通道視蛋白-2(Chop2)突變的鑒定及使用方法

通道視蛋白-2(Chop2)突變的鑒定及使用方法
【專利摘要】本發明提供了組合物和試劑盒，其包含至少一種編碼突變體ChR2蛋白的核酸或多肽分子。本發明的方法包括對受試者施用包含突變體ChR2的組合物以保護，改善，或恢復光轉導。優選地，對具有受損視覺的受試者提供本發明的組合物和方法，由此將視覺恢復到正常水平。
【專利說明】通道視蛋白-2(Ch〇P2)突變的鑒定及使用方法
[0001] 相關申請
[0002] 本申請要求2012年3月5日提交的美國臨時申請No. 61/606, 663的優先權和權 益，其內容完整并入本文。
[0003] 政府支持
[0004] 本發明是在國立健康研究所/國立眼科研究所撥款NIH EY 17130下得到美國政 府支持進行的。政府具有本發明的某些權利。 發明領域
[0005] -般而言，本發明涉及分子生物學領域。鑒定了通道視蛋 白-2(Channel〇psin-2，Ch 〇p2)基因中的突變。在治療方法中使用包含突變體Chop2基因 的組合物以改善和恢復視覺喪失。
[0006] 發明背景
[0007] 視網膜由光感受器（或光感受器細胞，桿和錐體）組成。光感受器是高度特化的 神經元，該神經元負責光轉導，或光（為電磁輻射形式）轉化成電和化學信號，其在視覺系 統內傳播事件級聯，最終產生我們世界的畫像。
[0008] 光感受器喪失或變性若不完全抑制也是嚴重危及視網膜內視覺信息的光轉導。光 感受器細胞的喪失和/或光感受器細胞功能的喪失是降低的視覺敏銳度，降低的光敏感 性，和盲的主要原因。本領域中長期需要恢復經歷視覺喪失的受試者的視網膜的光敏感性 的組合物和方法。
[0009] 發明概述
[0010] 本發明提供了對恢復和/或提高光感受器細胞的光敏感性的方法的長期需要的 解決方法，其通過表達通道視蛋白-2 (Chop2)基因的有利突變，和/或其組合，隨后提供基 于通道視蛋白_2(Chop2)的基因療法的方法進行。
[0011] 基于通道視蛋白_2(Chop2)的基因療法提供了用于恢復光感受器變性后視黃醛 光敏感性的卓越策略。Chop2基因的蛋白質產物在與光可異構化發色團全反式視黃醛結合 時形成功能性光門控通道，稱作通道視紫紅質-2 (ChR2, channelrhodopsin-2)。天然ChR2 顯示較低的光敏感性。最近，報告了兩種突變體ChR2,即L132C和T159C顯著提高其光敏感 性（Kleinlogel 等（2011)Nat Neurosci. 14:513-8 ;Berndt 等（2011)Proc Natl Acad Sci USA. 108:7595-600 ;Prigge 等（2012) J Biol Chem. 287(38)3104:12;每篇的內容完整并入 本文）。檢查這兩種ChR2突變體（即L132C和T159C)的特性，并且與多種在這兩個位點處 的雙重突變體比較以鑒定治療方法的合適候選物。為了恢復視覺，對有此需要的受試者提 供包含這些中一種或多種突變的組合物。具體地，將Chop2基因中的期望突變引入細胞和 /或整合到細胞的基因組DNA中以改善或恢復視覺。Chop2基因中引入細胞以改善或恢復 視覺的期望突變也可以保持為附加體的，尚未整合到基因組DNA中。
[0012] Chop2的L132或T159氨基酸位置處的突變（且因此所得的ChR2)顯著降低引發 ChR2介導的光電流需要的閾值光強度。氨基酸位置L132和T159處的雙重突變體進一步 提高低光強度時的光電流，其超過任一種相應單突變的。表達L132和T159位置處的雙重 突變體的視網膜神經節細胞可以響應適合于恢復有用視覺的光強度，其落入正常戶外光照 條件的范圍內，但是應當仍然維持足夠的，且高的時間分辨率（temporal resolution)。因 此，形成具有改善的光敏感性的突變體ChR2的本發明突變體Chop2蛋白單獨或組合使用以 恢復或改善視覺。
[0013] 具體地，本發明提供了分離的多肽分子，其包含或組成為（consisting of) SEQ ID NO: 26,其中SEQ ID NO: 26的第132位氨基酸不是亮氨酸（L)。在分離的多肽分子的某些實 施方案中，所述第132位氨基酸是半胱氨酸（C)或丙氨酸（A)。在第132位氨基酸是半胱 氨酸（C)時，多肽分子可以包含或組成為SEQ ID NO: 13。在第132位氨基酸是丙氨酸（A) 時，多肽分子可以包含或組成為SEQ ID N0:20。
[0014] 本發明提供了分離的多肽分子，其包含或組成為SEQ ID NO:26,其中SEQ ID NO: 26的第159位氨基酸不是蘇氨酸（T)。在分離的多肽分子的某些實施方案中，第159位 氨基酸是半胱氨酸（C)，絲氨酸（S)，或丙氨酸（A)。在第159位氨基酸是半胱氨酸（C)時， 多肽分子可以包含或組成為SEQ ID NO: 14。在第159位氨基酸是絲氨酸（S)時，多肽分子 可以包含或組成為SEQ ID NO: 17。在第159位氨基酸是丙氨酸（A)時，多肽分子可以包含 或組成為SEQ ID NO:23。
[0015] 本發明提供了分離的多肽分子，其包含或組成為SEQ ID NO:26,其中SEQ ID NO: 26的第132位氨基酸不是亮氨酸（L)，且第159位氨基酸不是蘇氨酸（T)。在分離的多 肽分子的某些實施方案中，所述分離的多肽分子包含或組成為SEQ ID N0:26,其中SEQ ID NO: 26的第132位氨基酸不是亮氨酸（L)，且第159位氨基酸不是蘇氨酸（T)，第132位氨基 酸是半胱氨酸（C)，且第159位氨基酸是半胱氨酸（C)。在此分離的多肽分子的優選的實施 方案中，多肽分子包含或組成為SEQ ID NO: 16。本發明提供了編碼分離的多肽的分離的核 酸分子，所述分離的多肽包含或組成為SEQ ID NO: 16。優選地，編碼包含或組成為SEQ ID NO: 16的分離的多肽的分離的核酸分子是包含或組成為SEQ ID NO: 15的核酸分子。
[0016] 在分離的多肽分子的某些實施方案中，所述分離的多肽分子包含或組成為SEQ ID NO: 26,其中SEQ ID NO: 26的第132位氨基酸不是亮氨酸（L)，且第159位氨基酸不是蘇氨 酸（T)，第132位氨基酸是半胱氨酸（C)，且第159位氨基酸是絲氨酸（S)。分離的多肽分子 可以包含或組成為SEQ ID NO: 19,所述分離的多肽分子包含或組成為SEQ ID NO:26,其中 SEQ ID NO: 26的第132位氨基酸不是亮氨酸（L)，且第159位氨基酸不是蘇氨酸（T)。或者 /另外，分離的多肽分子可以包含或組成為SEQ ID N0:19,所述分離的多肽分子包含或組成 為SEQ ID NO: 26,其中SEQ ID NO: 26的第132位氨基酸不是亮氨酸（L)，且第159位氨基 酸不是蘇氨酸（T)，其中第132位氨基酸是半胱氨酸（C)，且其中第159位氨基酸是絲氨酸 (S)。本發明提供了編碼分離的多肽的分離的核酸分子，所述分離的多肽包含或組成為SEQ ID NO: 19。優選地，核酸分子包含或組成為SEQ ID NO: 18。
[0017] 在分離的多肽分子的某些實施方案中，所述分離的多肽分子包含或組成為SEQ ID NO:26,其中SEQ ID NO:26的第132位氨基酸不是亮氨酸（L)且第159位氨基酸不是蘇氨 酸（T)，第132位氨基酸是丙氨酸（A)且第159位氨基酸是半胱氨酸（C)。分離的多肽分子 可以包含或組成為SEQ ID N0:22,所述分離的多肽分子包含或組成為SEQ ID N0:26,其中 SEQ ID NO: 26的第132位氨基酸不是亮氨酸（L)且第159位氨基酸不是蘇氨酸（T)。或者 /另外，分離的多肽分子可以包含或組成為SEQ ID N0:22,所述分離的多肽分子包含或組成 為SEQ ID N0:26,其中SEQ ID N0:26的第132位氨基酸不是亮氨酸（L)且第159位氨基 酸不是蘇氨酸（T)，其中第132位氨基酸是丙氨酸（A)且其中第159位氨基酸是半胱氨酸 (C)。本發明提供了編碼分離的多肽的分離的核酸分子，所述分離的多肽包含或組成為SEQ ID N0:22。優選地，核酸分子包含或組成為SEQ ID N0:21。
[0018] 在分離的多肽分子的某些實施方案中，所述分離的多肽分子包含或組成為SEQ ID NO:26,其中SEQ ID NO:26的第132位氨基酸不是亮氨酸（L)且第159位氨基酸不是蘇氨 酸（T)，第132位氨基酸是半胱氨酸（C)且第159位氨基酸是丙氨酸（A)。分離的多肽分子 可以包含或組成為SEQ ID N0:25,所述分離的多肽分子包含或組成為SEQ ID N0:26,其中 SEQ ID NO: 26的第132位氨基酸不是亮氨酸（L)且第159位氨基酸不是蘇氨酸（T)。或者 /另外，分離的多肽分子可以包含或組成為SEQ ID N0:25,所述分離的多肽分子包含或組成 為SEQ ID NO: 26,其中SEQ ID NO: 26的第132位氨基酸不是亮氨酸（L)且第159位的氨基 酸不是蘇氨酸（T)，其中第132位氨基酸是半胱氨酸（C)且其中第159位氨基酸是丙氨酸 (A)。本發明提供了編碼分離的多肽的分離的核酸分子，所述分離的多肽包含或組成為SEQ ID N0:25。優選地，核酸分子包含或組成為SEQ ID N0:24。
[0019] 本發明提供了本文中描述的任一種分離的多肽分子，其中所述多肽分子編碼突變 體Chop2蛋白，該突變體Chop2蛋白形成突變體ChR2，該突變體ChR2響應比野生型ChR2蛋 白的閾值低的閾值光強度而引發電流。此外，電流傳導陽離子。例示性的陽離子包括但不 限于H+，Na+，K+，和Ca 2+離子。本文中描述的ChR2野生型和突變體蛋白非特異性傳導陽離 子。因此，電流傳導下列一種或多種：H+，Na+，K+，和Ca 2+離子。
[0020] 本發明提供了本文中描述的任一種分離的多肽分子，其進一步包含藥學可接受載 體。本發明還提供了組合物，其包含本文中描述的至少一種分離的多核苷酸分子。組合物 可以進一步包含藥學可接受載體。
[0021] 本發明提供了分離的核酸分子，其編碼本文中描述的任何分離的多肽。此外，分離 的核酸分子可以進一步包含藥學可接受載體。本發明還提供了組合物，其包含本文中描述 的至少一種分離的核酸分子。組合物可以進一步包含藥學可接受載體。
[0022] 本發明提供了細胞，其中該細胞已經接觸或包含本發明的分離的多肽分子。此 夕卜，本發明提供了細胞，其中該細胞已經接觸或包含本發明的分離的核酸分子，其編碼 本發明的分離的多肽分子。本發明提供了組合物，其包含，組成基本上為（consisting essentially of)，或組成為細胞，該細胞包含本發明的分離的多肽分子或編碼本發明的分 離的多肽分子的核酸分子。本發明的細胞可以在體外，離體，在體內，或原位與分離的多肽 或編碼多肽的分離的核酸接觸。在本發明的某些實施方案中，細胞是光感受器；水平細胞； 雙極細胞（bipolar cell);無長突細胞，和特別是AII無長突細胞；或視網膜神經節細胞， 包括感光性視網膜神經節細胞。優選地，細胞是視網膜神經節細胞，感光性視網膜神經節細 胞，雙極細胞，ON型雙極細胞，桿狀雙極細胞，或AII無長突細胞。在本發明的某些方面，細 胞是光感受器，雙極細胞，桿狀雙極細胞，ON型錐體雙極細胞，視網膜神經節細胞，感光性視 網膜神經節細胞，水平細胞，無長突細胞，或AII無長突細胞。
[0023] 本發明提供了改善或恢復視覺的方法，其包括對受試者施用本文中描述的任一種 組合物。本發明進一步提供了保護視覺的預防方法，其包括對受試者施用本文中描述的任 一種組合物。
[0024] 本文中描述的方法也可以應用于那些健康的盲（部分或完全）的受試者，和/或 那些患有視網膜變性（以桿狀和/或錐體光感受器細胞喪失為特征）的受試者，但是可 以依賴于感光性視網膜神經節細胞的活性以測定周圍光水平。例如，可以使用本文中描 述的方法來保護，改善，或恢復感光性視網膜神經節細胞的活性，其介導用于將生理節奏 (circadian rhythm)同步到24小時光照/黑暗周期的光照信息的轉換，瞳孔控制和反射， 和黑素釋放的光調節。
[0025] 在本發明的方法的某些實施方案中，受試者可以具有正常的視覺或受損的視 覺。或者/另外，受試者可以有風險形成導致視覺損傷的眼科疾病。例如，受試者可以 具有眼科疾病，包括黃斑變性（macular degeneration)和色素性視網膜炎（retinitis pigmentosa)的家族史。受試者可以有風險招致眼損傷，其對視網膜中的感光性細胞引起 損傷。受試者可以具有遺傳標志物或遺傳/先天性狀況，其導致受損的視覺，低視覺，法定 盲（legal blindness),部分盲（partial blindness),或完全盲。受試者可以具有屈折 缺陷（refractive defect),其導致近視（myopia)(近視眼（near-sightedness))或遠視 (hyperopia)(遠視目艮（far-sightedness))。
[0026] 可以對受試者系統或局部施用本發明的方法的組合物。局部施用的優選路徑是玻 璃體內（intravitreal)注射。
[0027] 本發明的其它特征和優點從以下詳細描述和權利要求書看會是顯而易見的，并且 由以下詳細描述和權利要求書涵蓋。
[0028] 附圖簡述
[0029] 圖1顯示了用于比較其光敏感性的HEK細胞中來自野生型（WT)ChR2, L132C， L132C/T159C，和 L132C/159S 突變體的光引發電流（light-evoked current)的代表 性記錄（A)。光刺激（光子/cm2, s，于460nm)由氙弧燈產生并且通過中性密度濾光片 (neutral density filter)減弱：ND4. 0(2. 8xl014)，ND3. 0(1. 4xl015)，ND2. 5(4. 8xl015); ND2. 0(1. 6x1016)，ND1. 0(1. 3xl017)，ND0(l. 2xl018) (B)。以不同電流比例顯示了相同的電流 跡線。以箭頭指向的跡線通過相同的光強度（ND2. 5)引發。
[0030] 圖2顯示了用于比較其失活時間過程（deactivation time course)(光照關閉后 的衰減時間過程）的HEK細胞中針對IOms光脈沖（I. 2xl018個光子/cm2/s，于460nm)的來 自野生型（WT) ChR2, T159C，L132C，L132C/T159C，和L132C/T159S突變體的光引發電流的代 表性記錄。
[0031] 圖3顯示了用于比較其光敏感性的視網膜整裝（retinal whole-mount)中來 自視網膜神經節細胞的WT ChR2, L132C，L132C/T159C，和L132C/T159S介導的尖峰形 成活性（spiking activities)的代表性多通道陣列記錄。光刺激（光子/cm2/s)由 473nm藍色激光產生，并且通過中性密度濾光片減弱：ND0(6. 3xl016)，NDL 0(7. 4xl015)， NDL 5 (2. 7xl015), ND2. 0 (7. 3xl014), ND2. 5 (3. 2xl014), ND3. 0 (8. 5xl013), ND3. 5 (3. 8xl013), 和 ND4. 0(9. 5xl012)。
[0032] 圖4顯示了用于比較其時間動態（temporal dynamics)的視網膜整裝中來自視 網膜神經節細胞的WT ChR2, L132C，L132C/T159C，和L132C/T159S介導的尖峰形成活性 的代表性多通道陣列記錄。在每個小圖中，顯示了源自單個光子的10個連續光引發尖峰 (light-elicited spike)的光柵圖（頂部）和平均尖峰率（averaged spike rate)直方圖 (底部）。以高于每個突變體的閾值強度約1個對數單位的強度通過473nm藍色激光產生 不同頻率的光脈沖。WT ChR2和L132C的記錄顯示于（A)，且L132C/T159C和L132C/T159S 的記錄顯示于（B)。
[0033] 發明詳述
[0034] 視覺系統
[0035] 中樞神經系統經由視覺系統中存在的特化細胞和信號轉導的獨特方法介導視覺 (在本文中又稱為視力）。視覺系統的原則責任是將電磁輻射形式的光轉化成周圍世界的 畫像或圖像。在此系統的"視覺"功能外，視覺系統還調節瞳孔光反射（pupillary light reflex, PLR)，向周期性光照/黑暗周期的生理節奏光牽引（circadian photoentrainment to periodic light/dark cycle),和激素褪黑素的釋放。
[0036] 視網膜的細胞是視覺或神經系統遇到光（不同波長和強度的電磁輻射）的第一種 細胞。光子在達到視網膜前穿過角膜，瞳孔，和晶狀體。視網膜由于直接吸收光子的光感受 器細胞位于視網膜的外層而具有獨特的結構。在達到光感受器細胞（又稱為桿和椎體）的 外層前，穿過晶狀體的光子首先遇到視網膜神經節細胞（少數視網膜神經節細胞通過表達 視蛋白黑視蛋白（melanopsin)而為感光性）的內層和雙極細胞的中間層。桿狀光感受器 在暗淡照明條件（暗適應視覺）中起作用，而椎體光感受器在明亮照明條件（光適應視覺） 中起作用，負責顏色視覺。椎體光感受器直接對ON和OFF型錐體雙極細胞上形成突觸，其繼 而直接對ON和OFF型視網膜神經節細胞上形成突觸。桿狀光感受器向桿狀雙極細胞（一 種獨特類型的雙極細胞，其為ON型）形成突觸，所述桿狀雙極細胞向AII無長突細胞形成 突觸。AII無長突細胞然后通過縫隙連接對ON型錐體雙極細胞及通過抑制性甘氨酸能突觸 對OFF型錐體雙極細胞及OFF神經節細胞中繼（relay)視覺信號。視網膜神經節細胞負責 將視覺信號與腦神經元關聯。
[0037] 光轉導
[0038] 在視網膜內，光感受器細胞吸收光子顆粒，并將光頻率和波長的原始數據轉化成 化學及隨后電信號，其遍及視覺和神經系統傳播此種初始信息。具體地，位于光感受器（桿 狀，椎體，和/或感光性視網膜神經節細胞）表面上的蛋白質視蛋白吸收光子，并且啟動胞 內信號傳導級聯，其導致光感受器的超極化。在黑暗中，蛋白質視蛋白不吸收光子，光感受 器是去極化的。光感受器的視覺信號然后經由雙極細胞，無長突細胞，和神經節細胞中繼到 腦的高視覺中心。具體地，當桿狀和椎體光感受器去極化（在黑暗中）時，它們引起桿狀雙 極細胞和ON型錐體雙極細胞的去極化，但OFF性錐體雙極細胞的超極化，這繼而引起AII 無長突細胞的去極化和ON型視網膜神經節細胞的尖峰形成（spiking)增加和OFF型視網 膜神經節細胞的尖峰形成減少。當桿狀和椎體光感受器超極化（響應光）時，發生相反的 事情（就桿狀，ON和OFF雙極細胞，AII無長突細胞及ON和OFF神經節細胞而言）。
[0039] 光照信息通過光感受器，雙極細胞，水平細胞，無長突細胞，和視網膜神經節細胞 的作用被顯著加工和提煉（refine)。為了增加此系統的復雜性，光感受器以三種主要種類 發現，包括桿狀，椎體（其中三類最強烈響應不同的光波長），和感光性視網膜神經節細胞。 因此，在差異響應某些光波長和強度的光感受器水平發生第一層信息加工。視網膜的雙極 細胞接受來自光感受器細胞和水平細胞兩者的信息。視網膜的水平細胞接受來自多種光 感受器細胞的信息，且因此整合視網膜中細胞類型和穿過距離之間的信息（information between cell types and across distances in the retina)。雙極細胞通過對視網膜神 經節細胞產生主要分段電勢（mainly graded potential)進一步整合直接來自光感受器細 胞和水平細胞的信息，盡管一些最近的研究指示一些雙極細胞可以產生作用電勢。錐體雙 極細胞在視網膜神經節細胞和無長突細胞上形成突觸，而桿狀雙極細胞僅對AII無長突細 胞形成突觸。類似于水平細胞，大多數無長突細胞在視網膜內側向整合信息。不同于水平 細胞，大多數無長突細胞是抑制性（GABA能）中間神經元。無長突細胞也比水平細胞更為 特化，因為每個無長突細胞在特定類型的雙極細胞（雙極細胞的10個種類之一）上特異性 形成突觸。特別地，AII無長突細胞是桿狀途徑（在暗適應視覺下，此時椎體光感受器不響 應）中的一種重要中繼神經元。AII無長突細胞接受來自桿狀雙極細胞的突觸輸入，然后 將信號捎帶確認（Piggy-back)到如上文描述的從ON和OFF錐體雙極細胞至ON和OFF神 經節細胞的椎體途徑。因此，桿狀雙極細胞或AII無長突細胞中的Chop2的表達和所得的 ChR2形成可以在視網膜神經節細胞中創建開啟（ON)和關閉（OFF)響應。此外，視網膜神經 節細胞整合來自雙極細胞及來自無長突細胞的信息。雖然視網膜神經節細胞就大小，連接 性（connectivity)，和對視覺刺激（例如視野）的響應而言顯著變化，所有視網膜神經節細 胞將長的軸突延伸到腦中。除了轉導關于瞳孔光反射和生理節奏光牽引的非視覺信息的一 小部分視網膜神經節細胞外，從視網膜神經節細胞延伸的全部軸突形成中樞神經系統的視 神經，視交叉，和視束。因此，視網膜自身中發生大量的信息加工。
[0040] 光感受器細胞表達內源視蛋白蛋白質，諸如視紫紅質。本發明的突變體Chop2蛋 白可以在任何細胞類型中表達，并且形成功能性ChR2通道。優選地，細胞是視網膜細胞。例 示性的細胞包括但不限于光感受器細胞（例如桿狀，椎體和感光性視網膜神經節細胞），水 平細胞，雙極細胞，無長突細胞，和視網膜神經節細胞。
[0041] 通道視蛋白-2 (Chop2)
[0042] 通道視蛋白-2 (Chop2)首次從綠藻萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii) 分離。通道視蛋白-2是一種七跨膜域蛋白質，其在與發色團全反式視黃醛結合時變為 光可轉換的（光敏感性）。Chop2在經由Schiff堿連接與視網膜分子連接時形成光門 控的，非特異性，內部整流的陽離子通道，稱作通道視紫紅質 -2(Channelrhodopsin-2) (Chop2retinalidene，縮寫為 ChR2)。
[0043] 如本文中提及的，"通道視蛋白-2"或"Chop2"指編碼通道視蛋白-2的基因，所述 通道視蛋白-2在結合視黃醛后然后形成通道視紫紅質_2(ChR2)。本發明的基因構建體主 要指通道視蛋白-2 (即，沒有視黃醛），并且本文中公開的所有Chop2變體形成功能性通道 視紫紅質-2變體。本文中公開的方法可以包括將Chop2投遞到沒有外源視黃醛的細胞。應 當理解，在細胞（即視網膜神經元）中表達Chop2后，內源可用的視黃醛結合野生型Chop2 或本發明的Chop2突變體以形成功能性光門控通道WT ChR2或突變體ChR2。因此，如本文 中提及的Chop2蛋白與ChR2也可以是同義的。
[0044] 如本文中使用的，"通道視紫紅質-2"或"ChR2"指視黃醛結合的功能性光敏感性 通道。在一個實施方案中，可以外源提供結合的視黃醛。在一個優選的實施方案中，從細胞 中可用的內源水平提供結合的視黃醛。本發明還涵蓋由編碼本文中描述的Chop2突變體的 多肽和多核苷酸形成的功能性通道視紫紅質-2通道。
[0045] 在通過優選劑量的光發射照明后，ChR2開放通道的孔，H+，Na+，K+，和/或Ca2+離 子通過該孔從胞外空間流到細胞中。ChR2通道的活化通常引起表達通道的細胞的去極化。 去極化的細胞產生分段電勢和或作用電勢（action potential)以將信息從Chop2/ChR2表 達細胞攜帶到視網膜或腦的其他細胞。
[0046] ChR2的野生型形式或具有高時間分辨率的突變體ChR2已經變為神經科學研究的 中心焦點。在哺乳動物神經元中表達時，ChR2介導體外或離體培養物的光控制去極化。野 生型ChR2或具有高時間分辨率的突變體ChR2 (后者通常展現出低光敏感性）提出了使其 能夠用于視覺恢復目的必須解決的幾項挑戰。為了視覺恢復，具有較高光敏感性而非高時 間分辨率的ChR2是期望的。
[0047] 野生型ChR2蛋白需要來自較高藍光強度的照明以實現完全活化（即IO18-IO 19個 光子?πΓ2，于480nm的波長）。此類連續照明可以損傷細胞。
[0048] 野生型ChR2蛋白的動力學對于使通道效力最大化是次優的。效力可以通過修飾 野生型ChR2蛋白的一個或多個氨基酸以延長通道的開放狀態或者提高通道的單位電導， 或兩者提高。野生型ChR2的單通道電導是小的。因此，體內的神經元活化應當需要野生型 通道的高表達或用優選的藍光波長的非常強烈的活化。更簡單的解決辦法可以通過改變通 道電導發現或延長通道開放時間。這些機制的任一種及特別是這些機制的組合使得能使用 更低且更安全的光強度達到相同水平的細胞去極化。
[0049] 例如，本發明的突變體ChR2蛋白經由通道開放狀態的延長實現更大的光敏感性。 因此，在被相同光強度活化時，每個突變體ChR2通道比野生型ChR2通道傳導更大的光電 流。因此，突變體通道被比野生型ChR2通道活化需要的光強度低的光強度活化。可以通過 比引發來自表達野生型ChR2的視網膜神經節細胞的尖峰形成活性需要的光強度低1. 5-2 個對數單位的光強度引發表達突變體ChR2蛋白的視網膜神經節細胞的數量上可檢測的尖 峰形成活性。因此，活化突變體ChR2蛋白需要的光強度選擇為或落入正常戶外光照條件的 范圍。
[0050] 以下序列提供了野生型和突變體Chop2蛋白，和編碼本發明的所述WT和突變體 Chop2蛋白的多核苷酸，并形成本發明的WT和野生型ChR2的多核苷酸的非限制性例子。
[0051] 本發明的野生型（WT)Chop2可以由以下萊茵衣藻衣視蛋白4(chlamyopsin 4)光 門控離子通道（C0P4)mRNA序列（GenBank登陸號XM_001701673和SEQ ID NO: 1)編碼：
【權利要求】
1. 一種分離的多肽分子，其包含SEQ ID NO: 26,其中SEQ ID NO: 26的第132位氨基酸 不是亮氨酸（L)。
2. 權利要求1的多肽分子，其中所述第132位氨基酸是半胱氨酸（C)或丙氨酸（A)。
3. 權利要求2的多肽分子，其中所述第132位氨基酸是半胱氨酸（C)，且其中所述多肽 分子包含SEQ ID NO: 13。
4. 權利要求2的多肽分子，其中所述第132位氨基酸是丙氨酸（A)，且其中所述多肽分 子包含 SEQ ID NO:20。
5. -種分離的多肽分子，其包含SEQ ID NO: 26,其中SEQ ID NO: 26的第159位氨基酸 不是蘇氨酸（T)。
6. 權利要求5的多肽分子，其中所述第159位氨基酸是半胱氨酸（C)，絲氨酸（S)，或丙 氨酸（A)。
7. 權利要求6的多肽分子，其中所述第159位氨基酸是半胱氨酸（C)，且其中所述多肽 分子包含SEQ ID NO: 14。
8. 權利要求6的多肽分子，其中所述第159位氨基酸是絲氨酸（S)，且其中所述多肽分 子包含 SEQ ID NO: 17。
9. 權利要求6的多肽分子，其中所述第159位氨基酸是丙氨酸（A)，且其中所述多肽分 子包含 SEQ ID NO:23。
10. -種分離的多肽分子，其包含SEQ ID NO:26,其中SEQ ID NO:26的第132位氨基 酸不是亮氨酸（L)且所述第159位氨基酸不是蘇氨酸（T)。
11. 權利要求10的多肽分子，其中所述第132位氨基酸是半胱氨酸（C)，其中所述第 159位氨基酸是半胱氨酸（C)。
12. 權利要求10或11的多肽分子，其中所述多肽分子包含SEQ ID NO: 16。
13. -種分尚的核酸分子，其編碼權利要求12的分尚的多肽。
14. 權利要求13的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO: 15。
15. 權利要求10的多肽分子，其中所述第132位氨基酸是半胱氨酸（C)，其中所述第 159位氨基酸是絲氨酸（S)。
16. 權利要求10或15的多肽分子，其中所述多肽分子包含SEQ ID NO: 19。
17. -種分尚的核酸分子，其編碼權利要求16的分尚的多肽。
18. 權利要求17的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO: 18。
19. 權利要求10的多肽分子，其中所述第132位氨基酸是丙氨酸（A)，其中所述第159 位氨基酸是半胱氨酸（C)。
20. 權利要求10或19的多肽分子，其中所述多肽分子包含SEQ ID NO:22。
21. -種分尚的核酸分子，其編碼權利要求22的分尚的多肽。
22. 權利要求21的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQ ID N0:21。
23. 權利要求10的多肽分子，其中所述第132位氨基酸是半胱氨酸（C)，其中所述第 159位氨基酸是丙氨酸（A)。
24. 權利要求10或23的多肽分子，其中所述多肽分子包含SEQ ID NO:25。
25. -種分尚的核酸分子，其編碼權利要求24的分尚的多肽。
26. 權利要求25的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO:24。
27. -種分離的核酸分子，其編碼權利要求1，3,4,5,6,7,8,9,10,11，15,16,19,20， 23,和24中任一項的分離的多肽。
28. 權利要求27的分離的核酸分子，其中所述分離的多肽長約315, 310, 300, 275, 250， 225, 200,175,或 160 個氨基酸。
29. 權利要求27或28的分離的核酸分子，其進一步包含藥學可接受載體。 30?權利要求 1，2, 3,4, 5,6, 7,8,9,10,11，12,13,15,16,19, 20, 23,和 24 中任一項的分 離的多肽分子，其中所述多肽分子編碼突變體ChR2蛋白，其響應比野生型ChR2蛋白的閾值 低的閾值光強度而引發電流。
31. 權利要求30的分離的多肽分子，其中所述多肽分子長約315, 310, 300, 275, 250， 225, 200,175,或 160 個氨基酸。
32. 權利要求30或31的分離的多肽分子，其進一步包含藥學可接受載體。
33. -種組合物，其包含權利要求27,28,和29中任一項的分離的核酸分子。 34?-種組合物，其包含權利要求 1，2, 3,4, 5,6, 7,8,9,10,11，12,13,15,16,19, 20， 23, 24, 29, 30和31中任一項的分離的多肽分子。 35?-種細胞，其包含權利要求 1，2, 3,4, 5,6, 7,8,9,10,11，12,13,15,16,19, 20, 23， 24, 29, 30和31中任一項的分離的多肽分子。
36. 一種細胞，其包含分尚的核酸分子，該分尚的核酸分子編碼權利要求1，2, 3,4, 5， 6, 7,8,9,10,11，12,13,15,16,19, 20, 23, 24, 29, 30 和 31 中任一項的分離的多肽分子。
37. -種細胞，其包含權利要求27或28的分離的核酸分子。
38. -種組合物，其包含權利要求35, 36,和37中任一項的細胞。
39. 權利要求35, 36,和37的細胞，其中所述細胞在體外，離體，在體內，或原位與所述 分離的多肽或編碼所述多肽的分離的核酸接觸。
40. 權利要求35, 36,和37的細胞，其中所述細胞是光感受器，雙極細胞，桿狀雙極細 胞，ON型錐體雙極細胞，視網膜神經節細胞，感光性視網膜神經節細胞，水平細胞，無長突細 胞，或All無長突細胞。
41. 權利要求40的細胞，其中所述細胞是視網膜神經節細胞或感光性視網膜神經節細 胞。
42. -種改善或恢復視覺的方法，其包括對受試者施用權利要求33的組合物。
43. -種改善或恢復視覺的方法，其包括對受試者施用權利要求34的組合物。
44. 一種改善或恢復視覺的方法，其包括對受試者施用權利要求38的組合物。
45. 權利要求42,43和44的方法，其中所述受試者具有正常的視覺。
46. 權利要求42,43和44的方法，其中所述受試者具有受損的視覺。
47. 權利要求42,43和44的方法，其中所述受試者患有眼疾病。
48. 權利要求47的方法，其中所述眼疾病是黃斑變性（macular degeneration)或色素 性視網膜炎（retinitis pigmentosa)。
49. 權利要求42，43和44的方法，其中通過玻璃體內或視網膜下注射施用所述組合物。
50. 權利要求42,43和44的方法，其中所述改善或恢復視覺包括下列任一項：提高光 敏感性；降低引發光電流需要的閾值光強度；及提高視皮質中的視覺誘發電位。
【文檔編號】C07K14/705GK104334575SQ201380022635
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2013年3月5日 優先權日:2012年3月5日
【發明者】Z-h.潘 申請人:韋恩州立大學