一種診斷用微小隱孢子蟲重組抗原的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種微小隱孢子蟲重組抗原基因MUCIN，及其表達的融合蛋白重組抗原rMUCIN，隨機取的520份健康人血清，用重組抗原rMUCIN和rCp23做檢測抗原，ELISA檢測人血清IgG抗體，用spss軟件對數據進行分析rMUCIN蛋白質與rCP23蛋白質檢測未知血清陽性率相同（XC2=0.370?P=0.543＞0.05），而rMUCIN蛋白質檢測未知血清陽性率高于微小隱孢子蟲粗抗原（XC2=5..222?P=0.02＜0.05）。本發明還提供了ELISA檢測抗微小隱孢子蟲?IgG抗體的試劑盒，它是以重組抗原rMUCIN做檢測抗原，以rCp23做陽性對照，特異性、敏感性和可靠性更強。
【專利說明】一種診斷用微小隱孢子蟲重組抗原
【技術領域】
[0001]本發明屬生物學診斷【技術領域】，確切地說是一種診斷用微小隱孢子蟲重組抗原及以該抗原為診斷抗原檢測抗微小隱孢子蟲IgG抗體的試劑盒。
【背景技術】
[0002]隱孢子蟲屬頂復門原蟲。從致病性方面分類該蟲屬于機會性原蟲。蟲體主要寄生于胃腸道上皮細胞的微絨毛邊緣，感染宿主后癥狀表現輕重不一。隱孢子蟲是公認的引起發展中國家兒童腹瀉的重要原因之一也是艾滋病患者，免疫力低下者主要的致死原因。目前為止隱孢子蟲分為24種，其中感染人的主要蟲種為微小隱孢子蟲(C.parn?)和人隱孢子蟲(C hominis)。美國將微小隱孢子蟲列為B類生物武器。本病缺乏明顯的臨床特征，在癥狀和體征上與其他病原體引起的腸炎相比無明顯區別。目前隱孢子蟲的檢測方法主要包括病原學檢測、免疫學檢測和分子生物學方法。但是，病原學檢測費時、費力，鏡檢的敏感性差、干擾多。分子生物學方法對儀器要求較高，不宜普及。免疫學檢測具有較高的特異性與敏感性適用于臨床診斷與流行病學調查。
[0003]但是目前國內外的研究的重組抗原主要集中在表面抗原CP23、CP41、SA35與SA40等。隱孢子蟲很多蟲種的基因組信息已經公布，這將為更多抗原，特別是診斷等抗原分子的研究提供重要基礎。
[0004]國內尚無標準化的重組抗原診斷試劑盒，所以急需尋找新的敏感、特異的重組抗原，對隱孢子蟲病流行病學調查和防治研究具有重要意義。因此本實驗旨在篩選可替代天然抗原的重組抗原，用于隱孢子蟲病的免疫學診斷。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是為提高隱孢子蟲病的免疫學診斷敏感性和特異性，而提供一種微小隱孢子蟲重組抗原基因、重組抗原蛋白及用于隱孢子蟲病的免疫學診斷試劑盒。
[0006]一種微小隱孢子蟲重組抗原基因麗C/見它的堿基序列如序列表SEQ ID N0.1所示。
[0007]一種微小隱孢子蟲重組抗原rMUCIN,它是由堿基序列如序列表SEQ ID N0.1所不基因表達的蛋白。
[0008]ELISA檢測抗微小隱孢子蟲IgG抗體的試劑盒，它的檢測抗原是由堿基序列如序列表SEQ ID N0.1所示基因表達的蛋白；
所述的ELISA檢測抗微小隱孢子蟲IgG抗體的試劑盒，陽性對照為微小隱孢子蟲rCp23抗原。
[0009]本發明提供了一種微小隱孢子蟲重組抗原基因麗/67#，及其表達的融合蛋白重組抗原rMUCIN，隨機取的520份健康人血清，用重組抗原rMUCIN和rCp23做檢測抗原，ELISA檢測人血清IgG抗體,用spss軟件對數據進行分析rMUCIN蛋白質與rCP23蛋白質檢測未知血清陽性率相同(Xc2=0.370 P=0.543 > 0.05)，而rMUCIN蛋白質檢測未知血清陽性率高于微小隱孢子蟲粗抗原(Xe2=5..222 P=0.02 < 0.05)。本發明還提供了 ELISA檢測抗微小隱孢子蟲IgG抗體的試劑盒，它是以重組抗原rMUCIN做檢測抗原，以rCp23做陽性對照，特異性、敏感性和可靠性更強。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010]圖1 MUCIN基因1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR的產物圖；M: Marker ； 1: MUCIN基因的PCR擴增；
圖2克隆載體酶切鑒定結果；M !Marker ；1:重組質粒PMD18-T- MUCIN雙酶切；
圖3重組表達載體的酶切鑒定結果；M !Marker ；1:重組質粒pET-28a_MUCIN雙酶切；圖4、5純化的目的蛋白鑒定結果；M:蛋白質分子量標準；1:重組蛋白質rMUCIN;圖6重組抗原MUCIN和CP23抗微小隱孢子蟲IgG抗體反應吸光度值的線性回歸；實線表示最佳擬合線；
圖7 Western blot檢測陽性血清樣本，M:蛋白質分子量標準；1_15:重組抗原MUCINWestern blot檢測部分陽性血清樣本；NC:陰性對照。 【具體實施方式】
[0011]實施例1微小隱孢子蟲抗原基因的MUCIN的克隆 一、提取微小隱孢子蟲c.parvum (長春分離株)總DNA
(1)IXIO7 個微小隱孢子蟲加入 Iml 裂解液((0.5% SDS，ImM EDTA，50mM Tris-HCl(pH 8.5))懸浮沉淀兩次,每次14000 Xg, 5min,棄掉上清；
(2)加入IOOPL裂解液懸浮沉淀后在漩渦震蕩器上混勻30s；
(3)再液氮中靜置Imin后立即放入65°C水浴，lmin。重復此步驟18次，每重復三次放漩渦震蕩儀上混勻30s ；
(4)加入WL20mg/ml的蛋白酶K，55°C水浴鍋中靜置3h ；
(5)90°C水浴鍋中靜置20min以滅活蛋白酶K;
(6)加入400ul裂解液，再加入500μ?Tris飽和酚，上下震蕩混勻30s后離心12000Xg，5min ；
(7)吸取上清，加入等體積的酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，上下震蕩混勻30s后離心，12000Xg，5min ；
(8)吸取上清，再加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1)，上下震蕩混勻30s后離心，12000Xg，5min ；
(9)吸取上清，加入2.5倍體積的無水乙醇和1/10體積的3M NaAc, _20°C過夜。
[0012](10)4°C離心 12000Xg,30min,棄掉上清；
(11)加入Iml75%乙醇，離心12000Xg，lOmin。重復I次；
(12)待沉淀干燥后，用IOPLMilliQ水溶解DNA。
[0013]二、引物的設計與合成
根據Genebank上MUCIN基因(序列號為AF068065.1)對應的結構域，加上pET_28a (+)圖譜中利于克隆入表達載體的酶切位點而設計引物，下劃線部分為酶切位點BamH1、XhoI ；上游引物:5’ - GGATCCATTCCAGGTTCACATTCCG -3’ (BamHI)；下游引物:5’ - CTCGAGTTAAGATTCGTTCCAGAATGATG’ (XhoI)。
三、PCR擴增目的基因
以提取的DNA樣本為模板，進行降落PCR擴增，反應體系:上游引物(IOpM) 0.5 μ L，下游引物(IOpM) 0.5μ L ;模板 DNA , 2.5 μ L ；10mM dNTPs，2 μ L ;10XPCR Buffer，2.5 μ L ;ΕχTaq Polymerase (5U/ μ L), 0.2 μ L ； ddH20,16.8 μ L ;總體積，25 μ L。
[0014]反應條件:94°C預變性2min ;94°C變性30s ;退火溫度為58°C 30s;72°C延伸2min，共30個循環，最后72°C延伸7min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR的產物(圖1)。
[0015]四、目的基因PCR擴增產物的回收目的基因與克隆載體pMD18-T連接及轉化
I)PCR陽性產物回收按Axygen公司的DNA凝膠回收試劑盒的說明書進行。將回收PCR產物連接到pMD18-T載體上，連接反應體系:膠回收產物IyL ;pMD18-T載體，I μ L ;Ligation Solution 3 μ L ;ddH20, 5 μ L ;總體積10 μ L。混勻并瞬離后置16°C水浴鍋中過夜連接。
[0016]2)轉化
將IOul pMD18-T連接產物加入DH5 α感受態細胞，輕輕搖勻，冰上靜置30min，42°C水浴鍋中熱激90s，冰水中水浴2min，加入800ul無抗生素的LB培養液，37°C搖床中180r/min振蕩45min,3, OOOrpm, 3min,離心。吸出上清，留200ul上清混勻后涂LB-Amp (100 μ g/mL)平板。
[0017]3)重組克隆載體的鑒定
挑取平板上的單克隆菌落，分別接種于5ml含IXf5Amp的LB培養液中，37°C，180r/min振蕩培養過夜。甘油保菌，保存-80°C冰箱；剩下菌液提取質粒用于克隆載體酶切鑒定(圖
2)。測序結果通過DNAman分析和在NCBI上BLAST進行同源性分析比對，測序結果，目的基因的堿基序列如SEQ ID N0.1所示，重組克隆載體命名為pMD18-T-MUCIN。
[0018]實施例2構建重組質粒pMD18-T- MUCIN及表達
重組質粒PMD18-T- MUCIN及表達載體pET-28-a用BamH1、XhoI兩種內切酶進行酶切，將MUCIN基因片段經1%瓊脂糖凝膠電泳回收插入表達載體pET-28a中構建重組表達質粒pET-28a-MUCIN。重組表達載體的酶切鑒定結果見圖3。將重組表達質粒pET-28a_MUCIN轉ABL2KDE3)中進行表達，融合蛋白命名為rMUCIN，在大腸桿菌中誘導表達重組蛋白并分析其可溶性，The QlAexpressionist ?說明書純化6XHis標簽蛋白進行操作。
[0019]重組蛋白的SDS-PAGE與Western blot鑒定:配制12%聚丙烯酰胺凝膠，Westernblot常規方法。一抗:鼠源抗HIS標簽單克隆抗體(天津三箭公司)TBST稀釋(1:5000)。封閉液:5%脫脂奶粉。二抗:堿性磷酸酶標記的羊抗小鼠IgG(H+L)抗體。顯色液:BCIP/NBT0結果(圖4和圖5)可見純化出的目的蛋白質。
[0020]實施例3用rMUCIN為檢測抗原的ELISA檢測抗微小隱孢子蟲IgG抗體
按照Priest等人制備微小隱孢子蟲Cp23抗原，用于血清學檢測對照抗原(PriestJj Kwon Jj Moss D.Detection by enzyme immunoassay of serum immunoglobulinG antibodies that recognize specific Cryptosporidium parvum antigens.ClinMicrobiol Rev.1999，37 (5):1385-92)。
[0021]一、血清學檢測
本實驗隨機取520份健康人血清，用重組抗原rMUCIN和rCp23特異性檢測人血清IgG抗體加一抗時:加人陰性血清的孔作為陰性對照，加TBST孔作為空白對照。
[0022](I)將重組蛋白 rMUCIN、Cp23 抗原分別用 Coating buffer (1.59g Na2CO3, 2.93gNaHCO3 )稀釋至終濃度5Pg/mL，0.2Pg/mL以50μ?7孔的量加入到96孔微量滴定板的各孔板中，4°C條件下包被過夜，ELISA自動洗板機徹底洗滌微量滴定孔4次，每次3min ；
(2)每個孔中加入IOOPLBlocking buffer (含0.5 % BSA的PBS)，37°C溫箱中孵育lh, ELISA自動洗板機洗滌3次，每次3min ；
(3)將用TweenBuffer 1:50稀釋后的人血清以100μ?7孔的量加入到ELISA板中，37°C溫箱中孵育3-4h，ELISA自動洗板機洗滌3次，每次3min ；
(4)每個孔中加入50μ?用TweenBuffer以1:20000倍稀釋的堿性磷酸酶標記的羊抗人(Sigma公司，圣路易斯，美國)IgG抗體，37°C溫箱中孵育lh，ELISA自動洗板機洗滌3次，每次3min ；
(5)—個PNPP[4 -硝基苯基磷酸二鈉水合物](Sigma公司，圣路易斯，美國)顯色劑藥片溶解于5mL 9.7%，二乙醇胺(pH為9.8)，制成底物顯色液，向每個孔加入50μ?的底物顯色液，避光條件下顯色；
(6)顯色后，通過酶標儀檢測OD4tl5值。
[0023]二、ELISA結果判定標準:
結果判定標準:以A4tl5值陰性對照平均值+3Χ陰性對照標準差作為陽性。
[0024]取42個陰性血清樣本，根據公式計算出A4tl5值大于0.36為陽性血清。為提高實驗精確度每份樣本重復3個孔`，求平均值后代入公式計算。
[0025]三、血清樣本ELISA結果分析
對rMUCIN與rCP23重組抗原檢測未知血清結果統計并用四格表(表1)進行分析。
【權利要求】
1.一種微小隱孢子蟲重組抗原基因#漢7/見它的堿基序列如序列表SEQ ID N0.1所示。
2.一種微小隱孢子蟲重組抗原rMUCIN，它是由堿基序列如序列表SEQ ID N0.1所示基因表達的蛋白。
3.ELISA法檢測抗微小隱孢子蟲IgG抗體的試劑盒，其特征在于:它的檢測抗原是由喊基序列如序列表SEQ ID N0.1所不基因表達的蛋白。
4.根據權利要求3所述的ELISA法檢測抗微小隱孢子蟲IgG抗體的試劑盒，其特征在于:陽性對照為微小隱孢子蟲C p23抗原。
【文檔編號】C07K14/44GK103740733SQ201410011922
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月12日 優先權日:2014年1月12日
【發明者】尹繼剛, 高依然, 向梅, 姜寧, 陸慧君, 陳啟軍 申請人:吉林大學