一種地衣芽孢桿菌分泌的抗菌肽及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種地衣芽孢桿菌分泌的抗菌肽及其制備方法和應用。所述的抗菌肽氨基酸序列為序列表SEQIDNO.1所示，分子量為1290.4道爾頓，等電點5.23。其制備方法是：硫酸銨沉淀培養基中地衣芽孢桿菌分泌的的抗菌肽，利用陰離子交換、分子篩層析和反向高效液相色譜法純化抗菌肽。該抗菌肽具有顯著的抗菌活性，且不會對豬的紅細胞產生溶血作用，可用于開發制備飼用抗菌藥物。
【專利說明】一種地衣芽孢桿菌分泌的抗菌肽及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術，具體的，本發明涉及一種地衣芽孢桿菌分泌的抗菌肽及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]抗菌肽是機體先天免疫的重要組成成分，是許多生物體抵抗外來致病菌侵襲的第一道屏障。由于其獨特且多樣的生物學功能和作用機制引起了科學界的廣泛關注和研究，一方面研究抗菌肽在先天免疫中發揮作用的生物學基礎，一方面將其作為設計新型抗菌、抗感染制劑的分子模板。抗菌肽是自然進化的產物，和微生物一起已經存在了億萬年，盡管經過長期的共同進化，但抗菌肽并沒有丟失其殺滅或抑制微生物的能力，或產生使微生物逃逸抗菌肽的能力，所以說抗菌肽是研發新型高效抗生素替代品的重要突破。
[0003]芽孢桿菌是一類需氧或兼性厭氧G+(目前也發現有G-)，在一定條件下能產生抗逆性內生孢子的化能異養菌。在自然界分布非常廣泛，生理特性豐富多樣，是土壤和植物微生態優勢種群之一。它可產生多種抗生素，包括脂肽類、肽類、磷脂類、多烯類、氨基酸類、核酸類物質，對多種動、植物及人類病原菌起到很好的抑制作用。而且芽孢桿菌還具有很強的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性。因此，芽孢桿菌被廣泛應用于醫藥、農藥、食品、飼料加工、環境污染治理等各個行業。地衣芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是自然界中廣泛存在的一種非致病性細菌，在生長代謝過程中能夠產生多種抗菌物質，包括非核糖體合成的脂肽類抗生素、核糖體合成的羊毛硫抗生素和抗菌蛋白。這些抗菌物質在抑制細菌、真菌和酵母污染方面具有重要應用。在食品、醫藥、化工和防治植物病害等方面也有重要的應用價值。但從地衣芽孢桿菌中分離純化抗菌肽的報道較少，且抗菌活性低，甚至無抗菌活性。
【發明內容】
`[0004]本發明的目的在于提供一種新的具有廣譜抗菌的地衣芽孢桿菌分泌的抗菌肽及其制備方法和在飼料中的應用。
[0005]為了實現本發明，本發明采用如下技術方案:
一種地衣芽孢桿菌分泌的抗菌肽，從地衣芽孢桿菌分泌產物中分離得到的一種單鏈多肽，分子量是1290.4，等電點5.23，所述的抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示為:SffSCCGNCSISGS,該抗菌肽具有抗菌活性，且不會對豬的紅細胞產生溶血作用。
[0006]所述的抗菌肽的制備方法，將地衣芽孢桿菌置于嚴格厭氧條件培養24小時后離心，收集培上清并用硫酸銨沉淀法富集抗菌肽，經離子交換、分子篩層析和反相高效液相色譜純化。
[0007]所述的離子交換為:將硫酸銨沉淀后得到的樣品透析，上樣于陰離子交換柱，用含(T0.5M NaCl的緩沖液梯度洗脫，收集洗脫的蛋白。
[0008]所述的分子篩層析為:將離子交換得到的活性成分透析，上樣于分子篩層析柱，用緩沖液洗脫，收集第三個峰。[0009]所述的反向高效液相色譜為:將分子篩層析得到的活性物質上樣于C18柱，用含
0.1%的乙腈從10~60%梯度洗脫，收集38min處峰。
[0010]所述的抗菌肽的應用，作為飼料的抗菌制劑。
[0011]下面用本發明地衣芽孢桿菌分泌的抗菌肽的抗菌試驗和安全性試驗說明本發明的有益效果:地衣芽孢桿菌分泌的抗菌肽對革蘭氏陽性菌和陰性菌均有較高的抗菌活性，對萬.coli K 88的最小抑菌濃度為64 μ g/mL，對5: aureus ATCC25923的最小抑菌濃度為32 μ g/mL ;安全性高，抗菌肽濃度高達256 μ g/mL對豬紅細胞也無溶血作用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1為陰離子交換色譜純化地衣芽孢桿菌分泌的抗菌肽SDS-PAGE圖，(泳道1，蛋白marker ;泳道2，地衣芽孢桿菌分泌的總蛋白；泳道3，陰離子交換色譜純化后得到的蛋白)；
圖2為分子篩層析色譜純化地衣芽孢桿菌分泌的抗菌肽SDS-PAGE圖。(泳道1，蛋白marker ;泳道2，陰離子交換色譜純化后得到的蛋白；泳道3，分子篩層析色譜純化后得到的蛋白);
圖3為地衣芽孢桿菌分泌的抗菌肽對豬紅細胞溶血率測定。
【具體實施方式】
[0013]以下結合附圖和實施例對本發明做進一步的說明。
[0014]實施例1陰離子交換`純化地衣芽孢桿菌分泌的抗菌肽
1)裝柱
2)10體積的低鹽緩沖液，至紫外吸收值穩定
3)將樣品注射至進樣柱內，調整進樣流速為Iml/min ;
4)10體積的低鹽緩沖液，至紫外吸收值穩定
5)(T0.5M NaCl氯化鈉梯度洗脫
6)收集樣品，用Bradford試劑盒測定蛋白濃度，并用低鹽緩沖液將蛋白濃度調整為lmg/ml，取5 μg樣品用于NuPAGE分析，如圖1所示，其余保存于_ 80°C超低溫冰箱。
[0015]實施例2分子篩層析純化地衣芽孢桿菌分泌的抗菌肽
1)裝柱
2)10體積的緩沖液平衡，至紫外吸收值穩定
3)將樣品注射至進樣柱內，調整進樣流速為0.1 ml/min ；
4)緩沖液洗脫，收集第三個峰
5)收集樣品，用Bradford試劑盒測定蛋白濃度。用瓊脂糖孔穴擴散法檢測每個峰的抗菌活性，用低鹽緩沖液將蛋白濃度調整為lmg/ml，取5 μg樣品用于NuPAGE分析，如圖2所示，其余保存于-80°C超低溫冰箱。
[0016]實施例3地衣芽孢桿菌分泌的抗菌肽對豬紅細胞溶血率測定
1)將抗菌肽在96孔板上進行系列稀釋，終濃度為256、128、64、32、16、8、4μ g/mL，每個濃度10uL，共七個濃度，同時設置三個重復；
2)90uL/孔的紅細胞懸液加入到稀釋好的多肽孔中，設置陽性對照孔為1%紅細胞懸液中加入IOuL 10%的Triton X-100 (終濃度為1%);陰性對照孔位1%紅細胞懸液中加入IOuL 的 IXPBS ；
3)將96孔板置于37°C，5%C02環境中培養18_24h ；
4)培養結束后，將96孔板在離心機無制動停機狀態下1000-1500rpm離心20min；
小心吸取上清至一新平底透明96孔培養板中，用酶標儀測定各孔在414nm和546nm下的吸光度；軟件分析得到0D414nm、0D546nm和Delta OD值；通過下列公式計算抗菌肽對豬紅細胞的溶血率，結果如圖3所示:丁酸梭菌分泌的抗菌肽對豬紅細胞無溶血作用。
【權利要求】
1.一種地衣芽孢桿菌分泌的抗菌肽，其特征是，從地衣芽孢桿菌分泌產物中分離得到的一種單鏈多肽，分子量是1290.4，等電點5.23，所述的抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID勵:1所示為:3130^從^1363，該抗菌肽具有抗菌活性，對疋coli K 88最小抑菌濃度為64Pg/ml，5: aureus最小抑菌濃度為32 μδ/πι1，且不會對豬的紅細胞產生溶血作用。
2.一種根據權利要求1所述的抗菌肽的制備方法，其特征是，將地衣芽孢桿菌置于嚴格厭氧條件培養24小時后離心，收集培上清并用硫酸銨沉淀法富集抗菌肽，經離子交換、分子篩層析和反相高效液相色譜純化。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征是，所述的離子交換為:將硫酸銨沉淀后得到的樣品透析，上樣于陰離子交換柱，用含(T0.5Μ NaCl的緩沖液梯度洗脫，收集洗脫的蛋白。
4.根據權利要求2所述的制備方法，其特征是，所述的分子篩層析為:將離子交換得到的活性成分透析，上樣于分子篩層析柱，用緩沖液洗脫，收集第三個峰。
5.根據權利要求2所述的制備方法，其特征是，所述的反向高效液相色譜為:將分子篩層析得到的活性物質上樣于C18柱，用含0.1%的乙腈從10飛0%梯度洗脫，收集38min處峰。
6.一種根據權利要求 1所述的抗菌肽的應用，作為飼料的抗菌制劑。
【文檔編號】C07K1/16GK103772490SQ201410021906
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月18日 優先權日:2014年1月18日
【發明者】汪以真, 欒超 申請人:浙江大學