]-IsCT的應用的制作方法
【專利摘要】一種抗菌肽 [L6,K11]-IsCT 及其制備方法以及抗菌肽 [L6,K11]-IsCT 的應用，序列： ILGKILKGIKKLF ，制作步驟：根據抗菌肽 [L6,K11]-IsCT 蛋白質序列及畢赤酵母密碼子偏好設計該抗菌肽基因序列 5 ’ ATTTTGGGTAAGATTTTGAAGGGTATTAAGAAGTTGTTT3 ’，在目的基因的 5 ’端加上編碼 Kex2 切割位點的序列與 Not Ⅰ酶切序列 ，在 3 ’端加上 Flag 標簽與終止密碼子和 Not Ⅰ酶切序列；通過 PCR 得到兩個目的基因的 PCR 產物，然后構建重組質粒；將重組質粒 pPICZ α A-IsCT 導入畢赤酵母中構建重組畢赤酵母；在含 ZeocinTM 的培養基上培養獲取單體克隆。按 5000-5500 單位 /kg 拌入飼料中連續一個月可防治多種豬病。
【專利說明】-種抗菌肽[L6,K11]-lsCT及其制備方法以及抗菌肽[L6, K11]-lsCT的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，具體地說是一種抗菌肽[L6，Kn]-IsCT及其制備方法 以及抗菌肽[L 6，K11]-IsCT的應用。
【背景技術】
[0002] 抗菌肽具有較好的廣譜抑菌性能，對大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌等都有 不同程度的抑制作用。近年研究發現許多抗菌肽對某些真菌、病毒及癌細胞等也均具有強 有力的殺滅活性。近年來，抗生素作為添加劑在豬飼料上泛濫使用，它可以破壞豬腸道內正 常菌群，不喂抗生素時抵抗力差，身體正常發育受影響，而人類在食用后，抗生素就會積蓄 在體內，使人體產生大量的耐藥菌株，最終導致人體抗藥性的增加。相對于抗生素而言，具 有無殘留、效價高、無毒害作用等優點是抗生素潛在的替代品。
[0003] 蝎子是我國的一種傳統名貴中藥，2000多年前就記載了蝎子的藥用史。其具有抗 腫瘤，殺蟲，抑菌和抗菌功效，其作用主要來源于蝎尾毒腺分泌的毒液。毒液的主要成分是 一類由10-100個氨基酸組成的具有多種生物活性的小分子多肽，它們可以選擇性、特異性 的與細胞膜上的膜蛋白相互作用，從而改變細胞對離子的通透能力，調節細胞體積、pH、膜 電位、興奮性等多種細胞代謝過程和細胞分泌、激素作用和信號轉導等多種生理過程。因 此，從蝎毒素中提取出的抗菌肽具有重要的理論研究意義和應用開發價值。
[0004] 是來源于馬達加斯加黑爪蝎（Opisthacanthus madagascariensis)毒液里的一種 細胞毒性的（cytotoxic)線性肽，其分子量為1502. 9Da，由不含半胱氨酸的13個氨基酸殘 基組成，富含疏水氨基酸（3個Ile，2個Leu)和堿性氨基酸（2個Lys)，具有良好的抑菌性 能，但由于對哺乳動物紅細胞具有溶血活性，所以其應用受到了一定的限制。
[0005] 有報道指出，作為IsCT的衍生物，[L6，K 11]-IsCT具有極低的溶血性，其分子量大 小為1459 Da，有著廣泛的應用前景，目前，。為該類產品在動物飼料中的應用奠定理論基 礎。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是設計合成抗菌肽[L6, Kn]-IsCT基因，導入畢赤酵母中表達，制備 豬飼料添加劑，代替目前飼料中適用的抗生素，以達到預防和治療豬疾病，克服濫用抗生素 帶來的不良后果以及降低生產成本的目的。
[0007] -種新型合成抗菌肽，包括如下序列：ILGKILKGIKKLF。
[0008] 進一步，所述抗菌肽序列相應DNA序列為：5'ATT TTG GGT AAG ATT TTG AAG GGT ATT AAG AAG TTG TTT 3'。
[0009] -種抗菌肽[L6，Kn]-IsCT的制備方法包括以下步驟：（1)、根據抗菌肽[L 6， Kn]-IsCT蛋白質序列及畢赤酵母密碼子偏好設計該抗菌肽基因序列5'ATT TTG GGT AAG ATT TTG AAG GGT ATT AAG AAG TTG TTT ； (2)、在目的基因的5'端加上編碼Kex2切割位點的序列與NotI酶切序列，在3'端加 上Flag標簽與終止密碼子和NotI酶切序列； (3) 、通過PCR得到兩個目的基因的PCR產物，然后通過Sac II與Not I雙酶切連接到 載體pPICZ a A構建重組質粒； (4) 、將重組質粒pPICZ a A-IsCT導入畢赤酵母中構建重組畢赤酵母； (5) 、在含ZeocinTM的YPDZ固體培養基上培養獲取單體克隆； 進一步，步驟（5)培養基配方： 酵母提取物 1.0 g 蛋白胨 2.0 g 葡萄糖 2. 0 g ZeocinTM 100 u L 瓊脂 2. 0 g 加水至100 mL培養條件：30 °C ; (6) 、挑取單體克隆與BMGY培養基中培養； 進一步，步驟（6)培養基配方： 酵母提取物 2.0 g 蛋白胨 4. 0 g YNB 2. 7 g 水 160 mL 10% 甘油 20 mL pH6. 0磷酸緩沖液 20 mL 培養條件：30°C，250 rpm，24h。
[0010] (7)、將步驟（6)中的培養液6000 rpm，10 min，去上清，接適量菌種加入BMMY培養 基中誘導表達； 進一步，步驟（7)培養及配方： 酵母提取物 2.0 g 蛋白胨 4. 0 g YNB 2. 7 g 水 176 mL pH6. 0磷酸緩沖液20 mL 滅菌后加500 ii L甲醇 培養條件：控制起始OD值為1，搖瓶培養，30 °C，250 rpm，每隔24 h取樣（0.25 mL)測 0D600并添加相應甲醇（0? 25 mL)，培養120 h ; (8)、將（7)中發酵液6000rpm，10min，收集上清，調pH 6. 5-7.0,以0.22 iim膜過 濾，抑菌效果顯著； 一種抗菌肽[L6，K11]-IsCT的應用，按5000-5500單位/kg拌入飼料中連續一個月可 防治多種豬病。
[0011] 本發明抗菌肽[L6，Kn]-IsCT，抗病效果好，降低了豬對抗生素的依賴，大幅度提 高豬肉質量。
[0012]
【專利附圖】
【附圖說明】： 圖I : [L6, Kn]-IsCT兩性分子a -螺旋結構圖； 圖2 :制備多拷貝重組菌技術流程； 圖3插入不同片段長度得到的相應克隆數目； 圖4 :發酵液對革蘭氏陰性菌及陽性菌的抑菌效果； 圖5 :發酵液電泳結果； 圖6 :抗菌肽[L6，K11]-IsCT高效液相色譜分析(流動相為30%乙腈和1%。TFA，洗脫液 為45%乙腈）；
【具體實施方式】
[0013] 實施過程： 根據抗菌肽[L6, Kn]-IsCT蛋白質序列設計DNA序列； 5' TCCCCGCGGGGA ATT TTG GGT AAG ATT TTG AAG GGT ATT AAG AAG TTG TTT ATTTGCGGCCGCTTTA 3' 用DNA合成儀合成相應的多聚脫氧核糖核苷酸片段； 設計合成引物 I : 5 ' TCCCCGCGGGGAAITITGGG 3 ' 引物 2 :3，CAAATAAACGCCGGCGAAAT 5， 將2和3通過PCR進行基因擴增； 將抗菌肽基因與載體pPICZ a A用限制性內切酶Not I和Sac II雙酶切并用T4DNA連 接酶連接構成重組質粒； 將重組質粒轉化畢赤酵母構成重組畢赤酵母pPICZ a A-ISCT/X33 ; 用含ZeocinTM的YPDZ固體培養基篩選陽性克隆子； 挑取若干陽性克隆子于BMGY培養基中30 °C，250 rpm，培養至0D600達到2-6 (約24h); 將8中培養液6000 rpm，10 min,去上清，接適量菌體轉至BMMY中培養，控制起始0D600 為 1，30 °C，250 rpm。每隔 24 h 取樣（0? 25 mL)測 0D600 并添加 1% 甲醇（0? 25 mL); 10、 9中菌液發酵120 11后，6000 卬111，10 111111，收集上清調？11至6.5-7.0并以0.22 11111 膜過濾； 11、 高溫滅菌后的營養瓊脂培養基（3. 3%)，待其溫度降到45 °C左右，加入1-2滴TTC 試劑，按1 :1〇〇〇比例加入供試大腸桿菌ATCC8739,混勻，導入無菌培養皿，每皿25 mL，待其 凝固后用無菌不銹鋼管在培養基上打孔，將孔中的培養基用無菌針頭挑出，然后加以火焰 封底，使培養基能充分與平皿融合，每孔加至液面與液體培養基齊平(約70 y L)，于平板底 部做標記，將平皿置于37 °C培養箱中培養15-24 h，觀察抑菌效果； 12、 以金黃色葡萄球菌ATCC25923代替大腸桿菌重復11步驟； 13、 用Hultmark方法測定抗菌活性，達到5000單位/mL ; 14、 將濃縮發酵液按5000-5500單位/kg拌入飼料中飼喂豬，并作對照實驗，觀察記錄 豬的生長狀況。
[0014] 實施例一：抑菌活性對比 采用瓊脂板擴散法對抗菌肽[L6, Kn]-IsCT的殺菌活性進行檢測，并以青霉素為對照。
[0015] 菌種復蘇，接種營養瓊脂平板37°C過夜，次日挑取單體克隆于LB培養液中37°C過 夜，稀釋菌液濃度為105-106cfu/mL，按每個平板25 ii L菌液接種于25 mL LB固體培養基 中，凝固后打孔，每孔接入濃度為I mg/mL SOyL菌液、青霉素及超純水(青霉素為陽性對 照，超純水為陰性對照)，37°C培養8h，測量抑菌圈大小，判定殺菌能力，并觀察一周內抑菌 圈變化，判定殺菌持續時間長短。結果見表1. 表I I mg/mL菌液、青霉素對不同細菌的抗菌活性測定比較
【權利要求】
1. 一種新型合成抗菌肽，其特征在于，包括如下序列：ILGKILKGIKKLF。
2. 根據權利要求1所述的一種新型合成抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽序列相應DNA 序列為：5, ATT TTG GGT AAG ATT TTG AAG GGT ATT AAG AAG TTG TTT3，。
3. -種抗菌肽[L6，Kn]-IsCT的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 、根據抗菌肽[L6，Kn]-IsCT蛋白質序列及畢赤酵母密碼子偏好設計該抗菌肽基因 序列 5, ATT TTG GGT AAG ATT TTG AAG GGT ATT AAG AAG TTG TTT3,； (2) 、在目的基因的5'端加上編碼Kex2切割位點的序列與Not I酶切序列，在3'端加 上Flag標簽與終止密碼子和Not I酶切序列； (3) 、通過PCR得到兩個目的基因的PCR產物，然后通過Sac II與Not I雙酶切連接到 載體pPICZ a A構建重組質粒； (4) 、將重組質粒pPICZ a A-IsCT導入畢赤酵母中構建重組畢赤酵母； (5) 、在含ZeocinTM的YPDZ固體培養基上培養獲取單體克隆； 進一步，步驟（5)培養基配方： 酵母提取物 1.0 g 蚩閂胨 2.0 g 葡萄糖 2.0 g ZcocinTM 100 μ L 瓊胎 2.0 g 加水至IOOmL 培莽條-件：30 *C; (6) 、挑取單體克隆于BMGY培養基中培養； 進一步，步驟（6)培養基配方： '酵_提取物 2.0g 蛋Γ1胨 4.0 g YNB 2.7 g !0%廿油 20 mL 水 _mL pH6.0__中液 IQmL 培#條件；30 °C, 250 rpm，24h; (7) 、將步驟（6)中的培養液6000rpm，lOmin，去上清，接適量菌種加入BMMY培養基中 誘導表達； 進一步，步驟（7)培養及配方： 醉母提取物 2.0 g 迸 l'_ 4.0 g YNB 2.7 g 水 176 mL pH6.0磷酸緩沖液20 mL 火菌后加500 μ L甲醇 培養條件：控制起始OD值為1，搖瓶培養，30°C，250rpm，每隔24h取樣（0. 25mL)測 0D600并添加相應甲醇（0. 25mL)，培養120h ; (8)、將（7)中發酵液6000rpm，lOmin，收集上清，調ρΗ6· 5-7. 0,以0· 22 μ m膜過濾。
4. 一種抗菌肽[L6, K11]-IsCT的應用，其特征在于，按5000-5500單位/kg拌入飼料中 連續一個月可防治多種豬病。
【文檔編號】C07K14/435GK104262475SQ201410031498
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年1月23日 優先權日:2014年1月23日
【發明者】潘韻, 唐明輝, 鄭文官, 陳義昆, 侯雅君, 李永新 申請人:深圳市圣西馬生物技術有限公司