用于治療糖尿病的ctla4融合蛋白的制作方法

用于治療糖尿病的ctla4融合蛋白的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種治療、預防或延遲1型糖尿病自身免疫性進展的方法，所述方法通過施用有效量的細胞毒性T淋巴細胞相關聯抗原4(CTLA4)分子來實現。CTLA4分子可為CTLA4細胞外區與免疫球蛋白的融合蛋白，如阿巴西普。
【專利說明】用于治療糖尿病的CTLA4融合蛋白 發明領域
[0001] 本發明總體上涉及自身免疫疾病領域，并且尤其涉及治療、預防或延遲1型糖尿 病進展。

【背景技術】
[0002] 最常見形式的1型糖尿病（TlDM)是免疫介導的疾病，其中胰島素分泌β細胞遭 自身免疫應答破壞。存在與疾病發作相關聯的許多遺傳和環境因素，所述疾病涉及含有特 異性靶向胰島素分泌β細胞的免疫細胞的胰島的逐漸炎性浸潤。這種病變在未確定的一 段時間（數月至數年）內發展。雖然胰島素的發現允許治療T1DM，但是當前沒有治愈方法。 最常見形式的1型糖尿病是免疫介導的，其中胰島素產生β細胞遭破壞。然而，在診斷時， 大多數患者仍然具有可觀量的胰島素產生。殘留β細胞功能的保存是非常需要的，因為它 可減少疾病的短期和長期并發癥。
[0003] 已經進行了數次臨床試驗來試圖用免疫調節劑或基于抗原的治療阻止1型糖尿 病的自身免疫性。最值得注意的是，抗CD3、抗CD20和GAD-65抗原疫苗的試驗已在保存β 細胞功能方面展示一些功效，如由刺激C肽分泌得以證明。T細胞在與1型糖尿病相關聯的 自身免疫性方面發揮核心作用。
[0004] 然而，需要的是用于1型糖尿病的另外新療法，它們能夠停止或減慢自身免疫性 β細胞破壞，引起β細胞功能和C肽分泌的保存，尤其適于新近診斷為患有1型糖尿病的 患者中。


【發明內容】

[0005] 根據本發明的某些實施方案涉及治療受試者的糖尿病的方法，所述方法包括施用 有效量的融合蛋白組合物，所述融合蛋白組合物包含T細胞共刺激拮抗劑和免疫球蛋白分 子的一部分。
[0006] 在一些實施方案中，T細胞共刺激拮抗劑包括CTLA4的細胞外結構域、細胞外結構 域的有效片段或細胞外結構域的免疫活性變體。T細胞共刺激拮抗劑可結合B細胞或其它 抗原呈遞細胞（APC)上表達的Β7抗原。在一些實施方案中，Β7抗原在B細胞和APC上表 達。
[0007] 在一些實施方案中，融合蛋白是阿巴西普（Abatacept)。在一些實施方案中，組合 物進一步包含油基載體，如油包水乳液（例如，IFA或Montamide ISA)。組合物可通過靜脈 內輸注來施用，如在約50ml至200ml生理鹽水中，或以在約5mg/kg至約50mg/kg范圍變化 的劑量，或以在約250mg至2000mg范圍變化的劑量，或以500mg、750mg或IOOOmg的劑量來 施用。
[0008] 如本文描述的方法還可包括確定隨著時間推移在從受試者獲取的血液樣品中C 肽的水平，所述水平是在抑制自身攻擊性T細胞的活化方面作為治療有效性的指示物。在 一些實施方案中，組合物在抑制自身攻擊性T細胞的活化中的有效性是通過以下來指示： 如與標準相比，維持C肽產生或延遲C肽產生的減少，或如與標準相比，改善的HbAlc或所 述受試者使用的胰島素減少。這類測量可離體進行，如通過分析血液樣品來進行。所述受 試者中C肽產生的減少可被延遲至少3、6、9、12或18個月，或2、3、4年或更多年。
[0009] 在一些實施方案中，優選患者群體得到治療。舉例來說，選自具有統計學上較大應 答率的群體的患者，如白人患者得到治療。
[0010] 本發明提供的一些實施方案提供預防冒有糖尿病風險的受試者的糖尿病發作的 方法，所述方法包括施用有效量的融合蛋白組合物，所述融合蛋白組合物包含T細胞共刺 激拮抗劑和免疫球蛋白分子的一部分。本文提供的一些實施方案提供延遲冒有糖尿病風險 的受試者的糖尿病發作至少3個月、6個月、9個月、12個月或18個月，或2年、3年、4年或 更多年的方法，所述方法通過施用有效量的融合蛋白組合物來實現，所述融合蛋白組合物 來包含T細胞共刺激拮抗劑和免疫球蛋白分子的一部分。
[0011] 本發明闡明并描述了如將會顯而易知的實施方案的這些和其它特征。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 下文參考例如后附的附圖來提供各種實施方案的詳述。本領域的技術人員將理解 的是，以下所描述的附圖僅是出于說明的目的。附圖不意圖以任何方式限制 申請人:教導的 范圍。
[0013] 圖1是每個治療組的隨著時間推移的刺激C肽2-h AUC平均值的群體平均值。估計 值來自針對年齡、性別、C肽的基線值和治療分配來調整的ANCOVA模型。Y軸是在log(y+l) 標度上。誤差條展示95%置信區間（Cl)。AUC=曲線下面積。
[0014] 圖2是每個治療組的隨著時間推移的刺激C肽2-h AUC平均值的預測群體平均值。 估計值來自混合效果模型的分析，所述模型針對年齡、性別、C肽的基線值和治療分配來調 整，并且包括在l〇g(y+l)標度上作為直線的時間的固定效果。AUC=曲線下面積。
[0015] 圖3是每個治療組的隨著時間推移的2-h峰C肽保持等于或高于0 · 2nmol/L的 參與者的比例。
[0016] 圖4A和圖4B是每個治療組的隨著時間推移的㈧HbAlc和⑶胰島素使用的群 體平均值。估計值來自針對年齡、性別、HbAlc的基線值和治療分配來調整的ANCOVA模型。 胰島素使用是按3個月時間間隔以每kg體重來使用。誤差條展示95% Cl。HbAlc是糖基 化血紅蛋白Ale。
[0017] 圖5是在預先指定的基線因子類別內對于2年刺激C肽AUC平均值的治療效果的 比率（阿巴西普相比于安慰劑）。估計值來自針對年齡、性別、C肽的基線值、所指示的分類 因子、治療分配和治療相互作用項來調整的C肽的ANCOVA建模對數。治療效果的同質性測 試對于DR3等位基因狀態（p = 0 ·025)和種族（p = 0 ·0003)是顯著的。AUC =曲線下面 積。HbAlc =糖基化血紅蛋白Ale。
[0018] 應了解，附圖只是示例性的并且對附圖的所有參考只出于說明目的，并且不希望 以任何方式限制以下本文描述的實施方案的范圍。

【具體實施方式】
[0019] 已經發現CTLA4分子可用于治療、預防或延遲受試者的1型糖尿病（TlDM)的進 展。
[0020] 殘留β細胞功能（如通過峰C肽彡0*2nmol/L所測量）的保存是非常需要的， 因為它可減少疾病的短期和長期并發癥。已經進行了數次臨床試驗來試圖用免疫調節劑或 基于抗原的治療阻止1型糖尿病中的自身免疫性。最顯著地，抗⑶3、抗⑶20和GAD-65抗 原疫苗的試驗已在保存β細胞功能方面展示一些功效，如由刺激C肽分泌得以證明。C肽 是在體內與胰島素一起產生的蛋白質。在健康胰腺中，前胰島素原與A鏈、C肽、B鏈和信號 序列一起分泌。將信號序列截止，留下胰島素原。然后C肽被切斷，留下A鏈和B鏈以形成 胰島素。由于C肽和胰島素以等摩爾量存在，因此它是胰島素產生和胰腺β細胞健康的非 常可靠標記物。
[0021] T細胞在與1型糖尿病相關聯的自身免疫性中發揮核心作用。為了變得完全活化 并且具有自身攻擊性，據信T細胞需要至少兩個關鍵信號。（Marelli-Berg FM, Okkenhaug K，Mirenda V. A Trends Immunol 2007;28:267-73。）第一信號是抗原呈遞細胞上的MHC分 子的凹槽中的抗原與T細胞受體（TCR)之間的相互作用。最重要的第二信號是抗原呈遞細 胞（APC)上的⑶80和⑶86與T細胞上的⑶28之間的相互作用。這種共刺激第二信號是細 胞的完全活化所需要的，并且沒有它T細胞不會變得具有功能性。因此，已提出將共刺激阻 斷作為自身免疫性和移植的治療手段。（Bluestone JA，St Clair EW，Turka LA. Immunity 2006;24:233-38。）
[0022] 細胞毒性T淋巴細胞相關聯抗原4 (CTLA4)，也稱為⑶152,是涉及免疫系統的調控 的蛋白質。天然存在的CTLA4描述于美國專利號5, 434, 131、5, 844, 095和5, 851，795中。 天然CTLA4蛋白質由CTLA4基因編碼。CTLA4是細胞表面蛋白，其具有N端細胞外結構域、 跨膜結構域和C端胞質結構域。細胞外結構域結合至且/或干擾靶抗原，如CD80和CD86， 充當性質T細胞刺激的天然破壞。在一些實施方案中，CTLA4分子的細胞外結構域開始于 位置+1處的甲硫氨酸并且結束于位置+124處的天冬氨酸；在其它實施方案中，細胞外結構 域開始于位置-1處的丙氨酸并且結束于位置+124處的天冬氨酸。
[0023] CTLA4分子是包括細胞毒性T淋巴細胞相關聯抗原4(CTLA4)細胞外結構域的分 子。在一些實施方案中，CTLA4的細胞外結構域包括CTLA4蛋白質的一部分，所述部分識 別并結合至至少一種B7(⑶80/86)抗原，如B細胞和APC上表達的B7抗原。細胞外結構 域還可包括CTLA4的結合B7抗原的片段或衍生物。CTLA4細胞外結構域還可識別并結合 CD80(B7-1)和/或CD86(B7-2)。細胞外結構域還可包括CTLA4的結合CD80和/或CD86 的片段或衍生物。
[0024] CTLA4分子可為融合蛋白，其中融合蛋白定義為使用本領域中熟知的方法連接在 一起的一個或多個氨基酸序列。連接的氨基酸序列從而形成一種融合蛋白。在一些實施方 案中，CTLA4分子含有免疫球蛋白的至少一部分，如免疫球蛋白的Fc部分。在一些實施方 案中，CTLA4分子是分離和純化的CTLA4分子。
[0025] 在一些實施方案中，CTLA4分子是含有免疫球蛋白的至少一部分，如免疫球蛋白的 Fc部分的蛋白質。在一些實施方案中，CTLA4分子是分離和純化的CTLA4分子。
[0026] 在一個優選實施方案中，CTLA4分子是阿巴西普。阿巴西普是可溶性融合蛋白，其 由連接至人免疫球蛋白Gl (IgGl)的修飾Fc (鉸鏈、CH2和CH3結構域）部分的人CTLA-4的 細胞外結構域組成。阿巴西普通過重組DNA技術在哺乳動物細胞表達系統中產生。阿巴西 普的表觀分子量是92千道爾頓。
[0027] 阿巴西普被開發用于成人類風濕性關節炎和幼年特發性關節炎，并且被指出可用 于減少病征和癥狀、誘導主要臨床反應、抑制結構破壞的進展，并且改善患有中度至重度活 動性類風濕性關節炎的成人患者的身體功能。
[0028] 阿巴西普由Bristol-Myers Squibb開發并且公開于例如美國專利5, 851，795、美 國專利7, 455, 835和美國專利公布20011/311529中。阿巴西普的商品名為0RENCIA，它可用 作單一療法，或與不同于腫瘤壞死因子（TNF)拮抗劑的疾病緩解抗風濕性藥物（DMRD)同 時使用。阿巴西普還被指示可用于減少患有中度至重度活動性多關節幼年特發性關節炎的 6歲和年齡更大的兒科患者的病征和癥狀。阿巴西普可用作單一療法或與甲氨蝶呤（MTX) 同時使用。由于阿巴西普是選擇性共刺激調節劑并且抑制T細胞的共刺激，它不應與TNF 拮抗劑同時施用。
[0029] 阿巴西普選擇性結合至⑶80和⑶86,從而阻斷與⑶28的相互作用并且干擾T細 胞活化。它抑制初始T細胞活化，因而具有選擇性抑制特定抗原的T細胞應答的潛力而非 廣泛免疫抑制。效應記憶T細胞應答較少取決于CD28共刺激并且據推測較少通過共刺激 阻斷來抑制。（Lo DJ, Weaver TA, Stempora L,等人 Am J Transplant 2011 ;11:22_ 33。）
[0030] 動物和人類中的研究已經展示共刺激第二信號的干擾有利地影響自身免疫性。使 用阿巴西普的共刺激阻斷已被證明在牛皮癬（Abrams JR, Lebwohl MG, Guzzo CA,等人J Clin Invest 1999;103:1243 - 52)和牛皮癬性關節炎（Mease P, Genovese MC, Gladstein G,等人Arthritis Rheum2011 ;63:939 - 48)中具有臨床有效性，并且被批準用于治療包括 幼年類風濕性關節炎的類風濕性關節炎，Genant HK, Peterfy CG, Westhovens R,等人Ann Rheum Dis 2008;67:1084 - 89)。（Ruperto N, Lovell DJ, Quartier P,等人Lancet 2008; 372:383 - 91。）另外，共刺激阻斷可有效控制同種異體移植物排斥。（Vincenti F, Larsen C，Durrbach A.N Engl J Med 2〇〇5;353:77〇_81。）此外，Lenschow 和同事（Lenschow DJ，Ho SC, Sattar H，等人 J Exp Med 1995;181:1145 - 55)證明使用抗 B7-2 單克隆抗體 和CTLA4 -免疫球蛋白融合蛋白兩者的共刺激阻斷可在10周齡之前施用時預防NOD小鼠 模型的糖尿病。
[0031] 現在已經展示使用如CTLA-4組合物并且尤其阿巴西普的T細胞共刺激拮抗劑 的共刺激調節可通過阻斷自身攻擊性T細胞的產生來在新近診斷患有1型糖尿病的患者 中阻止或減緩自身免疫性β細胞破壞，導致保持C肽分泌（Orban等人，Lancet 2011 ; 378(9789):412-9。）
[0032] 因此，本文提供通過施用CTLA4分子來治療、預防糖尿病或延緩糖尿病進展的方 法。本發明方法可預防或延遲糖尿病發作，或預防或延遲殘留β細胞團塊的損失，提供更 長緩解期并且在生命后期延緩糖尿病相關并發癥的發作。
[0033] TlDM可通過如本文描述的方法來治療。治療可針對具有殘留β細胞功能的受試 者以及不再具有任何β細胞功能的受試者。治療還被可建議來用于經由移植或注射或其 它β細胞替換手段（如胚胎或其它干細胞療法或其它替換模式）提供外源性β細胞的受 試者。
[0034] 可在受試者中通過首先選擇易患糖尿病的受試者并施用如本文描述的CTLA4 分子來預防T1DM。易患糖尿病的受試者可通過GAD65自身抗體（GAA)、ICA512自身抗 體（ICA512AA)或抗胰島素自身抗體（IAA)中的一個或多個的表達來選擇。這些自身抗 體中的每一種與進展至自身免疫性1型糖尿病的風險相關聯。GAD65自身抗體（GAA)、 ICA512自身抗體（ICA512AA)或抗胰島素自身抗體（IAA)中的兩個或更多個的表達與 進展至自身免疫性1型糖尿病的高風險相關聯。（Liping Yu等人，Diabetes August 2001νο1· 50ηο· 81735-1740 ;Verge CF 等人，Diabetes 45:926 - 933, 199 ;Verge CR 等 人，Diabetes 47:1857 - 1866,1998;和 Bingley PJ,等人，Diabetes 43:1304 -1310, 1994)。
[0035] TlDM的發作可通過如本文描述的方法來延遲，以使得受試者不需要胰島素歷時更 長時間。替代地或另外地，本發明方法在已患糖尿病受試者中可延長"蜜月期"。蜜月期是 其中胰島素通過胰腺分泌，從而引起高血糖水平減退，并且由于對胰島素注射和治療的反 應而產生正常或接近正常的葡萄糖水平的時期。
[0036] 如本文描述的CTLA4分子可與藥學上可接受的載體組合施用并且以藥物組合物 形式施用。術語"藥學上可接受的載體"根據所需具體劑型包括任何和所有溶劑、稀釋劑 或其它液體媒介物、分散或混懸助劑、表面活性劑、等滲劑、增稠或乳化劑、防腐劑、固體粘 合劑、潤滑劑等。Remington's Pharmaceutical-Sciences,第 16 版，E. W. Martin (Mack Publishing Co. ,Easton, Pa.，1980)公開用于配制藥物組合物的各種載體和其已知制備技 術。除了如通過產生任何不希望的生物作用或另外以有害的方式與藥物組合物的任何其它 組分相互作用而與物質或其衍生物不相容的任何常規載體介質以外，所述載體的使用被涵 蓋在本發明的范圍內。可充當藥學上可接受的載體的材料的一些實例是糖諸如乳糖、葡萄 糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；纖維素和其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基 纖維素和乙酸纖維素；粉狀黃蓍膠；麥芽；明膠；滑石粉；賦形劑，如椰子油和栓劑蠟；油， 如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；二醇，如丙二醇；酯，如油酸 乙酯和月桂酸乙酯；瓊脂；緩沖劑，如氫氧化鎂和氫氧化鋁；海藻酸；無熱原水；等滲鹽水； 林格氏溶液；乙醇，和磷酸鹽緩沖溶液，以及其它無毒相容潤滑劑，如月桂基硫酸鈉和硬脂 酸鎂，以及著色劑、釋放劑、包衣劑、甜味劑、調味劑和芳香劑、防腐劑和抗氧化劑也可根據 配方配制人員的判斷而存在于組合物中。
[0037] 包括藥學上可接受的載體的本文描述的化合物可使用多種途徑或施用模式來遞 送至患者。適合施用途徑包括但不限于吸入、經皮、口服、直腸、經粘膜、腸道和腸胃外施用， 包括肌肉內、皮下和靜脈內注射。
[0038] 如本文描述的組合物可與佐劑一起施用。術語"佐劑"可為單獨施用時缺乏顯著活 性但是可增強另一種治療劑的活性的化合物。在一些實施方案中，佐劑選自由以下組成的 組：緩沖劑、抗微生物防腐劑、表面活性劑、抗氧化劑、滋養調節劑、抗菌劑、增稠劑和粘度改 良劑。在一些實施方案中，佐劑是IFA，或其它油基佐劑以30-70%之間，優選地40-60%之 間，更優選地45-55%之間的重量比例（w/w)存在。在一些實施方案中，CTLA4和IFA或其 它油基佐劑以約50/50重量比率存在。在一些實施方案中，藥物組合物不含污染物，例如， 熱原。
[0039] 對于口服施用，化合物可容易通過將CTLA4分子與本領域中熟知的一種或多種藥 學上可接受的載體組合來配制。這類載體使得本發明的化合物可配制為片劑、丸劑、糖錠 齊U、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液、混懸液等，以供所治療的患者口服攝入。用于口服的藥物 制劑可通過以下獲得：添加固體賦形劑，任選地研磨所得混合物，并且（如果需要的話）在 添加適合的助劑之后，加工顆粒混合物以獲得片劑或糖錠劑核心。適合的賦形劑尤其是填 充劑，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纖維素制劑，例如像玉米淀粉、小麥淀粉、米 淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、黃芪膠、甲基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/ 或聚乙烯吡咯烷酮（PVP)。如果需要，可以添加崩解劑，如交聯聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或海藻 酸或其鹽，如海藻酸鈉。
[0040] 化合物可被配制用于通過注射進行腸胃外施用，例如，通過彈丸式注射（bolus injection)或持續輸注施用。注射是施用本發明組合物的優選方法。用于注射的制劑可與 添加的防腐劑一起以單位劑型提供在例如安瓿中或在多劑量容器中。組合物可采用油性或 水性媒介物中的混懸液、溶液或乳液的這類形式，并且可含有配制劑，如可添加混懸、穩定 和/或分散劑，如交聯聚乙烯基吡咯烷酮、瓊脂或海藻酸或其鹽，如海藻酸鈉。因此，在一些 實施方案中，組合物可為油包水乳液。在其它實施方案中，組合物可為水包油乳液。這類水 包油乳液可尤其適用于控制釋放特征并且提供活性藥物的緩慢釋放，從而可潛在地在這類 乳液不受改變的情況下被吸收。
[0041] 用于腸胃外施用的藥物制劑包括呈水溶性形式的活性化合物的水溶液。此外，活 性化合物的混懸液可以制備為適當的油性注射混懸液。適合親脂性溶劑或媒介物包括脂肪 油（如芝麻油）或合成脂肪酸酯（如油酸乙酯或三酸甘油酯）或脂質體。水性注射混懸液 可含有增加混懸液粘度的物質，如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或葡聚糖。任選地，所述混懸 液也可以含有適合的穩定劑，或增加化合物溶解度以允許制備高濃度溶液的試劑。對注射 來說，本發明的藥物組合物可在水溶液，優選生理相容緩沖液（如漢克斯溶液、林格氏溶液 或生理緩沖鹽水）中配制。或者，活性成分可呈粉末形式，以用于在使用前利用適合的媒介 物（例如，無菌無熱原水）來構建。
[0042] 在一些實施方案中，包含CTLA4分子的組合物也包括油基載體。
[0043] 油基載體是包括至少10重量％的適合于結合治療劑來施用至人的天然或合成油 的組合物。在優選實施方案中，載體包括至少20、30、50、70、80、90、95、98或99重量％的油。 在一些實施方案中，油基載體可包括小于70、60、50、40、30或20重量％的油。在優選實施 方案中，油在10重量％至95重量％范圍內，優選地20重量％至90重量％或30重量％至 70重量％的油。油應被選擇來使得在施用至受試者時，它提供分散于其中的物質的持續釋 放。適合油包括礦物油（例如，Drakeol 6VR輕質礦物油）、植物油、角鯊烯或液體石蠟。在 一些實施方案中，油基載體可含有一種以上類型油。在一些實施方案中，油基載體可包括免 疫刺激劑，例如，免疫刺激葡聚糖，但是優選得多的是油基載體不包括免疫刺激劑，例如，免 疫刺激葡聚糖、細菌組分，例如，分枝桿菌組分。在一個優選實施方案中，油基載體不包括明 礬組分。
[0044] 雖然不希望受理論約束，據信油基載體通過觸發與炎癥以及防護能力相關的免疫 活性細胞來起作用。油基載體也可充當抗原媒介物和緩慢釋放或長期抗原呈遞裝置。當注 入受試者時，油基載體和抗原組合物可在注射位點形成抗原積存物，從而防止抗原降解。抗 原可從此積存物釋放緩慢至系統，并且提供長效的抗原呈遞以及擴大的總接觸表面面積并 吸引炎性細胞。巨噬細胞可消化大多數并入的材料并且在其表面上呈遞經過加工的抗原。 抗原可從此積存物釋放緩慢至系統中并且提供長效的抗原供應來充當共刺激調節劑。
[0045] 油基載體任選地包括乳化劑或表面活性劑組分。乳化劑或表面活性劑（和乳化劑 或表面活性劑的量）經過選擇以使得它促進物質（例如，抗原制劑）與油的混合或分散。油 基載體可包括0. 1重量％至50重量％，優選地1重量％至30重量％，更優選地5重量％至 20重量％的表面活性劑或乳化劑。乳化劑或表面活性劑的實例包括Arlacel A、二縮甘露 醇油酸酯（例如，Montamide 80-二縮甘露醇單油酸酯）、無水甘露糖醇/油酸酯、聚氧乙烯 或聚氧丙烯。
[0046] 油基載體或佐劑通常由與水混合的兩種組分：（1)油和（2)乳化劑或表面活性劑 所組成。適合油和乳化劑在本領域中為已知的。舉例來說，油可為礦物油、植物油、角鯊烯 或液體石蠟。乳化劑或表面活性劑可為，例如，Arlacel A、二縮甘露醇油酸酯、無水甘露糖 醇/油酸酯、聚氧乙烯或聚氧丙烯。示例性油基佐劑包括常規IFA、Montamide ISA佐劑或 亨特氏TiterMax佐劑。在優選實施方案中，佐劑包括20重量％至95重量％，優選地30 重量％至90重量％，更優選地40重量％至70重量％的油相，和0. 1重量％至50重量％, 優選地1重量％至30重量％ ,更優選地5重量％至20重量％的表面活性劑或乳化劑。各 種類型的油基佐劑描述于例如美國專利號5, 814, 321、美國專利號6, 299, 884、美國專利號 6, 235, 282和美國專利號5, 976, 538中。
[0047] IFA通常是非代謝油（例如，礦物油）、水和表面活性劑（例如，Arlacel A)的 混合物。不同于完全弗氏佐劑（CFA)，IFA不含有細菌組分，例如，分枝桿菌。在人中使 用IFA的第一次大規模接種疫苗發生于美國軍事人員（Davenport(1968)Ann Allergy 26:288-292 ;Beebe 等人，（1972)Am J Epidemiol 95:337-346 ;Salk&Salk(1977)Science 195:834-847)。關于惡性腫瘤、過敏疾病和膠原病的結果基本上是陰性的，但是有證據表明 一些人在接種位點具有囊胞樣反應。隨訪研究證明這些不良事件是歸因于化合物的不正 確施用，即它皮下而非肌肉內給藥。根據這些實驗，IFA被一些人視為不適合于人使用，但 是它仍然廣泛用于動物研究。最近幾年中，新形式的IFA證明對于HIV免疫療法或治療接 種疫苗的人的使用是安全的（Turner等人（1994)AIDS 8:1429-1435 ;Trauger等人（1995) J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol 10Supp2: S74-82 ;Trauger 等人（1994) J Infect Dis 169:1256-1264)。
[0048] Montanide ISA佐劑（Seppic, Paris, France)是一組基于油/表面活性劑的佐劑， 其中不同表面活性劑與非代謝礦物油、代謝油或兩者的混合物組合。這些佐劑被制備來用 作與Ag水溶液的乳液。Montanide ISA50 (ISA =不完全S印pic佐劑）的表面活性劑是二 縮甘露醇油酸酯，即弗氏佐劑中的表面活性劑的主要部分。Montanide組的表面活性劑經 歷嚴格的質量控制以防止可導致過度炎癥的任何物質的污染，如已在用于弗氏佐劑中的一 些Arlacel A批料中發現所述污染。各種Montanide ISA組的佐劑用作油包水乳液、水包 油乳液或水包油包水乳液。由于表面活性劑和油組合的變化，不同佐劑適應不同水相/油 相比率。
[0049] 亨特氏TiterMax (CytRx Corp.，Norcross, Ga.)是以類似于用于常規弗氏佐劑 的方式制備為油包水乳液的基于油/表面活性劑的佐劑。然而，它使用代謝油（角鯊烯） 和具有良好蛋白質抗原結合能力以及輔助活性的非離子表面活性劑。輔助活性可部分地 涉及表面活性劑的活化補體并且結合補體組分的能力，因為此有助于將Ag靶向輸送至脾 和淋巴節中的濾泡樹突狀細胞。用于可購得佐劑中的表面活性劑是由Hunter(Hunter等 人，1991Vaccine 9:250-256)開發的聚氧乙烯與聚氧丙烯的許多合成非離子嵌段共聚物 中的一種。利用共聚物包衣的微粒來使乳液穩定允許形成具有小于20%油的穩定乳液，這 是最小化所注射的總佐劑的重要因素。
[0050] 佐劑可與抗原一起使用以引出細胞介導免疫力和產生抗體保護性同種型（在小 鼠中為IgG2a并且在靈長類中為IgGl)。不同類型的佐劑共有類似副作用，如注射位點的反 應和致熱性。明礬是一種用于人疫苗的常用佐劑，它也在注射位點產生可觀的肉芽腫反應 (Allison&Byars(1991)Mol Immunol 28:279-284)。不完全弗氏佐劑的作用模式可涉及非 特異性以及特異性免疫應答。IFA似乎通過觸發與炎癥以及保護能力相關的免疫活性細胞 來起作用。IFA也充當抗原媒介物和緩慢釋放或長期抗原呈遞裝置。將IFA和抗原化合物 注入患者，它在注射位點形成抗原積存物，從而防止抗原降解。抗原從此積存物釋放緩慢至 系統，并且提供長效的抗原呈遞以及擴大的總接觸表面面積并吸引炎性細胞。巨噬細胞消 化大多數并入的材料并且在其表面上呈遞經過加工的抗原。抗原可從此積存物釋放緩慢至 系統并且提供長效的抗原供應來充當共刺激調節劑。
[0051] 已發現IFA對于抗原免疫原性的特異性增強效果產生增加的體液免疫（優選保護 性抗體產生；在人中為IgGl并且在小鼠中為IgG2a)并且引起特異性細胞介導免疫（優選 Th2類型）。具體來說，作為一個實例，IFA中的人重組胰島素 B鏈在NOD小鼠胰島中產生 Th2細胞因子模式（Ramiya等人（1996) J Autoimmun 9:349-356)。IFA在動物模型中對經 過糖尿病預防試驗的佐劑是獨特的。Ramiya和同事（同上文）得出的結論是：明礬和DPT 兩者作為佐劑具有與所使用的抗原不相關的"非特異性"保護效果，而IFA是具有用于動物 中糖尿病預防的抗原特異性保護效果的唯一佐劑。
[0052] IFA，優選被批準用于人的 IFA，例如，Montanide (例如，Montanide ISA51, Seppic Inc. ,France)或等效組合物，是用于本文描述的方法和疫苗的優選佐劑。Montanide ISA51 在我們的動物研究和我們的人研究中沒有展示全身或顯著局部副作用。
[0053] 對于口服施用，化合物可容易通過將活性化合物與本領域中熟知的藥學上可接受 的載體組合來配制。這類載體使得本發明的化合物可配制為片劑、丸劑、糖錠劑、膠囊、液 體、凝膠、糖漿、漿液、混懸液等，以供所治療的患者口服攝入。用于口服的藥物制劑可通過 以下獲得：添加固體賦形劑，任選地研磨所得混合物，并且（如果需要的話）在添加適合的 助劑之后，加工顆粒混合物以獲得片劑或糖錠劑核心。適合的賦形劑尤其是填充劑，如糖， 包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纖維素制劑，例如像玉米淀粉、小麥淀粉、米淀粉、馬鈴薯 淀粉、明膠、黃芪膠、甲基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯 烷酮（PVP)。如果需要，可以添加崩解劑，如交聯聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或海藻酸或其鹽，如 海藻酸鈉。
[0054] 化合物可被配制用于通過注射進行腸胃外施用，例如，通過彈丸式注射或持續輸 注施用。注射是施用本發明組合物的優選方法。用于注射的制劑可與添加的防腐劑一起以 單位劑型提供例如在安瓿中或在多劑量容器中。組合物可采用油性或水性媒介物中的混懸 液、溶液或乳液的這類形式，并且可含有配制劑，如可添加混懸、穩定和/或分散劑，如交聯 聚乙烯基吡咯烷酮、瓊脂或海藻酸或其鹽，如海藻酸鈉。
[0055] 用于腸胃外施用的藥物制劑包括呈水溶性形式的活性化合物的水溶液。此外，活 性化合物的混懸液可以制備為適當的油性注射混懸液。適合親脂性溶劑或媒介物包括脂肪 油（如芝麻油）或合成脂肪酸酯（如油酸乙酯或三酸甘油酯）或脂質體。水性注射混懸液 可含有增加混懸液粘度的物質，如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或葡聚糖。任選地，所述混懸 液也可以含有適合的穩定劑，或增加化合物溶解度以允許制備高濃度溶液的試劑。對注射 來說，本發明的藥物組合物可在水溶液，優選生理相容緩沖液（諸如漢克斯溶液、林格氏溶 液或生理緩沖鹽水）中配制。或者，活性成分可呈粉末形式，以用于在使用前利用適合的媒 介物（例如，無菌無熱原水）構建。
[0056] 提供至受試者的CTLA4分子的組合的量取決于受試者體型和體重以及疾病進展。 對于本文描述的化合物，治療有效量可最初在體外測定中確定。由于本發明化合物可具有 低吸收和低生物利用率，因此治療有效量可根據例如化合物或其代謝物的血液水平，或化 合物或其代謝物的糞便濃度來確定。如本領域中熟知的，用于人的治療有效量也可根據動 物模型來確定。治療有效劑量也可從已知展現類似藥理學活性的化合物的人數據來確定。 施加劑量可基于與已知化合物比較施用化合物的相對效力來調節。
[0057] 腸胃外施用本文描述的化合物的患者劑量通常在約Img/天至約10, OOOmg/天范 圍內，更通常約IOmg/天至約1，OOOmg/天，并且最通常約50mg/天至約500mg/天。就患者 體重而言，典型劑量在約〇· 01至約150mg/kg/天范圍內，更通常約0· 1至約15mg/kg/天， 并且最通常約1至約l〇mg/kg/天，例如5mg/kg/天或3mg/kg/天。
[0058] CTLA4分子可以單一每日劑量施用或它可每天多次施用。或者，它可每天小于一 次施用。給藥可在一段時間內，如每月或每28天一次。在一些實施方案中，可在開始治療 時給與其它劑量（例如，彈丸式給藥）。在一些實施方案中，劑量含有大約5、10、20、30、50、 100mg/kg 的 CTLA4 分子。
[0059] 本文使用的術語的定義意圖并入在化學和藥物領域中關于每個術語公認的當前 技術現狀定義。在適當情況下，提供例證。定義適用于在整個本說明書中使用的術語，除非 在具體情況中單獨地或作為較大組的一部分另外加以限制。
[0060] 如本文使用，術語"施用"意圖包括直接和間接地將化合物遞送至它的預期作用位 點的所有手段。
[0061] 如本文在延遲糖尿病進展的情形中使用的短語"延遲進展"意指在1型糖尿病的 臨床發作之后功能性殘留β細胞團塊的損失被延遲。TlDM的延遲進展可例如通過測量C 肽產生來測量。
[0062] 短語"藥學上可接受的"是指在施用至如哺乳動物（例如，人）的動物時生理上 可耐受并且通常不產生過敏或類似不利反應（如胃不適、眩暈等）的添加劑或組合物。術 語"藥學上可接受的載體"根據所需具體劑型包括任何和所有溶劑、稀釋劑或其它液體媒 介物、分散或混懸助劑、表面活性劑、等滲劑、增稠或乳化劑、防腐劑、固體粘合劑、潤滑劑 等。Remington's, The Science and Practice of Pharmacy, (Gennaro, A. R.編，第 19 版，1995, Mack Pub. Co.)公開用于配制藥物組合物的各種載體和其已知制備技術。除了如 通過產生任何不希望的生物作用或另外以有害的方式與藥物組合物的任何其它組分相互 作用而與物質或其衍生物不相容的任何常規載體介質以外，所述載體的使用被涵蓋在本發 明的范圍內。可充當藥學上可接受的載體的材料的一些實例包括但不限于糖如乳糖、葡萄 糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；纖維素和其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基 纖維素和乙酸纖維素；粉狀黃蓍膠；麥芽；膠質；滑石粉。賦形劑，如椰子油和栓劑蠟；油，如 花生油，棉籽油；紅花油，芝麻油；橄欖油；玉米油和大豆油；二醇，如丙二醇；酯，如油酸乙 酯和月桂酸乙酯；瓊脂；緩沖劑，如氫氧化鎂和氫氧化鋁；海藻酸；無熱原水；等滲鹽水；林 格氏溶液；乙醇，和磷酸鹽緩沖溶液，以及其它非毒性相容的潤滑劑，如月桂基硫酸鈉和硬 脂酸鎂，以及著色劑、釋放劑、包衣劑、甜味劑、調味劑和芳香劑、防腐劑和抗氧化劑也可根 據配制人員的判斷而存在于組合物中。
[0063] 術語"藥物組合物"是指具有如載體和/或賦形劑的其它試劑的本文描述的組合 物或其藥學上可接受的鹽。優選地，藥物組合物具有以至少95 %純度，或98 %純度，或99% 純度，或更大純度存在的活性劑。
[0064] 如本文使用，術語"受試者"是患有糖尿病、前糖尿病或易患糖尿病體質的人或其 它動物。因此，在一些實施方案中，受試者需要如本文提供的治療性治療。優選患者是哺乳 動物。患者的實例包括但不限于人、馬、猴、犬、貓、小鼠、大鼠、奶牛、豬、山羊和綿羊。在一 些實施方案中，"受試者"通常是患有糖尿病的人患者。在一些實施方案中，"受試者"是在 最近200、100或50天內被診斷患有TlDM的人患者。在一些實施方案中，"受試者"是最近 被診斷患有糖尿病但是仍然具有殘留β細胞功能的人患者。在一些此類實施方案中，殘留 β細胞功能是可檢測的，或至少10%、20%、30%、40%、50%、60%或更多的3細胞處于完 全運作胰腺中。
[0065] 術語"治療有效量"是指在劑量下和在所需時間周期在細胞培養物、組織系統、動 物或人中有效實現所需生物或醫藥反應（例如，所需治療結果）的量。組合物的有效量可 以根據多種因素而不同，如個體的疾病病況、年齡、性別以及體重和CTLA4分子在個體體內 引出所需反應的能力。治療有效量也是其中治療有利效果超過組合物的任何毒性或有害影 響的量。在一些實施方案中，反應包括減輕和/或延遲所治療的疾病、病狀或病癥的一個或 多個癥狀的發作。
[0066] 如本文使用的術語"治療"定義為將治療劑應用或施用至受試者，或將治療劑應用 或施用至患有糖尿病、疾病癥狀或易患病體質的受試者的分離組織或細胞系。治療意圖包 括預防發作、減緩進展、逆轉或另外改善、改善或影響疾病、疾病癥狀或易患病體質。舉例來 說，用本文描述的組合物治療受試者，例如，人受試者可在1型糖尿病的臨床發作之前、期 間或之后減慢、改善或停止受試者的正在進行的自身免疫性，例如，針對胰腺β細胞的反 應。
[0067] 術語"約"或"大致"意指如本領域普通技術人員所確定的特定值在可接受的誤差 范圍內，所述誤差范圍部分取決于所述值如何測量或測定--例如測量系統的限制或特定 用途所需要的精確度。舉例來說，如根據在本領域中的實踐，"約"可意指1個或2個標準偏 差。或者，"約"可意指給定值的最多20%、優選地最多10%并且更優選地最多5%的范圍。 當在本申請和權利要求書中描述特定值時，除非另外規定，否則應假定術語"約"意指在特 定值的可接受誤差范圍內。
[0068] 除非上下文另有明確說明，否則本文中和所附權利要求中所使用的單數形式"一 (個/種）"和"所述"包括復數的提及物。因此，例如，對"一個分子"的提及包括這類分子 中的一個或多個，"一種樹脂"包括這類不同樹脂中的一種或多種，并且對"一種方法"的提 及包括提及本領域普通技術人員已知的可被修改或取代本文描述的方法的等效步驟和方 法。
[0069] 雖然以上描述提供各種實施方案的實例和特定細節，但是應認識到，所描述實施 方案的一些特征和/或功能允許修改而不脫離所描述實施方案的范圍。以上描述意圖說明 本發明，但其范圍只通過所附權利要求的用語來限制。
[0070] 實施例
[0071] 根據下列實施例可以進一步理解 申請人:教導的各方面，所述實施例不應當被解釋 為以任何方式限制 申請人:教導的范圍。
[0072] 實施例1-研究設計和患者
[0073] 針對本研究對過去100天內被診斷患有1型糖尿病的患者（6-45歲）進行平行篩 選。如果患者具有至少一個糖尿病相關自身抗體（微量測定胰島素抗體[如果胰島素療法 的持續時間小于7天];谷氨酸脫羧酶-65[GAD-65]抗體；胰島細胞抗原-512[ICA-512]抗 體；或胰島細胞自身抗體），并且具有在診斷糖尿病之后至少21天并在37天隨機化期內完 成的混合餐耐量試驗（MMTT)期間被測量到0 · 2nmol/L或更高的刺激C肽濃度，那么患者 適合參與研究。
[0074] 對于乙型肝炎表面抗原、丙型肝炎或HIV的血清抗體來說，血液樣品被篩選為陽 性的人被排除參與研究。也測試樣品的埃-巴二氏病毒（Epstein-Barr virus, EBV)。在篩 選時具有活性EBV感染跡象的個體不合格。隨機化之后展示活性EBV感染跡象的參與者不 接受另外的研究藥物直到消退。
[0075] 患者以2:1比率隨機分配，按照參與地點來分級，接受使用雙盲方案的阿巴西普 或安慰劑實驗治療。表1提供參與者的基線人口統計和實驗室特征。
[0076] 表 1

【權利要求】
1. 一種治療受試者的糖尿病的方法，其特征在于所述方法包括施用有效量的融合蛋白 組合物，所述融合蛋白組合物包含T細胞共刺激拮抗劑和免疫球蛋白分子的一部分。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于所述T細胞共刺激拮抗劑包含CTLA4的細胞 外結構域、所述細胞外結構域的有效片段或所述細胞外結構域的免疫活性變體。
3. 如權利要求1或權利要求2所述的方法，其特征在于所述T細胞共刺激拮抗劑結合 B細胞和/或抗原呈遞細胞（APC)上表達的B7抗原。
4. 如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于所述組合物包括阿巴西普。
5. 如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于所述組合物是作為藥學上可接受 的鹽來施用。
6. 如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于所述組合物還包含油基載體。
7. 如權利要求6所述的方法，其特征在于所述油基載體是油包水乳液。
8. 如權利要求6所述的方法，其特征在于所述油基載體是水包油乳液。
9. 如權利要求6所述的方法，其特征在于所述油基載體是IFA。
10. 如權利要求6所述的方法，其特征在于所述油基載體是Montanide ISA。
11. 如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于所述組合物通過靜脈內輸注來 施用。
12. 如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于所述組合物通過在約50ml至 200ml生理鹽水中靜脈內輸注來施用。
13. 如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于所述組合物以在約5mg/kg至約 50mg/kg范圍變化的劑量來施用。
14. 如權利要求11所述的方法，其特征在于所述組合物的所述靜脈內輸注隨著時間推 移重復進行。
15. 如權利要求11所述的方法，其特征在于所述組合物的所述靜脈內輸注在約一周至 約兩個月范圍變化的時間間隔之后重復至少一次。
16. 如權利要求11所述的方法，其特征在于所述組合物以在約250mg至2000mg范圍變 化的劑量來施用。
17. 如權利要求16所述的方法，其特征在于所述組合物以500mg的劑量來施用。
18. 如權利要求16所述的方法，其特征在于所述組合物以750mg的劑量來施用。
19. 如權利要求16所述的方法，其特征在于所述組合物以IOOOmg的劑量來施用。
20. 如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于所述方法還包括確定隨著時間 推移在從所述受試者獲取的血液樣品中C肽的水平，所述水平是在抑制自身攻擊性T細胞 的活化方面作為治療有效性的指示物。
21. 如權利要求20所述的方法，其特征在于所述組合物在抑制自身攻擊性T細胞的活 化中的所述有效性是通過以下來指示：如與標準相比，維持C肽產生或延遲C肽產生的減 少。
22. 如權利要求20所述的方法，其特征在于所述組合物在抑制自身攻擊性T細胞的活 化中的所述有效性是通過以下來指示：如與標準相比，改善的HbAlc或所述受試者使用的 胰島素減少。
23. 如權利要求20所述的方法，其特征在于所述受試者的C肽產生的所述減少被延遲 至少六個月。
24. 如權利要求20所述的方法，其特征在于所述受試者的C肽產生的所述減少被延遲 至少九個月。
25. 如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于所述受試者是白人。
26. 如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于所述治療受試者的糖尿病包括 預防冒有糖尿病風險的受試者的糖尿病發作。
27. 如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于所述治療受試者的糖尿病包括 延遲冒有糖尿病風險的受試者的所述糖尿病發作至少六個月。
【文檔編號】C07K14/705GK104519900SQ201380034847
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年6月27日 優先權日:2012年6月27日
【發明者】泰漢摩·歐爾本 申請人:歐爾本生物科技有限責任公司