一種緩解鉛毒性的富硒米肽酶解制備方法

一種緩解鉛毒性的富硒米肽酶解制備方法
【專利摘要】本發明屬于富硒稻米深加工領域，涉及一種緩解鉛毒性的富硒米肽酶解制備方法。本發明利用新鮮富硒稻米為原料，將原料磨粉、過篩、脫脂后過夜風干，以堿法提取蛋白質，酸沉后水洗凍干，制成富硒米蛋白。富硒米蛋白經酶解、滅酶活后所得多肽凍干保存，即得本發明產品。本發明的富硒米肽在細胞實驗中，能拮抗鉛對細胞的毒性作用，明顯提高鉛中毒細胞的存活率和受試物的半數致死量(IC50值)。本發明所得的富硒米肽具有緩解鉛對細胞毒性的作用，制備方法簡單、易行，可應用于功能食品的研制和開發。
【專利說明】一種緩解鉛毒性的富砸米肽酶解制備方法
一、【技術領域】
[0001]本發明涉及富硒稻米深加工領域，尤其涉及一種緩解鉛毒性的富硒米肽的酶解制備方法，屬于保健食品開發領域。
二、【背景技術】
[0002]鉛是一種對動物和植物均具有嚴重毒害作用的重金屬元素，已被證明在進入人體后主要在骨骼、內臟、血液以及神經系統中蓄積，造成血鉛超標與鉛中毒，并可致癌與致突變，直接誘導細胞凋亡。水體、土壤、大氣以及糧農作物等極易受到鉛的污染，蓄積的鉛毒通過皮膚與消化道直接進入人體，經循環系統分布并沉積在人體內。由于代謝與排泄都極為緩慢，鉛對靶器官造成的損傷持續且不可逆轉。鉛中毒已成為最為嚴峻的重金屬危害之一。近年來重金屬鉛的致毒機制與鉛毒的預防和解除受到了醫學與營養健康領域的高度關注，尋找能夠驅鉛，拮抗鉛的毒性作用的功能食品是緩解鉛中毒的理想解決方案。
[0003]硒是一種人類和動物生長發育所必需的微量營養元素，具有調控生物體生殖、發育、代謝、免疫等過程的生物學機能，被譽為生物醫學領域的“奇效元素”。硒在生物活性成分中大多以硒代氨基酸，硒多肽以及硒蛋白的形式存在，其參與構成的25種硒酶與硒蛋白，與抗氧化、抗腫瘤、增強機體免疫力、預防心腦血管及地方性疾病，尤其是近年來頗受關注的減弱重金屬毒性等生物學功能密切相關。已有學者的研究證明，硒具有緩解重金屬中毒，拮抗鉛毒，促進排鉛的特殊生理功能。利用天然含硒產物深加工以制備緩解鉛對生物體的毒理作用具有現實性的研究價值。
[0004]富硒米蛋白具有營養價值豐富，過敏性低，生物活性明顯高于普通稻米蛋白等突出優勢，選用優質高值富硒農產品——富硒稻米為提取原料，是一種前景廣闊的富硒作物深加工產品。目前稻米蛋白的提取方法已經十分成熟，相較酶法與超聲輔助等方法，堿法提取因原材料損失少，蛋白得率高、提取成本低，工藝條件簡單可控而得到廣泛的應用。許多研究表明，將稻米蛋白酶解后得到的稻米多肽甚至小分子氨基酸殘基，其生物活性均高于未酶解的稻米蛋白。在生物學實驗中，普遍選用反應溫和、天然成分不受破壞的體外酶解條件制備稻米多肽。稻米蛋白酶解物抗氧化、抗衰老與預防疾病、免疫調節的作用已受到許多學者的關注，研究攜帶硒元素為活性中心的富硒米肽在生物醫學與營養保健領域具有重要的研究價值。
三、
【發明內容】

[0005]技術問題
[0006]本發明的目的是提供一種緩解鉛毒性的富硒米肽的酶解制備方法，對富硒稻米進行合理有效深加工，可應用于保健食品的研發。
[0007]技術方案
[0008]本發明的一種·緩解鉛毒性的富硒米肽是通過以下技術方案實現的:
[0009](I)原料預處理:選取新鮮富硒稻米為原料，磨成粉末后過80目篩；[0010](2)脫脂:將富硒米樣品按照料液比1: 4~1: 6配比后，借助磁力攪拌器(JB-5，金壇市精達儀器制造有限公司)浸提脫脂兩次，每次3~4h，4500g離心15min，收集沉淀，置于鼓風干燥箱(DHG-9030A，上海一恒科技有限公司)，35°C下，通風2h至干燥；
[0011](3)堿法提取蛋白質:將干燥后的富硒米粉按照料液比1: 15~1: 20與濃度為0.02~0.07mol / L的NaOH溶液配比后，攪拌均勻，設置溫度35~40°C，于恒溫振蕩器(SHA-B，金壇市榮華儀器制造有限公司)上恒溫震蕩提取2.5~3h，4500g離心15min，收集上清液，重復此法堿提2~3次，合并上清液；
[0012](4)酸沉:用0.01~0.02mol / L的HCl溶液調(3)中蛋白液pH至等電點(4.8)，待大量蛋白質沉淀析出后，4500g離心15min,收集沉淀；
[0013](5)水洗:將上述沉淀用去離子水按照料液比1: 10~1: 20洗滌后，4500g離心15min,棄去上清液,重復水洗2~3次；
[0014](6)凍干:將(5)所得富硒米蛋白分裝入培養皿，表面用保鮮膜包裹，在_20°C冰箱中預凍12~15h，取出放入冷凍干燥機(Lg-5A，上海離心機械研究所)24h，將所得富硒米蛋白保存于-4°C冰箱備用；
[0015](7)酶解:將(6)中所述富硒米蛋白制成底物濃度3%~5%的懸濁液，按照酶比底物濃度8%~12%加入胰蛋白酶，用0.05mol / LNaOH調節體系pH至8.0~9.0附近，置磁力攪拌器(JB-5，金壇市精達儀器制造有限公司)攪拌同時，控制溫度45~50°C水浴
3.5 ~4h ;
[0016](8)滅酶活:升溫至90~95°C，保持10~15min，將胰蛋白酶滅活；
[0017](9)凍干:待(8)所得富硒米肽懸濁液冷卻后分裝入培養皿，表面用保鮮膜包裹，在_20°C冰箱中預凍12~15h，取出放入冷凍干燥機(Lg-5A，上海離心機械研究所)24h，將所得富硒米肽產品保存于-4°C冰箱備用。
[0018]有益效果
[0019](I)本發明選取富硒稻米作為原材料，提取富硒稻米蛋白并進一步酶解，制備出能緩解鉛毒性的富硒米肽(制備工藝見圖1)，合理的利用了富硒碎米和富硒米糠等稻米加工副產物，避免農產品廢棄物的資源浪費。
[0020](2)本發明制備的富硒米肽比普通米肽的硒含量高，可作為硒缺乏地區以及缺硒人群的膳食補充劑和營養強化劑進行推廣。表1為富硒米肽與普通米肽的硒含量對比。
[0021]表1富硒米肽與普通米肽的硒含量
[0022]
【權利要求】
1.一種緩解鉛對小鼠巨噬細胞RAW264.7毒性的富硒米肽的酶解制備方法，其特征在于包括以下制備步驟和工藝條件: (1)原料預處理:選取新鮮富硒稻米為原料，磨成粉末后過80目篩； (2)脫脂:將富硒稻米樣品按照料液比1: 4~1: 6配比后，借助磁力攪拌器(JB-5，金壇市精達儀器制造有限公司)浸提脫脂兩次，每次3~4h，4500g離心15min，收集沉淀，置于電熱鼓風干燥箱(DHG-9030A，上海一恒科技有限公司)，35°C下通風2h至干燥； (3)堿法提取蛋白質:將干燥后的富硒米粉按照料液比1: 15~1: 20與濃度為0.02~0.07mol / L的NaOH溶液配比后，攪拌均勻，設置溫度35~40°C，于恒溫振蕩器(SHA-B，金壇市榮華儀器制造有限公司)上提取2.5~3h，4500g離心15min，收集上清液，重復此法堿提2~3次，合并上清液； (4)酸沉:用0.01~0.02mol / L的HCl溶液調(3)中蛋白液pH至等電點(4.8)，待大量蛋白質沉淀析出后，4500g離心15min,收集沉淀； (5)水洗:將上述沉淀用去離子水按照料液比1: 10~1: 20洗滌后，4500g離心15min,棄去上清液，重復水洗2~3次； (6)凍干:將(5)所得富硒米蛋白分裝入培養皿，表面用保鮮膜包裹，在_20°C冰箱中預凍12~15h，取出放入真空冷凍干燥機(Lg-5A，上海離心機械研究所)24h，將所得富硒米蛋白保存于_4°C冰箱備用； (7)酶解:將(6)中所述富硒米蛋白制成底物濃度3%~5%的懸濁液，按照酶比底物濃度8%~12%加入胰蛋白酶，用0.05mol / LNaOH調節體系pH至8.0~9.0附近，置磁力攪拌器(JB-5，金壇市精達儀`器制造有限公司)攪拌的同時，控制溫度45~50°C水浴3.5~4h ； (8)滅酶活:升溫至90~95°C，保持10~15min，將胰蛋白酶滅活； (9)凍干:待⑶所得富硒米肽懸濁液冷卻后分裝入培養皿，表面用保鮮膜包裹，在_20°C冰箱中預凍12~15h，取出放入冷凍干燥機(Lg-5A，上海離心機械研究所)24h，將所得富硒米肽產品保存于-4°C冰箱備用。
2.根據權利要求1所述的富硒米肽的制備方法，其特征在于(3)堿法提取蛋白質:將脫脂后的富硒大米用0.02~0.07mol / L的NaOH溶液，按照料液比1: 15~1: 20均勻混合后，35~40°C震蕩提取2.5~3h。
3.根據權利要求1所述的富硒米肽的制備方法，其特征在于⑷酸沉:0.01~0.02mol / L的稀HCl調節富硒米蛋白懸濁液至等電點(4.5~5.5)，待有大量蛋白質沉淀析出后，4500g離心15min,收集沉淀。
4.根據權利要求1所述的富硒米肽的制備方法，其特征在于(7)酶解:用胰蛋白酶對底物濃度3 %~5 %的富硒米蛋白懸濁液，按照酶比底物濃度8 %~12 %進行酶解，0.05mol / LNaOH調節體系pH至8.0~9.0附近，磁力攪拌的同時，控制溫度45~50°C水浴3.5~4h。
5.根據權利要求1所述的制備方法，獲得的具有緩解鉛對細胞毒性作用的富硒米肽產品O
6.一種緩解鉛對細胞毒性的方法，其特征在于:以一定濃度按照權利要求1方法提取的富硒米肽作為拮抗添加物加入細胞DMEM培養基中，緩解和拮抗濃度范圍在5~..1600 μ mo / L的重金屬鉛(PbCl2)對于小鼠巨噬細胞RAW264.7的毒害作用；
7.根據權利要求6所述的緩解鉛對細胞毒性的方法，其特征在于:所述富硒酶解肽的濃度在80~100mg/L之間，既能很好地緩解5~1600 μ mol / L濃度范圍內鉛(PbCl2)對細胞的毒性作用，又符合在大米硒肽對細胞的安全作用濃度范圍(10~UOyg / L)。
【文檔編號】C07K1/30GK103667409SQ201410003832
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2014年1月6日 優先權日:2014年1月6日
【發明者】方勇, 陳悅, 胡秋輝, 陳曦, 許姿, 邱偉芬, 徐衛東, 徐迅, 楊文建, 馬寧, 鞠興榮 申請人:南京財經大學