高親和力，同時有86%的前列腺癌細胞表面表達LHRH受體，在良性前列腺組織中亦可見LHRH受體基因表達，但其含量和親和力顯著低于癌變組。
[0022]S.Dharap等(2005)用定量RT-PCR檢測并分析了編碼LHRH受體的cDNA在多種細胞、組織勻漿中的基因含量及受體蛋白表達量。測定了人卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌以及多種正常器官組織包括心、肝、脾、肺、腎、腦、胸腺和骨骼肌中(包括同一患者的卵巢癌組織和正常組織)LHRH受體的含量。結果表明在腫瘤細胞內LHRH受體的基因是豐富的且受體蛋白是超表達的，然而在心、肝、脾、肺、腎、腦、胸腺和骨骼肌等正常組織細胞中卻沒有檢測到LHRH受體基因，同時亦未檢測到受體蛋白表達。
[0023]Grundker (2002)、Schally (2005)利用合成的 LHRH 類似物[DLys6]作為導向物，以阿霉素或其衍生物為藥物組分，偶聯成3種LHRH-阿霉素(DOX)或其衍生物:AN152、AN201、AN207，這些藥物可以通過LHRH特異性結合腫瘤細胞，并通過阿霉素或阿霉素衍生物發揮細胞毒性作用，特異性殺滅腫瘤細胞，其抑瘤效果遠遠優于單純LHRH類似物和阿霉素或其衍生物，并大大延長了荷瘤裸鼠的生存時間和存活數量。而且與單純阿霉素使用相t匕，用藥劑量可以提高到阿霉素的5倍以上(摩爾劑量比)。該項目作為德國、美國政府資助項目已經完成了一期臨床試驗，單日用藥劑量達到267mg/m2，在乳腺癌、前列腺癌治療方面獲得了一致認可(參見美國專利5843903)。同時他們還進行了特異性RT-PCR和RLA檢測LHRHR的分布表明:LHRH受體主要分布在多種腫瘤組織、細胞表面，正常的卵巢、子宮內膜、輸卵管等生殖系統器官中僅含極痕量的受體，其它正常組織如心臟、肝臟、肺臟、肌肉和骨骼等均無LHRH受體的分布。
`[0024]我們在抗癌新藥LHRH-PE40的研發過程中進行的靶標確認實驗，確定了口腔癌、鼻咽癌、食管癌、肺癌、腸癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌、人黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、上皮癌等多種腫瘤細胞表面含有高親和力LHRH受體(參見中國專利ZL99122205.9)。
[0025]我們進行的LHRH-PE40藥效學研究，發現荷瘤裸鼠利用LHRH-PE40尾靜脈給藥治療，抑瘤率達到60%以上，合成的LHRH類似物+LHRH-PE40混合物賦予荷瘤裸鼠，抑瘤率降為40%，單純給予LHRH類似物，荷瘤裸鼠的抑瘤率為23%，這個實驗說明LHRH-PE40通過LHRH結合腫瘤細胞表面的LHRHR，將藥物特異性作用于腫瘤組織，達到腫瘤治療作用，LHRH類似物+LHRH-PE40混合物治療荷瘤裸鼠，抑瘤率降低說明LHRH類似物可以競爭性的結合LHRH受體，阻止LHRH-PE40的抑瘤作用。單純LHRH類似物也具有一定的抑瘤作用，只不過抑瘤效率相對較低。這些實驗充分說明了 LHRH作為腫瘤靶向治療的實用性意義。

【發明內容】

[0026]本發明的目的是提供靶向性抗腫瘤融合蛋白質LP0。
[0027]基因片段，它的喊基序列如序列表SEQ ID NO:1所不；
融合蛋白質LP0，它的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0:2所示；融合蛋白質LPO的制備方法，它包括:
1)人工合成如序列表SEQID NO:1所示的基因；
2)利用Nco1、EcoRI雙酶切PET28a質粒和序列表SEQID NO:1所示的基因，連接，構建質粒PET28a-Z/^轉JM109工程菌擴增；
3)陽性質粒轉化感受態大腸桿菌BL21(DE3)中，誘導表達；
4)純化。
[0028]本發明的另一個目的是融合蛋白質LPO在制備抗腫瘤中的應用；
所述的腫瘤為有LHRH受體的腫瘤；
所述的腫瘤為結腸癌L0V0、肺癌A549、口腔癌KB或前列腺癌PC-3M。
[0029]發明詳述，綜合我們多年基礎研究和LHRH-PE40新藥研究以及國外同行研究經驗，我們認為LHRH可以作為抗腫瘤藥物的靶向分子加以利用，在知識產權不沖突的情況下，我們利用設計更為合理的LHRH類似物-抗腫瘤藥物組合物，開發抗腫瘤新藥。
[0030]首先在LHRH類似物的選擇上我們進行了大量的篩選工作，基于天然LHRH為十肽的活性多肽鏈，PGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2,由于首位氨基酸為焦谷氨酸，基因工程表達合成有一定難度，世存類似物大多缺省或將之突變為谷氨酸，但經過我們多年基因表達LHRH-毒素融合蛋白的經驗和后續的藥理藥效活性試驗，證明首位氨基酸突變為谷氨酰胺更能發揮其受體識別、結合能力，故此，我們設計合成了首位氨基酸突變為谷氨酰胺的密碼子。再由于天然LHRH第六位氨基酸為甘氨酸，其受體親合力較低，體內半衰期僅為5min，所以我們將其第六位甘氨酸也進行了人為突變，利用色氨酸(Trp)替代甘氨酸，其受體結合能力提高7-10倍，半衰期達到2小時，有利于藥物在體內的完整性和長效性，參考綠膿桿菌外毒素A和白喉毒素結構特點和入胞機制，在LHRH的C末端加入一個公認的轉膜肽，使之尾部形成Furin酶切識別位點，一旦藥物組合物結合到腫瘤細胞表面，在受體作用下形成內吞小泡時，內吞小泡中的Furin酶在pH5.2時發揮酶切作用，將抗腫瘤藥物主動轉運至腫瘤細胞內。
[0031]本文中所使用術語“LP0”，是指經過詳細的設計，利用基因合成技術獲得基因序列和片段，經過基因工程操作使之能夠在大腸桿菌中獲得高效表達，純化的蛋白質能夠在體內外具有靶向抗腫瘤作用的蛋白質。
[0032]文中所用的氨基酸符號為本領域通用的三字母縮寫符號，其中為了基因連接方便在基因合成時于融合基因5'端添加了 NcoI限制性內切酶識別位點，并利用NcoI限制性內切酶識別位點中的ATG作為首位啟動密碼子，翻譯表達融合蛋白首位氨基酸Met。同時在融合的蛋白基因的3'端加入限制性內切酶EcoRI的識別序列GAATTC，以便使基因片段和載體連接時均形成粘性末端，利于基因連接。為使表達產物達到高效表達，將大腸桿菌偏性密碼子引入到其中，以使表達產物適合在大腸桿菌中表達。
[0033]本文中所使用術語“IC50”是指利用中國生物制品規程所描述的生物制品對腫瘤細胞活性檢定標準方法測定的半數細胞致死濃度，即利用體外培養的人腫瘤細胞達到半數抑制時藥品的濃度(參考中國藥典附錄，抗腫瘤藥物生物活性測定法，其濃度以μ g/ml表示)。
[0034]本發明進一 步涉及以重組DNA技術生產多種類蛋白質或多肽串聯融合表達目的蛋白質的方法，該方法包括:⑴提供攜帶T7強啟動子且含有多克隆位點的表達載體；⑵人工合成基因串聯連接的編碼基因序列，以正確的閱讀框架將其克隆到線性化的步驟(1)的表達載體中用步驟(2)的表達載體轉化適當的宿主細胞；⑷在適于表達融合蛋白質的條件下培養所說的被轉化的宿主細胞；(5)從細胞培養物中利用適當的純化工藝回收并純化所說的融合蛋白質。
[0035]用于構建本發明的融合蛋白質的LPO分子是以N端Met為起始的蛋白質分子，增加酶切位點后，為了調整0RF，在ATG密碼子后增加了 Gly的密碼子GGC，其后是LHRH的序列，為了增加LHRH與其受體的結合能力和延長其半衰期，將LHRH序列中第六位氨基酸由Gly替換為Trp。完整的LHRH十肽序列之后緊接著連接PEA的轉膜和furin酶識別的十肽序列，最后連接ONC的104個氨基酸，并以終止密碼子TAA結束。
[0036]由于暫時缺乏作為本發明融合LPO分子的現成序列，所以在本發明中使用通用的DNA合成儀在1000A固相載體上合成編碼這些融合蛋白的核苷酸序列。為了便于與特定重組載體進行連接，可在合成的融合蛋白基因序列的5’和/或3’端引入適當的核酸內切酶(如NcoI和EcoRI)酶切位點，并造成適于連接的粘性末端。可按照本領域技術人員已知的重組技術，克隆編碼這些合成的閱讀框架通暢的基因(或以其cDNA或基因組DNA形式)，DNA重組操作中，一般使用標準的基因克隆和亞克隆技術進行基因片段的轉移和連接。使用限制性酶切法鑒定序列連接方向的正確性和可能的突變，最后以DNA測序進行序列確認。
[0037]這里應特別指出的是，由于相對于LHRH分子來講，融合表達的轉膜肽和ONC部分分子量偏大，所以由三者產生的融合蛋白質中很可能形成新的高級空間構象，導致前導部分的卷曲被包裹，影響ONC的活性和空間構像。然而通過技術人員計算機分析和園二色譜檢測證明LPO蛋白質分子是以正確的二硫鍵形式進行折疊的。
[0038]重組蛋白質基 因將被可操縱地連接到適當的表達控制序列上，如連接到適于在大腸桿菌中使用的T7、trp或λ啟動子、核糖體結合位點及轉錄終止信號上。可使用已知的轉化方法，如適于原核細胞的氯化鈣處理法或適于哺乳動物細胞的電穿孔法將本發明的重組質粒轉化到選擇的宿主細胞中。可基于質粒上所含抗生素抗性基因所賦予的抗生素抗性來選擇被轉化的陽性細胞。一旦表達了所需的融合蛋白質，即可按照本領域已知的方法分離并純化該融合蛋白質。例如，可從發酵培養物中離心收集菌體細胞并用溶菌酶和超聲波裂解之，然后超速離心并在低濃度磷酸鹽(20mM)、尿素溶液中進行包涵體洗滌，然后利用8M尿素裂解包涵體，獲得的蛋白質通過復性劑存在下恢復天然結構。然后依次經離子交換層析(IEC)和疏水層析、凝膠過濾層析純化所需的LPO重組蛋白質。
[0039]一般說來，使用聚丙烯酰胺凝膠以SDS-PAGE電泳法分析各柱層析洗脫部分，并以免疫印跡法監測之。對重組融合蛋白質純化產物進行腫瘤細胞抑制試驗以檢測重組蛋白質的生物學活性(具體操作見中國生物制品規程2010版)。
[0040]可將本發明的LPO蛋白質作為基本活性成分，并加入一種或多種醫藥上可接受的載體或賦形劑，制成適于臨床應用的藥物組合物。所說的載體或賦形劑包括但不只限于磷酸鹽緩沖液、生理鹽水、等滲葡萄糖溶液、葡聚糖、右旋糖苷等。根據所治療的疾病的不同，可在本發明的藥物組合物中加入一種或多種與本發明的蛋白質有輔助或協同作用的其他天然的、合成的或重組的活性化合物。另外，可在本發明的藥物組合物中加入低分子量肽、甘氨酸或賴氨酸及金屬陽離子(如Zn2+、Mn2+、Mg2+和Ca2+)的蛋白質保護劑，以及聚乙二醇、羧甲基纖維素、多聚甘氨酸、谷胱甘肽的穩定劑。[0041]可以通過常規給藥途徑，特別是胃腸道外途徑投用本發明的藥物組合物，例如通過靜脈內、腹腔內、肌肉內、皮內、皮下或粘膜內途徑給藥。本發明藥物組合物的有效劑量范圍可從幾毫微克至幾十毫克/公斤體重/天，但針對每個特定病人的具體用藥劑量將根據待治療疾病或病理狀態的性質及嚴重程度、病人的年齡、體重、對藥物的反應能力及給藥方式等因素而定。
[0042]我們的實驗室已證明本發明的LPO蛋白質對包括結腸癌LOVO細胞、肺癌A549細胞、口腔癌KB細胞、前列腺癌PC-3M細胞等腫瘤細胞系均有明顯的抑制作用，而對無LHRH受體的淋巴瘤Hutl02和白血病HL60則無抑制作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0043]圖1顯示用于表達融合蛋白的重組質粒構建圖。
【具體實施方式】
[0044]以下借助實施例進一步闡明本發明，但本領域技術人員可以意識到，這些實施例并不構成對本發明待批權利 要求范圍的限制。
[0045]實施例1:LP0表達載體和工程菌的制備 重組表達質粒的構建與鑒定
a.基因合成:本發明中按照前文所述的設計理念進行酶切位點和LPO全基因序列的設計并人工體外合成如下序列:
NcoI內切酶識別序列(CCATGG)+GC+LHRH多肽基因+PEA轉膜肽+ONC序列+終止密碼子(TAA)+EcoRI內切酶識別序列(GAATTC)，基因序列見SEQ ID NO: 1，本合成序列直接克隆入大連Takara公司提供的T載體中，并轉化大腸桿菌JM109細菌，經PCR鑒定確定陽性克隆株，陽性克隆株擴大培養，常規分子克隆技術提取質粒DNA，利用NC01、EC0RI雙酶切本質粒和PET28a質粒，回收目的片段和PET28a質粒載體粘性末端片段，以正確的閱讀框架在T4連接酶(Promega)存在下將目的片段插入到同樣酶切的PET28a質粒載體中，構建融合蛋白雙鏈表達基因并轉化JM109工程菌。
[0046]b.經PCR鑒定確定陽性克隆株，陽性克隆株擴大培養，常規分子克隆技術提取質粒DNA，利用Nco1、EcoRI雙酶切PET28a_LP0質粒進行鑒定，正確者進行DNA測序，然后陽性質粒轉化感受態大腸桿菌BL21 (DE3)，并將被轉化的細菌培養于含卡那霉素(50 μ g/ml)的LB培養基中，以擴增質粒DNA。培養完成后，破碎細胞，離心收集質粒并純化質粒DNA測序，測序正確的質粒將被轉化大腸桿菌菌株，用酶切鑒定法和瓊脂糖凝膠(2%)電泳法進行鑒定，然后陽性重組質粒進行DNA序列分析。
[0047]圖1:顯示了重組質粒pET28a_LP0的構建。
[0048]實施例2 =LPO融合蛋白質的表達及產物的純化:
將攜帶重組基因質粒轉化的大腸桿菌BL21 (DE3)(含有T7 RNA聚合酶基因)培養在含有卡那霉素(50μ g/ml)的LB瓊脂平皿上。培養后挑選卡那霉素抗性菌落，于含卡那霉素(50 μ g/ml)的LB培養基中37°C培養，當A_達到約0.4^0.6時加入ImM異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)(終濃度lmM)，37°C繼續培養3-4小時，以誘導目的產物的表達。然后離心分離細胞和培養基，并將含有目的蛋白質的菌體中加入緩沖液成分，終濃度達 50mM Tris-HCl, pH8.0, ImM EDTA,超聲破碎，4°C離心(20，000g, 30 分鐘)，取沉淀(不可溶性部分)即為融合蛋白粗提物。
[0049]粗提物經過洗滌、變性-復性處理，獲得的復性蛋白質進行離子交換層析純化:緩沖液平衡的 DEAE-Sepharose Fast Flow 柱(Pharmacia),用含有 O~0.5M NaCl 的 TE 緩沖液(20mM Tris-HCl，pH8.0, ImM EDTA)連續梯度洗脫，并收集蛋白質各組分峰部分。目的組分峰部分經小型中空纖維超濾器(Milipore)作用30分鐘超濾濃縮換液加鹽后，使濃縮物含終濃度 1.15M NaCl，用 20mM Tris-HCl, ρΗ8.0, 1.15Μ NaCl 緩沖液平衡 XK 1.6X20cmPhenyl-Sepharose Fast Flow柱(Pharmacia),然后上樣、緩沖液洗漆流川峰,最后利用含有 1.15M -0.05M NaCl 的緩沖液(20mM Tris *HC1, pH8.0)進行 100%_0% 梯度洗脫。收集目的蛋白峰部分，利用小型中空纖維超濾器(Milipore)濃縮目的蛋白至2mg/ml。利用20mMPB, pH7.0,0.15M NaCl 緩沖液平衡 XK 1.6X 100cm Superdex75 凝膠過濾柱(Pharmacia),利用上樣環注入樣品5ml,流速lml/min進行凝膠過濾分離純化,收集蛋白質峰值(A28tl)部分于-20°C下儲存備用。如此純化的蛋白質純度>97%。
[0050]實施例3:利用體外培養的腫瘤細胞抑制法測定融合蛋白的生物學活性作用，(具體操作參考中國藥典2010版第三部附錄XC)。
[0051]細胞病變抑制試驗:
將培養的人腫瘤細胞單層細胞經胰蛋白酶消化，吹打收集細胞懸液，利用細胞計數板記數后，調整細胞數量為60000個/ml，按照80 μ I/孔加入到96孔培養板中(每孔5000細胞)，5% 0)2，371:條件下培養411。調整制備的LPO蛋白質樣品濃度為lmg/ml，定量的樣品經過濾除菌，按等倍稀釋法將不同量的樣品加入各細胞孔中，然后補足培養基，使之總體積為100 μ 1， 5% C02，37°C條件下培養24h。然后棄去細胞板中上清液，每孔加入50 μ I染色液，室溫放置30min后,用流水沖去染色液,并吸干殘留水分,每孔加入脫色液100 μ 1，室溫放置5min，混勻后，用酶標儀以630nm為參比波長，在波長570nm出測定吸光度，記錄測定結果。
`[0052]實驗數據采用計算機程序進行參數回歸計算:對各實驗樣品的各實驗點OD值、預稀釋倍數、樣本梯度等數據采用計算機程序進行處理。分別計算各實驗樣品的半效稀釋倍數并計算50%效應點的濃度(結果下表)。
【權利要求】
1.基因片段2/--，它的堿基序列如序列表SEQID NO:1所示。
2.融合蛋白質LPO，它的氨基酸序列如序列表SEQID N0:2所示。
3.融合蛋白質LPO的制備方法，它包括: 1)人工合成如序列表SEQID NO:1所示的基因； 2)利用Nco1、EcoRI雙酶切PET28a質粒和序列表SEQID NO:1所示的基因，連接，構建質粒PET28a-Z/^轉JM109工程菌擴增； 3)陽性質粒轉化感受態大腸桿菌BL21(DE3)中，誘導表達； 4)純化。
4.權利要求2所述的融合蛋白質LPO在制備抗腫瘤藥物中的應用。
5.根椐權利要求4所述的應用，其特征在于:所述的腫瘤為有LHRH受體的腫瘤。
6.根據權 利要求5所述的應用，其特征在于:所述的腫瘤為結腸癌L0V0、肺癌A549、口腔癌KB或前列腺癌PC-3M。
【文檔編號】C07K19/00GK103820479SQ201410082513
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月8日 優先權日:2013年12月21日
【發明者】張國利, 史飛, 李澤鴻, 田園, 劉雨玲, 岳玉環, 吳廣謀 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所