肺炎衣原體熱休克蛋白60的可溶性蛋白的制備方法及使用方法

肺炎衣原體熱休克蛋白60的可溶性蛋白的制備方法及使用方法
【專利摘要】本發明公開了肺炎衣原體熱休克蛋白60的可溶性蛋白的制備方法及使用方法。本發明從肺炎衣原體CpnAR39株基因中獲取cHSP60的序列，設計引物序列；用RT-PCR法擴增cHSP60的cDNA，并將cHSP60與原核表達載體pET28a連接，構建pET28a-cHSP60重組質粒；經過克隆、酶切鑒定及核苷酸測序證實，獲得重組的表達載體pET28a-cHSP60，經過IPTG的誘導在E.coliBL21菌株中產生cHSP60-His融合蛋白，獲得的cHSP60-His融合蛋白進行體內外實驗。得到的cHSP60融合蛋白有生物活性，可進行與衣原體相關感染的研究，不局限于以病人進行研究。
【專利說明】肺炎衣原體熱休克蛋白60的可溶性蛋白的制備方法及使用方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫學領域，具體涉及肺炎衣原體熱休克蛋白60即CHSP60融合蛋白的制備方法及使用方法。
【背景技術】
[0002]肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae, Cpn)是一種常見的引起呼吸道疾病的病原體。首次分離于一名患急性眼結膜炎的臺灣兒童的眼結膜，暫命名為TW-183 ;1983年，研究人員在美國西雅圖一位急性呼吸道感染病人的咽部分離出另一株衣原體，將其命名為AR3。1989年,該病原體被認定為衣原體屬的一個新種，即肺炎衣原體。Cpn主要引起包括肺炎，支氣管炎，咽炎，鼻竇炎，中耳炎等在內的急性呼吸道感染，其中肺炎占50%以上，急性支氣管炎占25%。此外，越來越多的證據表明，Cpn感染還可能造成哮喘、慢性阻塞性肺病、冠心病、心肌梗死、動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)等疾病的發生。但是目前人們對其中的機制尚未完全了解。盡管如此，來自實驗室和臨床的證據表明，Cpn引起的呼吸道及其他心血管疾病與宿主免疫應答關系密切，即機體產生的抗感染免疫在清除病原體的同時，有可能誘導免疫病理反應，其中過度的炎癥應答是導致局部組織損傷和病變的最重要因素。
[0003]衣原體熱休克蛋白60 (Chlamydia Heat Shock Protein60, cHSP60)為肺炎衣原體的主要抗原成分，具有較強的免疫刺激能力。CHSP60蛋白在由肺炎衣原體所引起的免疫和炎癥反應中起著重要的媒介作用。已有研究表明，病原微生物來源的CHSP60蛋白與機體自身CHSP60蛋白分子之間存在高度同源性，由此形成與宿主之間的免疫交叉反應，引起超敏反應和炎癥的發生。臨床資料顯示，CHSP60蛋白大量表達于動脈粥樣硬化斑塊和相應實驗動物的病變組織中。相關研究表明，CHSP60蛋白反復、持續感染血管內皮細胞，可引起內皮細胞和巨噬細胞分泌一系列生長因子、細胞因子和粘附因子，導致炎癥性細胞的聚集、浸潤和粘附，進而造成對血管內皮細胞的損傷作用，這可能是引起衣原體相關AS發生的一個重要機制。在慢性感染中，CHSP60蛋白可以活化血管內皮細胞，平滑肌細胞以及巨噬細胞，其所產生的炎癥反應和免疫病理應答與心血管疾病密切相關。有研究證實衣原體感染機體后，血清抗CHSP60蛋白效價和冠心病發生呈正相關關系。在某些肺炎衣原體感染過程中，血清中出現的抗CHSP60蛋白抗體(IgG)會誘導免疫系統產生自身抗IgG抗體，從而誘發自身免疫應答。此外，CHSP60蛋白反復、持續感染血管內皮細胞，導致內皮細胞分泌一系列生長因子，炎癥因子以及粘附因子，由此產生了單核巨噬細胞對內皮細胞的聚集，粘附以及向內皮下的遷移，而炎癥因子的持續存在并且損傷組織是發生慢性炎癥性疾病的根本原因。一些炎癥性疾病包括AS，冠心病，心肌炎等都與Cpn的反復感染和CHSP60蛋白的持續存在相關。最近有研究顯示CHSP60蛋白可引起肺部炎癥的發生，其主要原因是激活了骨髓來源的樹突狀細胞(bone marrow-derived dendritic cells, BMDCs),引起 DCs 的活化、分化和免疫應答。另外有研究顯示cHSP60蛋白能活化抗原提呈細胞(antigen presentingcell，APC)，誘導細胞因子的釋放；也有研究顯示該蛋白可起到免疫佐劑和細胞因子的作用。這些證據都顯示CHSP60蛋白與Cpn感染引起的免疫和炎癥應答存在密切關系。
[0004]迄今為止，大部分關于Cpn的研究都是基于病人的樣本的研究，而且大部分研究是探究CHSP60蛋白與心血管疾病之間的關系，并沒有將CHSP60蛋白與肺炎關聯研究。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種肺炎衣原體熱休克蛋白60的可溶性蛋白的制備方法及使用方法。
[0006]本發明解決其技術問題所采用的技術方案如下:
[0007]一種肺炎衣原體熱休克蛋白60的可溶性蛋白的制備方法，肺炎衣原體熱休克蛋白60即CHSP60，該方法構建CHSP60的原核表達系統pET28a_cHSP60，制備cHSP60_組氨酸標簽即cHSP60-His融合蛋白，SEQ ID NO:1，顯示本發明cHSP60_His融合蛋白的核苷酸序列；所述肺炎衣原體熱休克蛋白60的可溶性蛋白的制備方法包括以下步驟:
[0008]步驟(1)
[0009]從肺炎衣原體Cpn AR39株基因中獲取cHSP60的序列，設計引物序列；
[0010]引物序列:上游引物，5’-CCGCATATGGTCGCTAAAAACAT-3’;下游引物，5’ -CCAGCTCGAGTTAATAGTCCATTCCTGCGC-3，
[0011]步驟(2)
[0012]用RT-PCR法擴增CHSP60的cDNA，并將cHSP60與原核表達載體pET28a連接，構建pET28a-cHSP60 重組質粒。
[0013]RT-PCR法擴增體系為:模板cDNA為2.5 μ I，5’引物與3’引物各加0.4 μ I，2xTaqPlus PCR MasterMix為10 μ 1，最后加雙蒸水補足至Ij 20 μ I。
[0014]反應條件為:95°C預變性5分鐘；95°C變性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸90秒，進行30個循環；72°C延伸5分鐘。
[0015]步驟(3)
[0016]經過克隆、酶切鑒定及核苷酸測序證實，獲得重組的表達載體pET28a-cHSP60，經過異丙基硫代半乳糖苷即IPTG的誘導在E.coli BL21菌株中產生cHSP60_His融合蛋白。
[0017]一種肺炎衣原體熱休克蛋白60 (CHSP60)的可溶性蛋白的使用方法:按照誘導劑IPTG的濃度為1.0mM，誘導溫度30°C，誘導時間6小時進行大規模誘導表達cHSP60-His融合蛋白，鑒定cHSP60-His融合蛋白純度，將純化的cHSP60-His融合蛋白加入培養的小鼠巨噬細胞中。經觀察發現，CHSP60能夠誘導小鼠巨噬細胞產生炎癥因子IL-6和TNF-α，其表達具有濃度依賴性以及時間依賴性；同時，此發明顯示CHSP60能夠激活核因子K B亞基即NF-kB的活化和促分裂素原活化蛋白激酶即MAPK通路；將野生型Β6小鼠用3%戊巴比妥鈉麻醉后，于氣管內給予多粘菌素B(polymyCin B, PMB)處理過的cHSP60-His融合蛋白，小鼠保持直立位，以 確保液體全部被吸入肺部，6小時后處理小鼠肺部細胞，證實CHSP60能夠有效激發小鼠肺部炎癥反應。
[0018]本發明的有益效果:本發明得到的CHSP60融合蛋白具有生物活性，可以用來進行與衣原體相關感染的研究，而不局限于以病人進行研究，此外，本發明還可研究CHSP60蛋白與肺炎之間的關系。【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為不同濃度CHSP60對小鼠巨噬細胞產生白介素-6(IL_6)和腫瘤壞死因子α (TNF-α )mRNA水平的影響；
[0020]圖2為CHSP60作用不同時間對小鼠巨噬細胞IL-6和TNF-a mRNA表達水平的影響；
[0021]圖3為CHSP60作用不同時間對小鼠巨噬細胞IL-6和TNF-α的蛋白表達水平的影響；
[0022]圖4為小鼠肺組織的蘇木精一伊紅染色法；
[0023]圖5為小鼠氣管肺泡灌洗液中的細胞數；
[0024]圖6為小鼠氣管肺泡灌洗液中炎癥因子水平。
【具體實施方式】
[0025]下面對本發明作進一步的分析。
[0026]本發明中所用的緩沖液為本領域常規用于基因克隆表達的常規試劑，TaqDNAPolymerase, dNTP Mixture, T4DNA 連接酶,NdeI,XhoI 限制性內切酶，DNA Marker 以及Trizol,PrimerScript II 1st Stand cDNA Synthesis Kit, SYBR Premix Ex Taq?等均購自Takara公司。2xTaq Plus PCR MasterMix購自天根生化科技有限公司；磷酸緩沖液干粉即PBS干粉，IPTG，瓊脂糖均購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。所有實驗結果均是由獨立的三次重復實驗得到，采用不配對的t檢驗分析數據，均用士 sEM表示。P值≤0.05為顯著性差異標準。
[0027]實施例1:CHSP60融合蛋白基因的克隆與表達載體的構建
[0028]1.細胞總RNA的提取與濃度測定
[0029]將人喉癌細胞系H印-2細胞以2xl05/孔的密度鋪于12孔板內，加入Iml含有10%體積的胎牛血清(FBS)的新鮮培養液，將細胞置于細胞培養箱內繼續培養24小時；吸棄原有培養基，用PBS洗2遍，加入500 μ I含有10%FBS以及I μ g/ml的放線菌酮的新鮮培養液，用500 μ I的上述Cpn上清感染！fep-2細胞，置于細胞培養箱內繼續培養72小時；吸棄原有培養基，PBS洗2遍，加入500 μ I RNA提取試劑Trizol試劑，反復吹打細胞，以保證細胞完全裂解，將其轉移至已高壓滅菌的1.5ml離心管中；按Trizol:氯仿為5:1的比例加入氯仿，劇烈震蕩15秒，室溫靜置2-3分鐘，4°C，12000rpm,離心15分鐘，離心后，混合液體分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層，RNA被分配于無色的水相上層；將無色水相上層轉移至一干凈無RNA酶的離心管中，加入等體積的異丙醇混合，以沉淀其中的RNA，室溫孵育10分鐘,4°C, 12000rpm,離心10分鐘；吸棄掉上清，每Iml Trizol的樣品加入至少Iml用去RNA酶水配制的75%的乙醇，清洗RNA，混勻后，4°C，12000rpm，離心5分鐘；吸去大部分乙醇溶液，將無RNA酶的離心管倒置于超凈臺內，徹底的棄掉乙醇溶液，正置離心管使RNA沉淀在室溫干燥5-10分鐘使乙醇完全揮發掉；加入無RNA酶的水10 μ 1，放置于40C，溶解30分鐘，使其完全溶解；測定RNA的濃度，并做好記錄，_80°C保存所抽提的RNA。
[0030]2.cHSP60基因全長序列通過互聯網從GenBank獲得,該序列的GenBank序列號為G1:7189880。根據cHSP60蛋白已知序列，對照原核表達載體pET28a_c (+)上的多克隆酶切位點，設計CHSP60基因的特異性擴增引物，上游引物在5’端加入限制性酶切位點Ndel，下游引物在5’端加入限制性酶切位點Xhol，并加上保護性堿基。引物如下，下劃線為酶切位點:上游引物5’ -CCGCATATGGTCGCTAAAAACAT-3’ (下劃線為NdeI酶切位點);下游引物5’ -CCAGCTCGAGTTAATAGTCCATTCCTGCGC-3> (下劃線為XhoI酶切位點)，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。
[0031 ] 3.CHSP60 基因的 PCR 擴增
[0032]按照Takara 公司的逆轉錄試劑盒 PrimerScript II 1st Strand cDNA SynthesisKit說明書，進行反轉錄，得到cDNA，進行PCR擴增目的基因。PCR反應體系及反應過程如表1所示:
[0033]表1.PCR反應體系及反應過程
【權利要求】
1.一種肺炎衣原體熱休克蛋白60的可溶性蛋白的制備方法，肺炎衣原體熱休克蛋白60即CHSP60，該方法構建CHSP60的原核表達系統pET28a_cHSP60，制備cHSP60_組氨酸融合蛋白，SEQ ID NO:1，顯示CHSP60-組氨酸融合蛋白的核苷酸序列；其特征在于:所述肺炎衣原體熱休克蛋白60的可溶性蛋白的制備方法包括以下步驟: 步驟(1) 從肺炎衣原體Cpn AR39株基因中獲取cHSP60的序列，設計引物序列； 引物序列:上游引物，5 ’ -CCGCATATGGTCGCTAAAAACAT-3 ’;下游引物，5 ’ -CCAGCTCGAGTTAATAGTCCATTCCTGCGC-3’ ； 步驟(2) 用RT-PCR法擴增CHSP60的cDNA，并將cHSP60與原核表達載體pET28a_c (+)連接，構建pET28a-cHSP60重組質粒； RT-PCR法擴增體系為:模板cDNA為2.5μ 1，5’引物與3’引物各加0.4μ l，2xTaq PlusPCR MasterMix為10 μ 1，最后加雙蒸水補足至Ij 20 μ I ； 反應條件為:95°C預變性5分鐘；95°C變性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸90秒，進行30個循環；72°C延伸5分鐘； 步驟(3) 經過克隆、酶切鑒定及核苷酸測序證實，獲得重組的表達載體pET28a-cHSP60，經過IPTG的誘導在E.coli BL21菌株中產生cHSP60_His融合蛋白。
2.一種肺炎衣原體熱休克蛋白60的可溶性蛋白的使用方法:其特征在于:按照誘導劑IPTG的濃度為1.0mM,誘導溫度30°C，誘導時間6小時進行大規模誘導表達cHSP60_組氨酸標簽融合蛋白鑒定CHSP60-組氨酸融合蛋白純度，將純化的CHSP60-組氨酸融合蛋白純度加入觀察細胞中，CHSP60誘導觀察細胞產生炎癥因子IL-6和TNF- α，其表達具有濃度依賴性以及時間依賴性，除此之外，CHSP60能夠激活核因子K B亞基的活化和促分裂素原活化蛋白激酶通路；將野生型Β6小鼠用3%戊巴比妥鈉麻醉后，于氣管內給予多粘菌素B處理過的CHSP60-組氨酸融合蛋白；小鼠保持直立位，以確保液體全部被吸入肺部，6小時后處理小鼠肺部細胞，證實CHSP60能有效激發小鼠肺部炎癥反應。
【文檔編號】C07K19/00GK103789336SQ201410056510
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年2月19日 優先權日:2014年2月19日
【發明者】史麗云, 康艷華, 盧哲 申請人:杭州師范大學