一種可增強植物光合作用的蛋白及其編碼基因和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種可增強植物光合作用的蛋白及其編碼基因和應用，本發明所公開的蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示，其編碼基因核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示，本發明還公開了該蛋白及其編碼基因在增強植物光合作用中的應用。將本發明的基因轉化目的植物后，轉基因植物出現氣孔增多、光合效率提高的生理特征，能夠更加高效的利用二氧化碳并且耐受高濃度的二氧化碳濃度，若廣泛應用，既可以增加作物的產量，又可以有效減少大氣中的二氧化碳濃度，緩解溫室效應帶來的影響。
【專利說明】一種可增強植物光合作用的蛋白及其編碼基因和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學【技術領域】，涉及一種可增強植物光合作用的蛋白及其編碼基因和應用。
【背景技術】
[0002]由于我國的可利用性耕地資源的逐步減少，使得糧食安全成為了國家性的一個重大戰略性問題，在當前報賬糧食安全作為我國長期國策的背景下，如何實現糧食作物產量水平的持續提升是橫貫在我國社會經濟、農業科技前進道路上的一道難題。
[0003]光合作用是決定作物產量的最重要因素之一，作物中90%以上的干重直接來源于光合作用。植物氣孔(Plantstomata)是植物與外界進行氣體交換的重要通道，是影響植物光合作用的一個重要因素，氣孔的開度和氣孔的密度決定了植物光合作用的能力和效率。目前，在雙子葉模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)的氣孔圖式發育的研究中，氣孔蛋白(Stomagen) /氣孔蛋白前體(ST0MAGEN)是唯一一個正向調控氣孔生成的分泌肽類信號蛋白，通過增加植株體內氣孔蛋白的數量可增加葉片的氣孔密度，并且能夠使植株的光合速率提高30%。
[0004]幾十年來，世界作物學家一直致力于通過改良植物氣孔數目來提高糧食作物光合作用碳同化效力、培育出高光效、高水分利用率、高產量糧食作物的育種研究，當前，通過基因工程育種獲得具有高氣孔密度的植物品質是一種行之有效的方法，該方法中最關鍵的技術瓶頸問題是與氣孔密度有關的相關基因的篩選與功能發現，但目前對禾本科植物氣孔發育途徑知之甚少，至今仍未獲得突破性進展。玉米(Zea mays)是單子葉模式植物，又是世界三大糧食作物之一，研究玉米氣孔蛋白基因的功能和作用機制，能夠完善單子葉植物氣孔圖式發育的研究，為培育高光效單子葉糧食作物的遺傳育種工作提供科學理論依據。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于針對上述技術問題，提供一種可增強植物光合作用的蛋白及其編碼基因，以及該蛋白及其編碼基因在培育高氣孔密度的轉基因植物中的應用。
[0006]為實現上述目的，本發明所采用的技術方案是:
[0007]一種可增強植物光合作用的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008]一種編碼SEQ ID NO:1所示蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0009]含有核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示的基因的植物表達載體、表達盒、轉基因細胞系或宿主菌；所述植物表達載體優選為雙元農桿菌表達載體，所述宿主菌優選為農桿菌。
[0010]優選地，所述雙元農桿菌表達載體為表達載體PGSA1252。
[0011]氨基酸序列如SEQ ID NO:1的蛋白、核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示的基因以及含有該基因的表達載體、表達盒、轉基因細胞系或宿主菌在增強植物光合作用中的應用。
[0012]一種培養高光合作用的轉基因植物的方法，是將核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的基因導入目的植物過表達，得到高光合作用的轉基因植物；所述方法是通過農桿菌介導法將基因轉化目的植物組織，并將轉化的組織培養成植株，所述目的植物優選為玉米；該方法包括下列步驟:
[0013]將核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的基因克隆進植物表達載體，得到重組表達載體；再將重組表達載體轉入農桿菌，制備含重組表達載體的農桿菌菌液，使用農桿菌菌液侵染目的植物組織，通過農桿菌介導法將基因轉化目的植物組織，再將轉化的組織培養成植株。
[0014]本發明的基因可以用于調節植物氣孔發育、增強植物光合作用，還可作為遺傳標記，用于農業生產中的產品鑒定。將該基因轉化目的植物后，轉基因植物出現氣孔增多、光合效率提高的生理特征，能夠更加高效的利用二氧化碳并且耐受高濃度的二氧化碳濃度，若廣泛應用，既可以增加作物的產量，又可以有效減少大氣中的二氧化碳濃度，緩解溫室效應帶來的影響。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1為轉基因玉米的分子鑒定；
[0016]圖2為轉基因玉米與非轉基因玉米葉片下表面氣孔分布；
[0017]圖3為轉基因玉米與非轉基因玉米ZmSTOMAGEN基因的表達量；
[0018]圖4為轉基因玉米與非轉基因玉米光響應曲線。
【具體實施方式】
[0019]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神和本質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。
[0020]下述實施例中使用的種子`、儀器、試劑、試劑盒、載體均可從市場上購買得到；
[0021]實施例
[0022]1.ZmSTOMAGEN 基因的克隆
[0023]1.1獲得玉米幼葉
[0024]玉米骨干親本昌7-2種子經過24小時吸脹萌發之后，置于50001x 土表光強，恒溫25°C, 16小時光照/8小時黑暗的條件下進行培養。當培養至幼苗剛長出第二片葉時，取該葉片液氮凍存。
[0025]1.2 提取總 RNA
[0026]采用本領域常用的酚/氯仿抽提法提取玉米RNA。
[0027]1.3目的基因的RT-PCR擴增
[0028]1.3.1逆轉錄反應
[0029]使用Takara 的 ReverseTranscriptaseM-MLV(TakaraCode = D2639A)試劑盒，參照說明書進行進行逆轉錄反應，合成cDNA第一鏈。
[0030]1.3.2擬南芥ST0MAGEN基因在玉米中的同源比對分析
[0031]從NCBI (www.ncb1.nlm.nih.rov)數據庫中搜索到擬南芥氣孔蛋白前體
[0032]ST0MAGEN的編碼序列(AK175876.1)和氨基酸序列(BAD43639.1)，然后通過該網站的BLASTn、BLASTp和BLASTx工具進行玉米B73的核酸和氨基酸序列的同源比對。分析比對的結果發現，得分最高的核苷酸序列為ΝΜ_001149748.1(Maxident:77%, Totalscore: 105),得分最高的氨基酸序列 % ΝΡ_001143220.1 (BLASTpMaxident:48%, Totalscore:98.2;BLASTxMaxident:55%, Totalscore:94.0)。 序列ΝΜ_001149748.1和序列ΝΡ_001143220.1實為同一基因的mRNA序列和氨基酸序列，這個基因的GeneID為100275730，具有一個全長為372bp的編碼區序列(Codingdomainsequence, CDS) (site68_439bp),編碼一個具有 123 個氛基酸的小分子多肽，多肽鏈上第24~123個氨基酸與NCBIProteinClusters數據庫中的PLN03207蛋白家族(www.ncb1.nlm.nih.gov/proteinclusters/?term=PLN03207)具有序歹丨J 相似性(BlastSCOre:392)。目前，對該基因功能的研究未見報道，NCBI數據庫中對該基因的注釋仍為假定蛋白基因。
[0033]1.3.3玉米ST0MAGEN同源基因的克隆
[0034]設計玉米B73中NM_001149748.1序列117~489bp片段的擴增引物，以玉米昌7-2幼葉的cDNA為模板，進行PCR擴展，上游引物序列如SEQIDN0:3所示，下游引物序列如 SEQIDN0:4 所示，PCR 反應程序為:95°C 5min ；95°C 30s, 56°C 30s, 72°C 28s, 25 個循環；72°C IOmin0獲得的擴增片段大小為417bp，將該擴增片段進行測序，所獲得的序列與NM_001149748.1序列進行比對，，發現這個在玉米昌7_2中新克隆的基因與之前同源比對發現的基因(NM_001149748.1)屬于同一個基因。因此，將該新克隆的玉米基因暫命名為ZmSTOMAGEN,將其編碼的蛋白命名為ZmSTOMAGEN。
[0035]2.ZmSTOMAGEN基因表達載體的構建和重組質粒的轉化
[0036]根據ZmSTOMAGEN的⑶S以及酶切信息，利用多克隆位點和/或⑶S不完全片段將目的基因克隆到雙元農桿菌表達載體PGSA1252上，構建玉米ZmSTOMAGEN過量表達載體PGSA1252-0E,并將過量 表達載體pGSA1252_0E的陽性質粒通過化學轉化法和三親接合法分別轉入大腸桿菌DH5 α和農桿菌LBA4404、ΕΗΑ105中。
[0037]3.獲得ZmSTOMAGEN基因過表達的轉基因玉米植株
[0038]3.1種子收集
[0039]收取授粉后10~15d的H1-1i玉米，在4°C冰箱中存放兩天。
[0040]3.2種子滅菌
[0041]在超菌工作臺內將小段的玉米棒放在瓶中，先用75%的酒精侵泡30s，倒掉酒精，用無菌水沖洗3次，倒掉無菌水；再用0.1%的升汞侵泡8min，倒掉升汞,用無菌水沖洗8次。
[0042]3.3剝離幼胚
[0043]先準備好幾個滅菌的1.5mL的EP管，管中加入ImL的無菌水，用手術刀小心地將種子底部的幼胚挑出，將幼胚放入之前準備好的EP管中存放。
[0044]3.4準備侵染液
[0045]準備攜帶氣孔基因ZmSTOMAGEN過表達載體的農桿菌(pGSA1252_0E)菌液，菌液的0D600=1.0，在50mL的YEA培養基中加入500uL菌液，28°C，180rpm/h,搖菌6h左右，待菌液的0D600=1.0時,將菌液倒入50mL的離心管中，4°C, 12000rpm/m,離心IOmin,棄上清,沉淀用PH1-A培養基重懸至0D600=1.0。所述PH1-A培養基的配方如表1所示:
[0046]表1培養基配方[0047]
【權利要求】
1.一種可增強植物光合作用的蛋白，其特征在于:所述蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。
2.一種編碼權利要求1所述蛋白的基因，其特征在于:所述基因的核苷酸序列如SEQID NO:2 所示。
3.含有權利要求2所述的基因的植物表達載體、表達盒、轉基因細胞系或宿主菌。
4.按照權利要求3所述的植物表達載體，其特征在于，所述植物表達載體為雙元農桿菌表達載體。
5.按照權利要求3所述的宿主菌，其特征在于，所述宿主菌為農桿菌。
6.權利要求1所述的蛋白或權利要求2所述的基因在增強植物光合作用中的應用。
7.權利要求3所述的的植物表達載體、表達盒、轉基因細胞系或宿主菌在增強植物光合作用中的應用。
8.一種培養高光合作用的轉基因植物的方法，其特征在于:將權利要求2所述的基因導入目的植物過表達，得到高光合作用的轉基因植物。
9.按照權利要求8所述的方法，其特征在于:所述方法是通過農桿菌介導法將權利要求2所述的基因導入目的植物組織實現基因的過表達，并將轉化的組織培養成植株；所述目的植物為玉米。
10.按照權利要求9所述的方法，其特征在于:所述方法包括下列步驟: 將權利要求2所述的基因克隆進植物表達載體，得到重組表達載體；再將重組表達載體轉入農桿菌，制備含重組表達載體的農桿菌菌液，使用農桿菌菌液侵染目的植物組織，通過農桿菌介導法將基因轉化目的植`物組織，再將轉化的組織培養成植株。
【文檔編號】C07K14/415GK103833837SQ201410074835
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年4月7日 優先權日:2014年4月7日
【發明者】樊憲偉, 廖權能, 韋葳, 李有志 申請人:廣西大學