蠶蟲草(活性物質)蟲草素的提取工藝的制作方法
【專利摘要】本發明公開了蠶蟲草中活性物質蟲草素的提取工藝。蟲草素系從冬蟲夏草中提取出來的一種天然核甙類新藥，具有抑制腫瘤、抗瘧原蟲、抗真菌、抗HⅣ-I型病毒和選擇性抑制梭菌的活性，引起醫藥學界的高度重視。但其雖能夠人工合成，也能從冬蟲夏草中提取，但產量很低，價格昂貴，目前其提取、純化方法不僅操作麻煩，而且有毒有機溶劑會帶來污染，不易進行大批量生產。本發明是采用雙水相萃取法提取蠶蟲草蟲草素，不僅提取物含量高，提取率高，且省時，省力，適合工業化大規模提取。
【專利說明】蠶蟲草(活性物質)蟲草素的提取工藝
【技術領域】
[0001]本發明涉及中藥領域，涉及一種中藥活性物質的提取工藝。
【背景技術】
[0002]北冬蟲夏草(Cordyc epsmilitaris)亦稱北蟲草或蛹蟲草,是一種國內外公認的既可食用又可藥用的真菌，是寄生于夜蛾科等蛹體上的不同于冬蟲夏草的另一種蟲草。目前北蟲草一般采用蠶蛹作寄主或大米等作培養基進行培養。國家衛生部已于2009年3月批準蛹蟲草為新資源食品。蠶蟲草也稱桑蠶蟲草或家蠶蟲草，是用野生天然蛹蟲草(Cordyceps militaris)菌株孢子接種到5齡桑蠶上人工培育而成的蟲菌結合體。
[0003]研究已證實，蠶蟲草與蠶蛹草相比，蟲草酸相近，蟲草多糖是蠶蛹草的2.5倍，蟲草素則為其4倍，只有腺苷是其I / 2;蠶蟲草與冬蟲夏草相比，蟲草素是冬蟲夏草的數百倍，腺苷也為其4倍，而蟲草多糖和腺苷則是它的I / 2左右。以上比較結果說明，蠶蟲草的活性成分含量優于蠶蛹草，同時也優于冬蟲夏草，尤其是蟲草素的含量遠高于蠶蛹草和冬蟲夏草。可見蠶蟲草是蟲草素提取的最佳原料。
[0004]蟲草素學名為3'-脫氧腺苷,外文名稱為3' -deoxyadenosine,系從冬蟲夏草中提取出來的一種天然核甙類新藥，20世紀70年代被發現有抑制腫瘤、抗瘧原蟲和抑制mRNA翻譯的作用；20世紀90年代研究發現，添加腺苷脫氨酶抑制劑對其抗腫瘤活性的表達起著重要作用。蟲草素能干擾基因細胞RNA和DNA的合成，抑制癌細胞等不正常細胞的分裂，并能作為區別細胞中不同的RNA聚合酶的工具；同時，蟲草素還表現出極強的抗真菌、抗HIV-1型病毒和選擇性抑制梭菌的活性，引起醫藥學界的高度重視，蟲草素在美國作為抗癌、抗病毒新藥已經進入三期臨床。
[0005]國內外僅報道蟲草素能夠人工合成，也能從冬蟲夏草中提取，但產量很低，價格昂貴。當前的蟲草素提取、純 化方法主要有:溶劑萃取-柱層析純化、超聲波強化提取-柱層析純化、超臨界流體萃取-超聲波純化等方法。但是溶劑萃取-柱層析純化、超聲波強化提取-柱層析純化方法需要上柱，還需要脫色，不僅操作麻煩，而且有毒有機溶劑會帶來污染；超臨界流體萃取-超聲波純化雖然不進行化學反應，不生成有害物質，但所需設備特殊，不易進行大批量生產。
【發明內容】
[0006]本發明目的是提供一種蠶蟲草(活性物質)蟲草素的提取工藝，此工藝路線操作簡單、效率高，既減少了舊工藝中上柱、脫色帶來的操作麻煩、又避免了上柱過程中帶來的有毒有機溶劑污染，而且能夠進行大批量生產、提高得率，從而降低了成本，屬于綠色技術和清潔生產新工藝，解決【背景技術】中所述存在的問題。
[0007]本發明目的是通過下面的技術方案實現的:蠶蟲草(活性物質)蟲草素的提取工藝，其工藝為:
[0008]I)蠶蟲草經65°C烘干后，置于全封閉粉體設備中，在一定溫度下采用機械擠壓、撞擊使固體成分乳化的方式進行粉碎；
[0009]2)將粉碎后的蠶蟲草粉與取6-10倍于原料藥重量的10-50%聚合物水溶液充分溶解后，按質量比為鹽:聚合物=0.5-3: I加入鹽充分振蕩，靜止分相，離心分離，去其沉淀物得上層清液；
[0010]3)將步驟2)得到的上層清液依次用乙酸乙酯和石油醚洗滌后，真空干燥，得蟲草素。
[0011]本發明技術方案采用雙水相萃取法提取蠶蟲草蟲草素，有別于蟲草素常規的提取方法，中國專利2012510084508.5公開了一種從蛹蟲草子實體中提取精制蟲草素的方法，采用的技術方案是:將蛹蟲草子實體粉碎后加乙醇回流提取，濾液經正丁醇萃取后上硅膠柱洗脫，濃縮后的洗脫液室溫結晶即可得蟲草素，此方法與中國專利00130376.7公開的蟲草素提取方法類似。現有文獻《Production of cordycepin by surface culture usingthe medicinal mushroom Cordyceps militaris》(Mina Masuda, Eriko Urabe,《Enzymeand Microbial Techno logy ))2006年第01期)米用Dowex-1-OH-l樹脂柱從北冬蟲夏草的培養濾液中分離得到蟲草素。美國專利US8008060公開了一種從蛹蟲草固體培養基殘基中提取和純化蟲草素的方法以及制備蟲草素干粉的方法，采用微波法進行提取，極大地提高了蟲草素的粗提得率，達75%以上。上述文獻中對蟲草素的提取純化工藝均為常規方法，工藝繁雜，且提取率不高。
[0012]本發明使用雙水相萃取法，利用兩種化學結構不同的親水性高聚物或者一種親水性高聚物與無機鹽在水中以適當的濃度形成的互不相溶的兩個水相體系，利用體系中多糖、蛋白質和其它生物分子在兩個水相間分配系數的差異，而使得各自溶解度不同，從而進行分離。本發明工藝條件溫和、處理時間短、后處理簡便，不會引起生物活性物的失活和變性，又去除了組織物質和部分無效成分，延長了儲存期，提高了純度和提取率，提供了一種活性成分的新的工業化提取途徑`，該法省時，省力，提取物含量高，提取率高。
【具體實施方式】
[0013]以下將結合具體實施例對本發明做進一步闡述，這些實例僅用于說明目的，而不用于限制本發明范圍。
[0014]實施例1
[0015]稱取一定量的聚乙二醇6000溶于去離子水中，按照表1配制溶液，備用。蠶蟲草經65°C烘干后，置于全封閉粉體設備中，在25°C下采用機械擠壓、撞擊使固體成分乳化的方式進行粉碎，將粉碎后的蠶蟲草按照表1中比例量稱取，用聚乙二醇6000水溶液充分溶解后，按表1中的比例加入檸檬酸銨充分振蕩，靜止分相，離心分離，去其沉淀物得上層清液；所得上層清液用乙酸乙酯和石油醚分別洗滌后，真空干燥，得蟲草素。
ScfaS I 聚乙二醇600濃 I 聚乙二醇 6000
蠶蟲草度二醇6000質量蟲草素含量
比
[0016]提取物I 50 份__10%__300 份__0￡|1__69.77%
提取物 2 125 份__30% — 1000 份— 2:185.81%
提取物 3 200 份50%2000 份3:172.34%[0017]實施例2提取工藝比較
[0018]蠶蟲草經65°C烘干后，置于全封閉粉體設備中，在25°C下采用機械擠壓、撞擊使固體成分乳化的方式進行粉碎，將粉碎后的蠶蟲草按照以下不同方法提取純化制備蟲草素。
[0019]樣品I (回流提取-柱層析純化)(方法參考中國專利00130376.7):取蠶蟲草400份，加5倍量30%乙醇(溫度70°C )，浸泡48小時，將浸泡后的混懸液上回流裝置，加熱回流2小時，回收乙醇，加水沉淀，調pH3.5，24小時后過濾，將回收后的藥液加水溶解進行冷藏沉淀，溫度4°C，時間24小時。將冷置后的藥液用微孔濾膜進行過濾(0.85i!m)濾液用
0.1mol / L調4.0備用，上離子換柱，收集洗脫液，將洗脫液進行減壓濃縮至粘稠狀，將粘稠的液體于4°C,冷置24小時使之結晶析出，過濾,上述濾液加適量正丁醇，置4°C,冷置24小時使之結晶析出，過濾，濾液如此反復處理2-3次，將過濾所得結晶置冷凍干燥機中進行干燥，干燥后經測定后確定蟲草素提取率為5.387%，得到的蟲草素純度為94%。
[0020]樣品2 (超聲波提取-柱層析純化):取蠶蟲草400份，加5倍量30%乙醇(溫度70°C 2)混合，并在攪拌器內攪拌均勻，然后經管道緩慢流入容器，在該管道的管壁上設有超聲波發生器，他對管道內緩慢流動的混合物進行超聲振蕩破碎處理，處理時間為30分鐘，管式分離機離心(16000r / min)，取上清液，減壓濃縮至提取液Iml含Ig生藥，上離子換柱，收集洗脫液，將洗脫液進行減壓濃縮至粘稠狀，將粘稠的液體于4°C，冷置24小時使之結晶析出，析出的結晶置冷凍干燥機中進行干燥，干燥后經測定后確定蟲草素提取率為62.18%，得到的蟲草素純度為36%。
[0021]樣品3(超臨界流體萃取-有機溶劑純化)(方法參考中國專利01126910.3):取蠶蟲草0.75kg，裝入萃取釜中，采用超臨界二氧化碳萃取技術，條件:50°C 2，35Mpa，20L / h，平衡15分鐘后流動萃取。萃取之后進行分離，進入分離釜，分離釜壓力6Mpa，30°C，在2小時后采樣得水狀物約40ml (下層):上層為油`狀物。分三次加入10%乙醇各200ml作夾帶劑，每次萃取1-2小時，萃取液540ml左右，合并加活性炭除雜，真空濃縮，得淡黃色顆粒狀物235mg，蟲草素含量75.05%，得率約16.79%。用有機溶劑純化后能將蟲草素含量提高到98%，得率降為8.09%。
[0022]樣品4 (聚維酮-檸檬酸銨雙相水系統):稱取聚維酮6000溶于去離子水中，配制為濃度為20%的溶液，備用。取蠶蟲草400份，加入6倍體積聚維酮水液充分溶解后，按檸檬酸銨/聚維酮6000質量比為2:1加入檸檬酸銨充分振蕩,靜止分相，尚心分尚，去其沉淀物得上層清液；所得上層清液用乙酸乙酯和石油醚分別洗滌后，真空干燥，得沉淀，經測定后確定蟲草素提取率為57.29%，得到的蟲草素純度為78.31%。
[0023]樣品5 (聚乙二醇-硫酸銨雙相水系統):稱取聚乙二醇6000溶于去離子水中，配制為濃度為20%的溶液，備用。取蠶蟲草400份，加入6倍體積聚乙二醇水液充分溶解后，按硫酸銨/聚乙二醇6000質量比為2: I加入硫酸銨充分振蕩，靜止分相，離心分離，去其沉淀物得上層清液；所得上層清液用乙酸乙酯和石油醚分別洗滌后，真空干燥，得沉淀，經測定后確定蟲草素提取率為53.29%，得到的蟲草素純度為88.31%。
[0024]結果明顯可見用本發明方法提取最省時，省力，提取率和純度的效價比最高，該方法為工業化提取蟲草素提供了新途徑。
[0025]實施例3建立測定蟲草素含量的方法[0026]色譜條件色譜柱:KnauerEuropher_100C18 (5 u m, 4.6 X 250mm);流動相:乙腈-0.05mol / LKH2PO4 緩沖液(7.5: 92.5);流速:1!^ / min 檢測波長:260nm ;柱溫:25°C ;進樣量=IOuL0
[0027]檢測波長的選擇取蟲草素對照品適量，加甲醇制成每ImL含蟲草素0.2mg的溶液，按上述色譜條件進行測定。提取對照品紫外光譜圖可見，蟲草素在259.3nm處有最大吸收，所以最終選擇波長260nm測定蟲草素。
[0028]對照品溶液的制備取在105°C下干燥至恒重的蟲草素對照品適量，精密稱定，置IOmL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取lmL，置50mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每ImL含蟲草素30 y g的溶液，作為對照品溶液。
[0029]線性關系考察分別精密吸取對照品溶液1，5，10，15，20 U L注入高效液相色譜儀，按照上述色譜條件進行測定，以對照品溶液的進樣量(ng)為橫坐標，峰面積(A)為縱坐標繪制標準曲線，計算回歸方程。
[0030]供試液的制備取制備得到的提取物，每份約0.3g，精密稱定，置已干燥至恒重的具塞錐形瓶中，加入20 %甲醇30倍，超聲提取lOmin。超聲提取，取出，冷卻至室溫，搖勻，離心，取上清液0.45 y m微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續濾液，即得。精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 y L進行測定，以外標法(峰面積)計算提取物中蟲草素的含量。
[0031 ]實施例4提取物的鑒別及確認
[0032]取本品粉末0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加20 %乙醇IOmL,密塞，超聲提取30min，搖勻，靜置，過濾，取續濾液，作為供試品溶液。另取腺苷、腺嘌呤和蟲草素對照品，加20%乙醇制成每ImL含腺苷0.284mg、腺嘌呤0.lmg、蟲草素0.39mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VIB)試驗，吸取供試品溶液、對照品溶液各10 ii L,分別點于同一含4%磷酸氫二鈉的羧甲基纖維素鈉溶液為黏合劑的硅膠GF254薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-濃氨水(4: 4: I)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈(254nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。
【權利要求】
1.蠶蟲草(活性物質)蟲草素的提取工藝，其工藝為: 1)蠶蟲草經65°C烘干后，置于全封閉粉體設備中，在一定溫度下采用機械擠壓、撞擊使固體成分乳化的方式進行粉碎； 2)將粉碎后的蠶蟲草粉與取6-10倍于原料藥重量的10-50%聚合物水溶液充分溶解后，按質量比為鹽:聚合物=0.5-3: I加入鹽充分振蕩，靜止分相，離心分離，去其沉淀物得上層清液； 3)將步驟2)得到的上層清液依次用乙酸乙酯和石油醚洗滌后，真空干燥，得蟲草素。
2.如權利要求1所述的蠶蟲草(活性物質)蟲草素的提取工藝，其特征在于所述工藝步驟I)中一定溫度為_50°C~30°C。
3.如權利要求1所述的蠶蟲草(活性物質)蟲草素的提取工藝，其特征在于所述工藝步驟2)所述聚合物為聚乙二醇、聚維酮、葡聚糖、壬苯環氧乙烯或右旋糖酐硫酸鈉一種或幾種的混合物，所述的鹽為KH2P04、K2HP04、(NH4)2SO4、檸檬酸銨、氯化鉀或硝酸鈉。
4.如權利要求3所述的提 取工藝，其特征在于所述聚合物為聚乙二醇6000。
【文檔編號】C07H19/16GK103772460SQ201410051001
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年2月14日 優先權日:2014年2月14日
【發明者】韋敏, 呂曄, 鄭生智, 馬紅 申請人:江蘇省中國科學院植物研究所