一種從東方伊薩酵母生物轉(zhuǎn)化液中分離純化胞二磷膽堿的方法

一種從東方伊薩酵母生物轉(zhuǎn)化液中分離純化胞二磷膽堿的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種從東方伊薩酵母生物轉(zhuǎn)化液中分離純化胞二磷膽堿的方法。該方法將東方伊薩酵母CDP-c生物轉(zhuǎn)化液通過一種陰離子交換樹脂柱，先用去離子水淋洗掉未吸附物質(zhì)，再采用0.01～0.50M鹽溶液洗脫CDP-c、0.10～1.00M鹽溶液洗脫胞苷酸，一次性即可獲得高純度（＞99%）、高收率（＞88%）的CDP-c，并可回收未完全反應的胞苷酸。本發(fā)明大大簡化了分離過程，操作簡便，成本低，環(huán)保節(jié)約，適應于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
【專利說明】一種從東方伊薩酵母生物轉(zhuǎn)化液中分離純化胞二磷膽堿的方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及胞二磷膽堿的分離純化方法，尤其涉及從東方伊薩酵母生物轉(zhuǎn)化液中分離純化胞二磷膽堿的方法，屬于生物分離【技術(shù)領域】。
【背景技術(shù)】
[0002]胞二磷膽堿又名胞苷-5’-二磷酸膽堿(Cytidine-5’ -diphosphate choline,CDP-c, CDP-膽堿)，是磷脂代謝的重要前體及磷脂酰膽堿合成的中間體，為卵磷脂生物合成必需的輔酶，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害模型和腦病有顯著療效(Sugino, Biochimica etBiophysica Acta, 1960.40:425-434)。研究證明CDP-膽堿能促進生物代謝，尤其是磷脂的生物合成反應(Roe J.H., Journal of Biological Chemistry, 1954.210(2):703-707.)0
20世紀 50 年代 kennedy (Kennedy E.P., Journal of the American ChemicalSociety, 1955.77 (I): 250-251.)博士等人發(fā)現(xiàn)并確定其分子結(jié)構(gòu)，稍后Rossiter(Rossiter, R.., 1.McLeod, and K.Strickland, Canadian Journal of Biochemistry andPhysiology, 1957.35(11):945-951.)等闡明其功能。60年代，日本武田公司研發(fā)并用于治療腦外傷、腦手術(shù)等伴隨的意識障礙，臨床上獲得成功，其商品名為Nicholin，中譯名尼柯靈(李良鑄，李明曄，最新生化藥物制備技術(shù).2001:中國醫(yī)藥科技出版社.)。由此，關于胞二磷膽堿的研究在世界范圍內(nèi)展開。我國自上世紀70年代，開發(fā)了利用酵母細胞生產(chǎn)胞二磷膽堿的工藝技術(shù)(王永智，尉亞輝，聶利芳，西北藥學雜志，2009.24 (3):235-236.)；華東理工大學牛紅星等人，將k-卡拉膠-魔芋-多糖復配膠包埋的啤酒酵母細胞，經(jīng)凍融處理后用于合成胞嘧啶核苷二磷酸膽堿(牛紅星，邱蔚然，丁慶豹，華東理工大學學報，2002.)。
[0003]生物合成法制備胞二磷膽堿的反應液中，含有蛋白質(zhì)、色素、未完全反應的磷酸膽堿鈣、胞苷酸、磷酸鹽、硫酸鎂以及`葡萄糖代謝副產(chǎn)物和胞苷等物質(zhì)，這些雜質(zhì)給胞二磷膽堿的分離純化帶來很多困難。從上述反應液中提取胞二磷膽堿需要經(jīng)過菌體和蛋白的去除，769活性炭吸附，離子交換樹脂吸附，分步洗脫，碳粉脫色等步驟(黃穎，中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1985.1:001.)，過程復雜，得率只有45%，損耗嚴重，反應剩余的胞苷酸沒有得以回收利用，不適應于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本 申請人:經(jīng)過研究改進，提供一種從東方伊薩酵母生物轉(zhuǎn)化液中分離純化胞二磷膽堿的方法。本發(fā)明僅利用一種陰離子交換樹脂柱實現(xiàn)了一次性從東方伊薩酵母生物轉(zhuǎn)化液中分離高純度、高收率的CDP-c及回收未完全反應胞苷酸，操作簡便，過程簡單，成本低，適應于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0006]一種從東方伊薩酵母生物轉(zhuǎn)化液中分離純化胞二磷膽堿的方法，包括如下步驟:[0007](I)將⑶P-c含量為0.1~10g/L (優(yōu)選為2~5g/L)的東方伊薩酵母生物轉(zhuǎn)化液通過強堿或弱堿性陰離子交換樹脂柱；
[0008](2)上柱完畢，用去離子水淋洗所述陰離子交換樹脂柱，沖洗掉未吸附物質(zhì)；
[0009](3)用0.01~0.50M的鹽溶液洗柱，直至柱出口處流出液不再含有⑶P_c，收集洗脫液，得到高純度⑶P-C溶液；
[0010](4)用0.10~1.0OM的鹽溶液洗柱，直至柱出口處流出液不再含有胞苷酸，收集洗脫液，蒸發(fā)濃縮，透析袋去鹽，凍干，回收得到胞苷酸。
[0011 ] 具體地，步驟(1)所述強堿或弱堿性陰離子交換樹脂柱選自大孔苯乙烯系強堿性陰離子交換樹脂柱或大孔苯乙烯系弱堿性陰離子交換樹脂柱，包括717、D301、D318，顆粒度0.3~1.2mm≥95%，上柱總量為柱交換總量的5~40% (質(zhì)量比)，優(yōu)選為10~15% (質(zhì)量比)，柱高徑比為10:1~50:1，優(yōu)選為10:1~20:1。
[0012]具體地，步驟(1)所述強堿或弱堿性陰離子交換樹脂柱上柱流速為0.2~2mL/min,優(yōu)選為 0.5 ~L 5mT,/miη。
[0013]優(yōu)選地，步驟(3)所述鹽溶液濃度為0.02~0.20Μ。
[0014]優(yōu)選地，步驟(4)所述鹽溶液濃度為0.20~0.50Μ。
[0015]具體地，步驟(3)和(4)所述洗脫用鹽溶液選自NaCl、NH4HCO3^ NaHC03、NH4Cl,Na2C03、KCl、KHCO3> K2CO3,優(yōu)選為 NaCl、NaHCO3 或 Na2C03。
[0016]本發(fā)明還包括將步驟(3)所得⑶P-C溶液濃縮后，通過截留分子量100的透析袋去鹽，凍干，得到純度98%以上胞二磷膽堿固體的步驟。
[0017]本發(fā)明還包括在⑶P-C分離純化結(jié)束后，將所述陰離子交換樹脂柱用鹽、酸和堿分別沖洗以循環(huán)使用的步驟。
[0018]本發(fā)明的有益技術(shù)效果在于:
[0019]本發(fā)明以東方伊薩酵母生物胞二磷膽堿轉(zhuǎn)化液為提純原料，僅采用一種強堿或弱堿性陰離子交換樹脂層析法將其中的大部分物質(zhì)吸附在柱子上，利用各物質(zhì)同樹脂結(jié)合能力的不同，精心摸索優(yōu)化洗脫濃度和條件，最終實現(xiàn)較低濃度(0.01~0.50M，優(yōu)選為
0.02~0.20M)鹽溶液洗脫胞二磷膽堿，較高濃度(0.10~1.00M，優(yōu)選為0.20~0.50M)鹽溶液洗脫苷酸，達到一次性分離純化胞二磷膽堿和回收反應剩余胞苷酸的目的。本發(fā)明生物轉(zhuǎn)化液只需過一次柱即可得到高純度(> 99%)、高收率(> 88%)的胞二磷膽堿，并可回收大部分未完全反應的胞苷酸，其他雜質(zhì)均被去除，與現(xiàn)有技術(shù)相比，操作簡便、過程簡單，環(huán)保節(jié)約，成本低、產(chǎn)品收率高，分離效果好，克服了現(xiàn)有CDP-c分離工藝需經(jīng)過兩種以上的分離柱組合來實現(xiàn)、⑶P-c和胞苷酸回收率低、分離過程繁瑣的缺陷，適應于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為本發(fā)明⑶P-C分離純化工藝流程示意圖。
【具體實施方式】
[0021]以下結(jié)合過實施例對本發(fā)明的【具體實施方式】進行具體說明。
[0022]以下實施例1~實施例3中東方伊薩酵母胞二磷膽堿生物轉(zhuǎn)化液制備方法如下:[0023]以葡萄糖為能量供體，一方面提供菌體的能量需求，另一方面為胞二磷膽堿合成酶系提供ATP;通過添加鉀離子、鎂離子和錳離子中的一種或組合改變代謝流向，提高ATP的再生效率，從而與胞二磷膽堿酶系速率相匹配，實現(xiàn)高效制備胞二磷膽堿。(具體制備方法參見如下專利文件:張梁，石貴陽，尤翠萍，等.一株東方伊薩酵母及其全細胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)胞二磷膽堿的方法:中國，CN102286386A[P].2011-12-21.)，其中東方伊薩酵母(1.0rientalis)Zl購自中國典藏培養(yǎng)物保藏中心，菌種編號為=CCTCC NO:2011272。
[0024]以實施例所涉及分析檢測方法如下:蛋白質(zhì)采用考馬斯亮藍顯色法測定，鈣鎂離子采用鉻黑T指示劑測定，⑶P-c和胞苷酸采用HPLC法測定。
[0025]實施例1
[0026]3OOmL東方伊薩酵母胞二磷膽堿生物轉(zhuǎn)化液,含Q)P-cl350mg,胞苷酸650mg,磷酸鹽3750mg,磷酸膽堿|丐500mg,硫酸鹽900mg。
[0027](I)將上述胞二磷膽堿生物轉(zhuǎn)化液通過717HC03_型陰離子交換樹脂柱，柱尺寸20 X 300mm，柱體積60mL，上柱流速0.5mL/min，上柱總量為柱交換總量的13.5% (質(zhì)量比)。
[0028](2)上柱完畢，用300mL去離子水淋洗交換柱以沖洗掉未吸附物質(zhì)，直至流出液全為水。
[0029](3)用0.03M氯化鈉溶液洗柱，直至柱出口處流出液不再含有⑶P_c，收集洗脫液200mL，得到高純度⑶P-c溶液。
[0030](4)用0.3M氯化鈉溶液洗柱，直至柱出口處流出液不再含有胞苷酸，收集洗脫液150mLo
[0031](5)將步驟(3)收集的200mL CDP_c洗脫液濃縮至30mL，通過截留分子量100的透析袋去鹽，凍干，可得胞二磷膽堿固體1153mg，收率為85.4%，經(jīng)檢測胞二磷膽堿純度99%，未檢測出磷酸鹽及鎂離子， 蛋白質(zhì)檢測為陰性；將步驟(3)收集的150mL胞苷酸洗脫液做同樣處理，得胞苷酸581mg，收率為89.4%。
[0032]實施例2
[0033]1000mL東方伊薩酵母胞二磷膽堿生物轉(zhuǎn)化液，含胞二磷膽堿4500mg，胞苷酸2039mg，磷酸鹽11380mg，磷酸膽堿鈣1520mg，硫酸鹽2750mg。
[0034](I)將上述胞二磷膽堿生物轉(zhuǎn)化液通過717HC03_型陰離子交換樹脂柱，柱尺寸30 X 500mm，柱體積200mL，上柱流速1.0mL/min。上柱總量為柱交換總量的12.8%(質(zhì)量比)。
[0035](2)上柱完畢，用1000mL去離子水淋洗交換柱以沖洗掉未吸附物質(zhì)，直至流出液全為水。
[0036](3)用0.04M氯化鈉溶液洗柱，直至柱出口處流出液不再含有⑶P_c，收集洗脫液800mL，得到高純度⑶P-c溶液。
[0037](4)用0.2M氯化鈉溶液洗柱，直至柱出口處流出液不再含有胞苷酸，收集洗脫液650mLo
[0038](5)將步驟(3)收集的8001!^ CDP_c洗脫液濃縮至IOOmL,通過截留分子量100的透析袋去鹽，凍干，可得胞二磷膽堿固體4025mg，收率為89.4%，經(jīng)檢測胞二磷膽堿純度99%，未檢測出磷酸鹽及鎂離子，蛋白質(zhì)檢測為陰性；將步驟(3)收集的650mL胞苷酸洗脫液做同樣處理，得胞苷酸1837mg，收率為90.1%。
[0039]實施例3[0040]300mL胞二磷膽堿生物轉(zhuǎn)化液，含胞二磷膽堿1350mg，胞苷酸650mg，磷酸鹽3750mg,磷酸膽堿|丐500mg,硫酸鹽900mg。
[0041](1)將上述胞二磷膽堿生物轉(zhuǎn)化液通過D301HC03_型陰離子交換樹脂柱，柱尺寸20X300mm，柱體積60mL，上柱流速0.5mL/min。上柱總量為柱交換總量的11.3%(質(zhì)量比)。
[0042](2)上柱完畢，用300mL去離子水淋洗交換柱以沖洗掉未吸附物質(zhì)，直至流出液全為水。
[0043](3)用0.03M氯化鈉溶液洗柱，直至柱出口處流出液不再含有⑶P_c，收集洗脫液200mL，得到高純度⑶P-c溶液。
[0044](4)用0.3M氯化鈉溶液洗柱，直至柱出口處流出液不再含有胞苷酸，收集洗脫液150mLo
[0045](5)將步驟(3)收集的200mL CDP_c洗脫液濃縮至30mL，通過截留分子量100的透析袋去鹽，凍干，可得胞二磷膽堿固體1051mg，收率為77.9%，經(jīng)檢測胞二磷膽堿純度98%，未檢測出磷酸鹽及鎂離子，蛋白質(zhì)檢測為陰性；將步驟(3)收集的150mL胞苷酸洗脫液做同樣處理，得胞苷酸573mg，收率為88.2%。
[0046]上述試驗結(jié)果證明:利用本發(fā)明方法一次性即可獲得即可獲得高純度(> 99%)、高收率(> 88%)的⑶P-c，并可回收未完全反應的胞苷酸。
[0047]以上所述的僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明不限于以上實施例。可以理解，本領域技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的精神和構(gòu)思的前提下直接導出或聯(lián)想到的其他改進和變化，均應認為包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種從東方伊薩酵母生物轉(zhuǎn)化液中分離純化胞二磷膽堿的方法，其特征在于包括如下步驟: (1)將⑶P-C含量為0.1~10g/L的東方伊薩酵母生物轉(zhuǎn)化液通過強堿或弱堿性陰離子交換樹脂柱； (2)上柱完畢，用去離子水淋洗所述陰離子交換樹脂柱，沖洗掉未吸附物質(zhì)； (3)用0.01~0.50M的鹽溶液洗柱，直至柱出口處流出液不再含有⑶P-c，收集洗脫液，得到高純度⑶P-c溶液； (4)用0.10~1.0OM的鹽溶液洗柱，直至柱出口處流出液不再含有胞苷酸，收集洗脫液，蒸發(fā)濃縮，透析袋去鹽，凍干，回收得到胞苷酸。
2.如權(quán)利要求1所述分離純化胞二磷膽堿的方法，其特征在于:步驟(1)所述強堿或弱堿性陰離子交換樹脂柱選自大孔苯乙烯系強堿性陰離子交換樹脂柱或大孔苯乙烯系弱堿性陰離子交換樹脂柱，上柱總量為柱總交換量的5~40% (質(zhì)量比)，柱高徑比為10:1~50:1。
3.如權(quán)利要求2所述分離純化胞二磷膽堿的方法，其特征在于:所述大孔苯乙烯系強堿性陰離子交換樹脂柱或大孔苯乙烯系弱堿性陰離子交換樹脂柱包括717、D301、D318，顆粒度0.3~1.2mm≥95%。
4.如權(quán)利要求2所述分離純化胞二磷膽堿的方法，其特征在于:所述大孔苯乙烯系強堿性陰離子交換樹脂柱或大孔苯乙烯系弱堿性陰離子交換樹脂柱上柱總量為柱總交換量的10~15% (質(zhì)量比)，柱高徑比為10:1~20:1。
5.如權(quán)利要求1所述分離純化胞二磷膽堿的方法，其特征在于:步驟(1)所述強堿或弱堿性陰離子交換樹脂柱上柱流速為0.2~2mL/min。
6.如權(quán)利要求1所述分離純化胞二磷膽堿的方法，其特征在于:步驟(3)所述鹽溶液濃度為 0.02 ~0.20M。
7.如權(quán)利要求1所述分離純化胞二磷膽堿的方法，其特征在于:步驟(4)所述鹽溶液濃度為 0.20 ~0.50M。
8.如權(quán)利要求1所述分離純化胞二磷膽堿的方法，其特征在于:步驟(3)和(4)所述洗脫用鹽溶液選自 NaCl、NH4HC03、NaHCO3> NH4Cl,Na2C03> KC1、KHC03、K2C03。
9.如權(quán)利要求1所述分離純化胞二磷膽堿的方法，其特征在于還包括將步驟(3)所得CDP-c溶液濃縮后，通過截留分子量100的透析袋去鹽，凍干，得到純度98%以上胞二磷膽堿固體的步驟。
10.如權(quán)利要求1所述分離純化胞二磷膽堿的方法，其特征在于還包括在CDP-C分離純化結(jié)束后，將所述陰離子交換樹脂柱用鹽、酸和堿分別沖洗以循環(huán)使用的步驟。
【文檔編號】C07H1/06GK103819522SQ201410068841
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年2月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月27日
【發(fā)明者】張梁, 石貴陽, 宋麗芳, 尤翠萍, 李贏, 顧正華, 丁重陽 申請人:江南大學