雙特異性抗體分子和抗原-轉染的t-細胞以及它們在醫藥中的用途
【專利摘要】本發明涉及雙特異性(單克隆)抗體分子，其具有與CD8+T-細胞上的抗原結合的第一結合結構域，所述的抗原非天然地存在于CD8+T-細胞之中和/或之上；和與天然地存在于腫瘤細胞表面上的腫瘤-特異性抗原結合的第二結合結構域。所述的雙特異性(單克隆)抗體分子在與轉導的CD8+T-細胞，和/或T-細胞受體的結合特別有用，所述轉導的CD8+T-細胞包含非天然地存在于所述CD8+T-細胞之中和/或之上的抗原。本發明提供應用所述(雙特異性)抗體分子作為藥物，所述(雙特異性)抗體分子用于具體疾病的治療，以及用于包含所述(雙特異性)抗體分子的藥物組合物/藥物，其中，在特定的治療方案中，所述的(雙特異性)抗體分子與轉導的CD8+T-細胞，和/或T-細胞受體結合施用，所述的CD8+T-細胞包含非天然地存在于所述CD8+T-細胞之中和/或之上的抗原。本發明的另外的方面還涉及編碼所述雙特異性(單克隆)抗體分子的核酸，載體，宿主細胞，制備所述(雙特異性)抗體分子的方法，以及包含本發明的(雙特異性)抗體分子的試劑盒。
【專利說明】雙特異性抗體分子和抗原-轉染的T-細胞以及它們在醫藥 中的用途
[0001] 本發明涉及雙特異性（單克隆）抗體分子，其具有與CD8+T-細胞上的抗原結合的 第一結合結構域，所述的抗原非天然地存在于CD8+T-細胞之中或之上；和與天然地存在于 腫瘤細胞表面上的腫瘤-特異性抗原結合的第二結合結構域。此外，還提供了編碼本發明 的（單克隆）雙特異性抗體分子的核酸。本發明的另外方面還提供包含所述核酸序列的載 體和宿主細胞，生產本發明的雙特異性抗體分子的方法，以及包含所述（雙特異性）抗體分 子的藥物/組合物。再有，本發明還涉及經轉導的⑶8+T-細胞，其包含非天然地存在于所述 CD8+T-細胞之中和/或之上的抗原，和/或T-細胞受體。本發明還提供所述雙特異性抗體 分子在制備用于治療具體疾病以及在包含所述（雙特異性）抗體分子的藥物組合物/藥物 中的用途，其中，在特定的治療方案中，所述的（雙特異性）抗體分子與經轉導的CD8+T-細 胞，和/或T-細胞受體結合施用，所述的CD8+T-細胞包含非天然地存在于所述CD8+T-細胞 之中和/或之上的抗原。本發明還提供治療具體疾病的方法和包含本發明的（雙特異性） 抗體分子的試劑盒。
[0002] 發明背景
[0003] T-細胞（即T淋巴細胞）輸入（transfusion)，稱為過繼T-細胞療法，已 經過測試用于癌癥和慢性感染的治療。過繼T-細胞療法具有增強抗腫瘤免疫，提 高疫苗效力以及限制移植物-抗-宿主疾病的潛力。過繼T-細胞療法用作細胞源， 尤其是，細胞毒性T-細胞（CTLs)，或腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs)。雙特異性抗體 可用于"武裝（arm)"（活化的）T-細胞以形成它們和腫瘤細胞表面抗原之間的橋 梁。雙特異性抗體在一側靶向腫瘤細胞上的表面標記/抗原，在另一側靶向另一種天 然地/內源性地在細胞中或細胞上表達的標記/抗原，例如在下述文獻中所描述的， 如 Glorius 等，Bloodll6(2010), 1173 ;Rothe 等，Bloodll8(2011), 1585 ;Zhengxing 等，Bloodlll (2007) ,2211-2219, Herrmann 等，Cancer Research68(2008) ,1221-1227; Singer 等，Journal of Immunotherapy33(2010)，599-608 ;Brandl 等,Experimental Hematology27(1999)，1264-1270 ;James 等,European Journal of Cancer35(1999)，S343-S344;Chen 等，Clinical Cancer Researchl (1995) ,1319-1325; Valera 等，Molecular Cancer Therapeutics9 (2010),1872-1883 ;Gelderman 等,European Journal of Immunology36(2006), 977-984 ；Schweizer 等,Cancer Immunology Immunotherapy51 (2002)，621-629 ;Friedman等，Biotechnology and Applied Biochemistry54(2009)，12卜131;Schaefer 等，Cancer Cell20(2011)，472-486and Kazuhiko 等，International Journal of Molecular Medicine25(2010)，209-215。
[0004] 已知抗原特異性的細胞毒性T-細胞（CTLs)具有殺死人癌細胞的能力，如向 患有黑素瘤的患者過繼轉移先體外后體內（ex-vivo)擴增的腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocytes, TILs)或T-細胞受體基因-轉染的T-細胞后所顯示的腫瘤 阻抑（regression)那樣（Leen 等，Annu. Rev. Immunol. 115 (2007)，98-104)。一種已知 的替代途徑是利用雙特異性抗體重新定向大量的內源T-細胞。這些雙特異性抗體，其中 的一些設計形式（formats)稱作BiTE(指"雙特異性T-細胞銜接器（engager)"）是以 如下方式構建的，即在一側靶向表面標記CD3(其天然地存在于/內源性地表達于T-細 胞之上），在另一側靶向腫瘤細胞上的表面抗原（其天然地/內源性地表達于腫瘤細胞 表面）。此外，在之前的工作中已表明，這一具體設計的抗-CD3抗-靶抗原雙特異性抗 體具有異常高的效力并可以銜接（engage)CD8+T-細胞和CD4+T-細胞，以極低的效應物 對革G標（E:T)比率裂解癌細胞。兩種BiTE抗體目前處于臨床試驗中：Blinatumomab(又 名MT103)是對⑶3和⑶19具有雙特異性。其正在患有晚期復發性非霍奇金淋巴瘤 (non-Hodgkin，s lymphoma，NHL) (Bargou 等，Science321 (2008) ,974-977)的患者中進行 I期臨床試驗，并在患B-前體急性成淋巴細胞白血病（B-precusor acute lymphoblastic leukemia，B-ALL) (Topp 等，Bloodl 12 (2008)，1926)的患者中進行 II 期臨床試驗。所 述的第二種、處于I期臨床試驗階段的BiTE抗體是MT-IlO (Micromet Inc)，其革巴向 泛-癌-相關-抗原（pan-carcinoma-related antigen),上皮細胞黏附分子（EpCAM 或 CD326)和 CD3(fcischwein 等，Mol. Immunol. 43(2006)，1129-1143)。雙特異性抗體 (catumaxumab [ Removab? ];抗CD3和人EpCAM雙特異性）已于2009年在歐洲獲準面世。
[0005] 體外（In vitro)和小鼠模型系統中，雙特異性抗體能通過同時結合⑶3和革巴抗 原連接T-細胞和癌細胞觸發包括細胞毒性顆粒融合以及瞬時細胞因子和粒酶釋放在內的 T-細胞活化。但是，在利用此類雙特異性抗體，例如作為用于人的治療方案的一部分時，大 量T-細胞的活化（不依賴于T-細胞抗原特異性）和/或腫瘤細胞裂解的旁觀者效應，導 致嚴重的問題。
[0006] -種此類的問題是所謂的"細胞因子釋放綜合癥（cytokine release syndrome, CRS)"，其在小鼠模型系統中通常不產生什么效果，但在人中具有災難性的影響 (Suntharalingam 等，The New England Journal of Medicine355(2006) ,1018-1028)。 CRS包括頭痛，肌肉疼痛，惡心，腹瀉，紅斑，血管擴張和低血壓。最嚴重的形式導致肺浸潤， 肺損傷，腎衰竭和彌漫性血管內凝血（Suntharalingam等，The New England Journal of MediCine355 (2006)，1018-1028)。即使CRS與雙特異性抗體的應用無關，也已觀察到施用 雙特異性抗體后的大量其他副作用（超過80%的三級或更高的毒性）（Topp等，Journal of Clinical 0ncology29 (2011) ,2093 - 2098)。這樣的副作用也歸因于T-細胞銜接作用 (engagment)，包括淋巴細胞減少癥，血液化學變化和eurologic癥狀。
[0007] 鑒于雙特異性抗體這種副作用嚴重的狀況，不可能使用長半壽期的抗體設計形 式，因為假如出現CRS，長半壽期是不理想的。
[0008] 因此，本發明的技術問題為提供通過誘導T-細胞介導的免疫應答用于治療惡性 疾病，如起源于上皮、內皮或間皮的癌以及血液癌癥的手段和方法。
[0009] 發明簡述
[0010] 上述通過誘導T-細胞介導的免疫應答治療惡性疾病，如起源于上皮、內皮或間皮 的癌以及血液癌的手段和方法，應當克服已知的基于雙特異性抗體的療法的不利之處。
[0011] 所述技術問題的解決方案通過權利要求中所描述的具體實施方案實現。
[0012] 因此，本發明涉及以非天然地存在于⑶8+T-細胞中和/或⑶8+T-細胞的表面的 標記蛋白對CD8+T-細胞的轉導，以及它們通過雙特異性抗體分子向腫瘤的靶向募集（參 見圖7和21)。在本發明中，所述CD8+T-細胞的轉導可通過下述的反轉錄病毒系統進行。 本發明涉及雙特異性抗體分子，其包含與⑶8+T-細胞上、非天然地存在于⑶8+T-細胞之 中和/或之上的抗原特異結合的第一結合結構域；和與天然地存在于腫瘤細胞表面上的 腫瘤-特異性抗原結合的第二結合結構域，其中，所述的CD8+T-細胞已用非天然地存在 于CD8+T-細胞之中和/或之上的抗原轉導。在本發明的內容中，所述的雙特異性抗體分 子包含與CD8+T-細胞上的抗原特異結合的第一結合結構域，所述的抗原非天然地存在于 CD8+T-細胞之中和/或之上；和與天然地存在于腫瘤細胞表面上的腫瘤-特異性抗原結合 的第二結合結構域，其中，所述的雙特異性抗體分子是（單克隆）抗體分子。如所附加的實 施例所示，作為本發明構思（inventive concept)的證據，構建了雙特異性抗體，其中，所述 的第一結合結構域與（人）EGFR(代表非天然地存在于T-細胞（CD8+T-細胞）之中或之上 的抗原）相互作用/結合，所述的第二結合結構域與EpCAM (代表天然地存在于腫瘤細胞表 面上的腫瘤特異性抗原）相互作用/結合。與對照試驗相比，通過這種雙特異性抗體和表 達del-(人）hEGFR蛋白的經轉導的腫瘤特異性T-細胞（⑶8+T-細胞）結合治療腫瘤，顯著 地延長了小鼠的存活期（參見圖12和14)。因此，出人意料地發現了用非天然地存在于這 些細胞之中和/或表面的抗原（如在所附加的實施例（作為所述構思的證據）中，通過如 5￡0 10勵：12(如由5￡0 10勵：11中所示的〇0嫩序列編碼））中所示的(^1-(人）1^6卩1? 蛋白序列轉導的T-細胞（CD8+T-細胞），可利用雙特異性抗體分子特異性地募集，所述的 雙特異性抗體分子通過其第一結構域（（人）hEGFR)與已被引入到所述T-細胞（⑶8T-細 胞）的、非天然地存在于T-細胞（CD8+T-細胞）之中和/或表面的抗原結合，通過其第二 結合結構域與天然地存在于腫瘤細胞表面上的、腫瘤-特異性抗原（EpCAM)結合。
[0013] 上下文中，所用的術語"雙特異性結合構建體"特指雙特異性抗體分子，其能夠結 合非天然地/內源性地在CD8+T-細胞之中或之上表達的抗原、并能夠誘導靶細胞的排除/ 裂解（經由與，天然地存在于（其是內源性表達的）腫瘤細胞表面的腫瘤-特異性抗原，結 合的第二結合結構域）。通過所述的雙特異性結合構建體（雙特異性抗體分子）與非天然 地存在于⑶8+T-細胞之中和/或之上的抗原結合（例如抗體，抗體衍生物或抗體片段）使 腫瘤特異性T-細胞（CD8+T-細胞）與腫瘤細胞實際接觸（參見圖7和21)。非-轉導的或 內源T-細胞（CD8+T-細胞）不受所述雙特異性結合構建體（雙特異性抗體分子）的影響。 因此，本發明的雙特異性抗體分子具有在體內和/或體外裂解靶細胞的能力。相應的靶細 胞包含表達表面分子的細胞，其被本發明的雙特異性抗體分子的第二（Ig-衍生的）結合結 構域所識別。此類表面分子在下文中進行描述。
[0014] 可利用本領域已知的方法檢測靶細胞的裂解。因此，此類方法包括，特別是體外 生理學測定。此類生理學測定可以是檢測細胞死亡，例如通過喪失細胞膜的完整性（例如 基于FACS的碘化丙錠測定，臺盼藍灌注測定，酶釋放光度測定（LDH)，51Cr釋放輻射測定， 熒光銪釋放和CalceinAM釋放測定）。此外的測定包括細胞生存力監控，例如通過光度 MTT，XTT，WST-I和alamarBlue測定，放射性3H-Thd摻入測定，測量細胞分裂活性的產克隆 測定，測量線粒體跨膜梯度的羅丹明123測定。此外，通過例如基于FACS的磷脂酰絲氨酸曝 光（phosphatidylserin exposure)測定,基于ELISA的TUNEL試驗,胱冬酶活性測定（基 于光度、突光或ELISA)或者分析細胞形態變化（縮小，膜氣泡（membrane blebbing))。
[0015] 在本發明的內容中所用的術語"與……結合"定義至少兩個"抗原_相互作用-位 點"彼此之間的結合（相互作用）。根據本發明，術語"抗原-相互作用-位點"定義與特異 性抗原或特異性抗原組表現出特異相互作用的能力的多肽基序。所述的結合/相互作用也 可以理解為定義"特異性識別"。根據本發明，術語"特異性識別"指所述的抗體構建體能夠 特異性地相互作用于（interacting with)和/或結合于本申請所定義的每一人祀分子的 至少兩個氨基酸。抗體可以識別，相互作用和/或結合相同靶分子上的不同表位。這一術 語涉及抗體分子的特異性，即，涉及其在本申請所定義的人靶分子的特異性區域間進行辨 別的能力。所述抗原-相互作用-位點與其特異性抗原之間的特異性相互作用可能導致信 號引發，例如由于所述抗原的構象改變的誘導，所述抗原的寡聚化等。由此，抗原-相互 作用-位點的氨基酸序列中的特異性基序與抗原彼此結合形成其初級，二級或四級結構， 并導致所述構建體二級修飾。
[0016] 本發明中所使用的術語"特異性相互作用"指本發明的雙特異性結合構建體（雙 特異性抗體分子）不與或基本上不與類似結構的（多）肽交叉反應。因此，本發明所述的 雙特異性構建體特異性地結合于/相互作用于腫瘤標記、細胞表面標記，非天然地存在于 ⑶8+T-細胞之中和/或之上的抗原，并能基于其第二（Ig-衍生的）結構域與特異性的、所 選擇的其他化合物、抗原、細胞-表面標記，天然地存在于腫瘤細胞表面的腫瘤標記等相互 作用。下文中給出所述第一，第二，Ig-衍生的結構域所定向針對的此類分子的具體示例。
[0017] 可以對在研究中的構建體組（panel)的交叉反應性進行測定，例如，通過評估在 常規條件（參見，例如Harlow and Lane,抗體：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988) and Using 抗體：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1999))下，所述雙特異性抗體構建體組與所述所關注的（多）肽以 及一些或多或少在（結構和/或功能）密切相關的（多）肽之間的結合。只有那些與所關 注的（多）肽/蛋白質結合、但不與或基本上不與任何與所關注的（多）肽相同的組織，例 如由腫瘤組織的細胞，表達的其他（多）肽結合的構建體（即，抗體，（雙特異性）scFvs等 等）被認為是特異于所關注的（多）肽/蛋白質，其被選擇出來用于在本申請所提供的方 法中進一步研究。這些方法可以包括，特別是，與結構和/或功能密切相關的分子的結合研 究，阻斷以及競爭研究。這些結合研究還包括FACS分析，表面等離振子共振（SPR，例如與 BIAcore)，分析超速離心，等溫線滴定量熱學，熒光各向異性，熒光光譜學或通過放射性 同位素標記的配體結合測定。此外，也可以應用生理學測定，如細胞毒性測定以及上述提及 的測定。因此，抗原-相互作用-位點與特異性抗原的特異性相互作用示例可以包括所述 配體對于其受體的特異性。所述的定義特別地包括配體一旦與其特異性受體結合誘導信號 的相互作用。相應的配體的示例包括細胞因子，其與特異性的細胞因子-受體相互作用/與 與特異性的細胞因子-受體結合/結合于其特異性的細胞因子-受體。還特別地包含于所 述定義中的是抗原-相互作用-位點與抗原，如選凝素家族，整聯蛋白以及EGF之類的生 長因子家族的抗原，之間的結合。所述相互作用的另一示例，其也特別包含于所述定義中， 是抗原決定簇（表位）與抗體的抗原性結合位點之間的相互作用。
[0018] 術語"結合于"并不僅僅涉及線性表位，也涉及構象表位，結構表位，或由人靶分 子或其部分的兩個區域組成的不連續的表位。在本發明的內容中，構象表位是由在初級結 構中相分離的兩個或以上分立的（discrete)、在所述多肽折疊成其天然的蛋白質時聚攏 (come together)在所述分子表面的氛基酸序列定義的（Sela, Sciencel66 (1969)，1365and Laver, Cell61 (1990)，553-536)。再有，術語"結合于"在本發明的內容中可以與術語與…… 相互作用"互換使用。
[0019] 因此，特異性可通過本領域已知的方法以及本申請中所描述的方法實驗確定。此 類方法包括，但不限于，Western Blots, ELISA-，RIA-，ECL-，IRMA-試驗，以及肽掃描。
[0020] 術語（Ig-衍生的）"第一結合結構域"涉及"免疫球蛋白-衍生的結構域"，具體 涉及抗體或其片段，單鏈抗體，合成抗體，抗體片段，如Fab，F (ab2) '，Fv或SCFv片段等，或 上述任何抗體或片段經化學修飾的衍生物。這些抗體分子可由不同的種類衍生，或者可以 是嵌合來源的。在本發明的內容中（如所附加的實施例所示例性描述的），所述的（Ig-衍生 的）、包含在本發明的雙特異性抗體分子中的第一結構域可以是，與第二（Ig-衍生的）"結 合結構域"融合的（單克隆）抗體。
[0021] 術語（Ig-衍生的）"第二結合結構域"涉及免疫球蛋白_衍生的結構域。具體涉 及抗體或其片段，單鏈抗體，合成抗體，抗體片段，如Fab, F (ab2) '，Fv或scFv片段等，或上 述任何抗體或片段經化學修飾的衍生物。這些抗體分子可由不同的種類衍生，或者可以是 嵌合來源的。在本發明的內容中（如所附加的實施例所示例性描述的），所述的（Ig-衍生 的）、包含在本發明的雙特異性抗體分子中的第二結構域可以是scFv。
[0022] 本發明的雙特異性抗體分子是（單克隆）雙特異性抗體，其對至少兩 個不同的位點具有結合特異性，并可以是任何涉及形式。不久之前，已經開發 出了多種多樣的重組抗體設計形式，例如二價的、三價的或四價的雙特異性抗 體。示例包括，IgG抗體設計形式和單鏈結構域（針對不同的設計形式，參見 例如 Coloma,M.J?，等，Nature Biotechl5 (1997),159-163 ;W02001/077342; Morrison,S.L. , Nature Biotech25 (2007), 1233-1234 ；Holliger, P. , et. al, Nature Biotech.23(2005), 1126-1136 ；Fischer, N. ,and Leger,0.,Pathobiology74(2007) ，3-14 ;Shen, J.，et. al.，J. Immunol. Methods318 (2007)，65-74 ;Wu, C.,等，Nature Biotech. 25(2007),1290-1297)的融合。此處所述的雙特異性抗體或片段還包括TO 2009/080251 ；W0 2009/080252 ；W0 2009/080253 ；W0 2009/080254 ；W0 2010/112193 ；W0 2010/115589 ;W0 2010/136172 ;W0 2010/145792 ;W0 2010/145793 以及 TO 2011/117330 中所描述的二價的、三價、或四價的雙特異性抗體。
[0023] 本發明的"抗體"具有兩個或以上的結合結構域并且是雙特異性的。也就是說，所 述的抗體可能是雙特異性，即使在有兩個以上結合結構域的情況下（即，所述的抗體是三 價的或多價的）。本發明的雙特異性抗體包括，例如，多價單鏈抗體，雙抗體，三鏈抗體，以及 具有全長抗體的恒定結構域的抗體，其中抗原-結合結構域（例如單鏈Fv，a VH結構域和 /或VL結構域，Fab，或（Fab) 2，）通過一個或以上的肽接頭與所述全長抗體的恒定區結構 域連接。所述的抗體可以是來自單一種類的全長的，或嵌合的或人源化的抗體。對于具有 兩個或以上抗原結合結構域的抗體，一些結合結構域可以是同一的，只要所述的蛋白質具 有針對兩個不同抗原的結合結構域即可。
[0024] 本申請中所用的術語"價"代表在抗體分子中存在的結合結構域的具體數量。例 如，術語"二價"，"四價"，和"六價"分別代表在抗體分子中存在兩個結合結構域，四個結 合結構域，和六個結合結構域。本發明所述的雙特異性抗體至少是"二價的"，也可以是"三 價的"或"多價的"（例如"四價"或"六價"）。優選地，本發明的雙特異性抗體是二價的， 三價的，或四價的。據此，在本發明的內容中，所述的雙特異性抗體是二價的。在本發明的 內容中，所述雙特異性抗體是三價的。在本發明的內容中，所述的雙特異性抗體是四價的。
[0025] 如上所述（以及在圖1中示例性描述的），本發明的雙特異性抗體分子，最優選地， 包含（Ig-衍生的）第二結構域，其可以是scFv。由此，在本發明的示例性具體實施方案中， 作為構思的證據，提供了雙特異性抗體分子，其具有一個針對（人）EGFR(經由第一結合結 構域）的特異性，并且還有另一個特異性，該特異性通過第二scFv介導、定向針對另外的分 子/化合物或能夠與之相互作用。這些另外的分子/化合物可包括細胞表面分子，腫瘤標 記，腫瘤抗原等等。此類另外的分子/化合物在下文中舉例說明。
[0026] 因此，在本發明的內容中，雙特異性結合分子可能涉及包含兩個抗體衍生的結合 結構域的抗體分子，其中，一個結合結構域可以是scFv。所述的結合結構域之一由抗體的可 變區（或其部分），抗體片段或其衍生物組成，能夠特異性地結合于/相互作用于非天然地 存在于CD8+T-細胞（如下文中所定義的）之中和/或之上的（人）靶分子1。所述第二結 合結構域由抗體的可變區（或其部分），抗體片段或其衍生物組成，能特異性地結合于/相 互作用于如下文中所定義的另外的（人）抗原（靶分子2)。因此根據本發明，所述的第二 結合結構域是如上所述的（Ig-衍生的）第二結構域，其包含對天然地存在于腫瘤細胞表面 上的細胞表面分子或天然地存在于腫瘤細胞表面上的腫瘤特異性標記（抗原）具有特異性 的、特異性抗原-相互作用-位點。所述雙特異性抗體分子中的兩個結構域/區域，優選地 彼此間共價相連。這種連接可以是直接的作用（結構域1 [對于非天然地存在于CD8+T-細 胞之中或之上的（人）靶分子1具有特異性，其包含上述定義的CDR-區或CDR-區和框架 區]-結構域2 [對細胞表面分子和/或腫瘤特異性標記具有特異性]或結構域1 [對于細 胞表面分子和/或腫瘤特異性標記具有特異性]-結構域2 [對非天然地存在于⑶8+T-細 胞之中和/或之上的（人）靶分子1具有特異性，其包含如上述定義的CDR-區或CDR-區 和框架區])，或者是通過附加的多肽接頭序列（結構域1-接頭序列-結構域2)。在使 用接頭的情況下，在本發明的內容中，接頭的長度和序列要足以保證所述第一和第二結構 域中的每一個，彼此間獨立地保持它們不同的結合特異性。在本發明的內容中，所述附加的 多肽接頭序列也可以是抗體自身的片段，其可以是，例如Fc部分，或者一個或以上的抗體 恒定區結構域。
[0027] 在本發明的內容中，結合結構域1也可以是抗體臂1的一部分，結合結構域2也可 以是抗體臂2的一部分，反之亦然，其中所述的兩個抗體臂通過界面（interface)相連。所 述的抗體臂1由抗體的可變區（或其部分），抗體片段或其衍生物組成，能夠特異性地結合 于/相互作用于非天然地存在于如下述定義的CD8+T-細胞之中或之上的（人）靶分子1。 所述的抗體臂2由抗體的可變區（或其部分），抗體片段或其衍生物組成，能夠特異性地結 合于/相互作用于天然地存在于腫瘤細胞表面上的細胞表面分子或天然地存在于腫瘤細 胞表面上的腫瘤特異性抗原。所述的"界面"包含第一抗體臂中的那些接觸氨基酸殘基（或 其他非_氨基酸基團，例如碳水化合物基團），其與所述第二抗體臂中的一個或以上"接觸" 氨基酸殘基（或其他非-氨基酸基團）相互作用。優選的界面是免疫球蛋白結構域，如抗體 重鏈的恒定結構域（或其中的區域），其中，所述經由界面的結合/相互作用使得所述的兩 個抗體臂異源二聚體化（參見例如 Ridgway, J. B?，等，Protein Eng. 9 (1996)，617-621 ;W0 96/027011 !Merchant, A. M?，等，Nature Biotech. 16 (1998)，677-681 ;Atwell, S.，等，J. Mol.Biol. 270(1997), 26 - 35 ；EP I 870 459 Al ；W0 2007/147901 ；W0 2009/089004(Al) 和 TO 2010/129304)。
[0028] 應用于本發明的抗體，抗體構建體，雙特異性抗體分子，抗體片段，抗體衍生物 (均由Ig-衍生），或它們相應的免疫球蛋白鏈，可通過本領域已知的常規技術進行修飾，例 如，利用氨基酸缺失，插入，取代，添加，和/或重組和/或任何本領域已知的其他單獨的 或組合的修飾方式。向免疫球蛋白氨基酸序列的相應DNA序列中引入此類修飾方法是本領 域普通技術人員公知的；參見，例如以上所引用的Sambrook(1989)。術語"Ig-衍生的結構 域"，具體涉及包含至少一個CDR的（多）肽構建體。所述的Ig-衍生的結構域的片段或衍 生物界定（多）肽，其是上述抗體分子的部分和/或它們通過化學/生物化學或分子生物 學方法修飾的形式。所述的方法是本領域已知的特別是在實驗室操作手冊中有描述（參見 Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual ;Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd edition(1989)and3rd edition (2001) ;Gerhardt 等，Methods for General and Molecular Bacteriology ASM Press (1994) ；Lefkovits,Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques ；Academic Press (1997)； Golemis, Protein-Protein interactions:A Molecular Cloning Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press (2002))〇
[0029] 本申請所用的術語"⑶R"指"互補決定區"，其是本領域公知的。所述的⑶R是 免疫球蛋白的部分，其決定所述分子的特異性，并與特異性的配體相接觸。CDR是所述分 子中可變性最高的區域，是這些分子多樣性的基礎。在每個V結構域中有三種CDR區， ⑶Rl,⑶R2和⑶R3。⑶R-H表示可變重鏈的⑶R區，⑶R-L指可變輕鏈的⑶R區。VH指可 變重鏈，VL指可變輕鏈。Ig-衍生區域的CDR區可如Kabat "Sequences of Proteins of Immunological Interest"，5th edit. NIH Publication no.91-3242U. S. Department of Health and Human Services (1991) ；Chothia J. Mol. Biol. 196(1987), 901-917or Chothia Nature342 (1989)，877-883中所描述的進行確定。
[0030] 因此，在本發明的內容中，所述的抗體分子，諸如上述的雙特異性抗體，選自：完全 抗體（免疫球蛋白，諸如 IgGl，IgG2, IgG2b，IgG3, IgG4, IgA，IgM，IgD 或 IgE)，F(ab)-，Fa b'-SH-，Fv-，Fab'-，F(ab'）2-片段，嵌合抗體，CDR-移植抗體，完全人抗體，二價抗體-構建 體，抗體-融合蛋白，合成抗體，二價單鏈抗體，三價單鏈抗體和多價單鏈抗體。
[0031] 本申請中所用的術語"完全-人抗體"指僅包含人免疫球蛋白的蛋白質序列的抗 體。如果是在小鼠中，或在小鼠細胞中，或衍生自小鼠細胞的雜交瘤中制備的完全人抗體， 可能包含鼠碳水化合物鏈。類似地，"小鼠抗體"或"鼠抗體"指僅包含小鼠（鼠）免疫球蛋 白蛋白質序列的抗體。另外，如果是在大鼠中，在大鼠細胞中，或在衍生自大鼠細胞的雜交 瘤中制備的"完全人抗體"，可能包含大鼠碳水化合物鏈。類似地，術語"大鼠抗體"指僅包 含大鼠免疫球蛋白序列的抗體。制備完全-人抗體可通過，例如，噬菌體展示，其是被廣泛 應用的篩選技術，能用來生產以及篩選完全人抗體。噬菌體抗體也可以用于本發明。噬菌 體展示方法在，例如US 5, 403, 484, US 5, 969, 108和US 5, 885, 793中有描述。另一種能研 發完全-人抗體的技術涉及對小鼠雜交瘤技術的修飾。通過轉基因制備包含人免疫球蛋白 基因組，以替代其自身的小鼠基因的小鼠（參見，例如，US 5, 877, 397)。
[0032] 本申請所用的術語抗體也包含嵌合抗體。術語"嵌合抗體"指包含與來自另一種 人或非-人種（例如小鼠，馬，兔，狗，牛，雞）的抗體區域（例如恒定區）融合或嵌合的人 或非-人種的可變區的抗體。
[0033] 術語抗體也指重組的人抗體，異種抗體和異雜合抗體。術語"重組的人抗體"包括 通過重組的手段制備、表達、創建或分離的全部人序列抗體，如由人免疫球蛋白基因轉基因 的動物（例如小鼠）分離的抗體；利用轉染進入宿主細胞的重組表達載體表達的抗體，由重 組組合人抗體文庫分離的抗體，通過涉及將人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的 任何其他手段制備、表達、創建或分離的抗體。此類重組的人抗體具有衍生自人種系免疫球 蛋白序列的可變和恒定區（如果存在的話）。但是，可以對此類抗體進行體外誘變（或者當 使用人Ig序列轉基因的動物時，體內體細胞誘變），由此重組抗體的VH和VL區的氨基酸序 列雖然是衍生自人種系VH和VL序列且與其相關，但是并非天然地存在于人抗體種系體內 所有組成成分（repertoire)之中。
[0034] "異種抗體"是相對于涉及生產所述抗體的轉基因非-人生物體定義的。該術語指 具有不是在所述轉基因非-人動物生物體中的，而通常是來自所述轉基因非-人動物之外 的種類的氨基酸序列或其編碼核酸序列的抗體。
[0035] 術語"異雜合抗體"指具有不同的生物來源的輕鏈和重鏈的抗體，例如，具有與鼠 輕鏈相關聯的人重鏈的抗體是異雜合抗體。異雜合抗體的示例包括嵌合的和人源化的抗 體。
[0036] 術語抗體還指人源化抗體。非-人（例如鼠或兔）抗體的"人源化"形式是嵌合 免疫球蛋白，免疫球蛋白鏈或其片段（如Fv，Fab，Fab'，F (ab'）2或抗體的其他抗原-結合 序列），其包含最低限度的衍生自非_人免疫球蛋白的序列。常見地，人源化抗體是人免疫 球蛋白（受體抗體），其中來自受體的互補決定區（CDR)的殘基被具有所需特異性，親和力 以及能力的、來自非-人種類（供體抗體）如小鼠，大鼠或兔的CDR的殘基替代。有些情 況下，人免疫球蛋白的Fv框架殘基被相應的非-人殘基替代。此外，人源化抗體可包括既 不是受體抗體中的殘基，也不是被引入的CDR或框架序列中的殘基。進行這些修飾使得抗 體的性能被進一步地改善并優化。一般而言，所述的人源化抗體基本上包含至少一個，典型 地是兩個可變結構域的全部，全部或基本上全部的CDR區相應于非-人免疫球蛋白中的那 些區域，全部或基本上全部的FR區是人免疫球蛋白共有序列中的那些區域。所述人源化 抗體還可以包括至少一部分免疫球蛋白恒定區（Fe)，特別是人免疫球蛋白的恒定區。更詳 細的內容請參見：J〇nesNature321 (1986)，522-525 ;Reichmann Nature332 (1998)，323-327 和 Presta Curr Op Struct Biol2 (1992) ,593-596。
[0037] 通常使用的抗體人源化方法包括⑶R移植（grafting)，其中，來自非-人'供體' 抗體的功能性抗原-結合位點被移植到人'受體'抗體。CDR移植方法是本領域已知的，并 在例如US 5, 225, 539, US 5, 693, 761和US 6, 407, 213中有描述。另一種相關的方法是由 轉基因動物生產人源化抗體，所述的轉基因動物經遺傳工程化以包含一個或以上能夠進行 基因重排和基因轉變的人源化免疫球蛋白基因座（參見，例如US 7, 129, 084)。
[0038] 因此，在本發明的內容中，術語"抗體"涉及完整的免疫球蛋白分子以及這種免疫 球蛋白分子的部分。另外，如上所述，該術語涉及經修飾的和/或經改變的抗體分子。該 術語也涉及通過重組或合成的方式產生/合成的抗體。這一術語也指完整抗體（intact antibody)以及其抗體片段，諸如經分離的輕鏈和重鏈，Fab，Fab/c，Fv，Fab'，F(ab'）2。術 語"抗體"也包含雙功能抗體，三功能抗體，完全-人抗體，嵌合抗體，人源化抗體和抗體構 建體，諸如單鏈Fvs (scFv)或抗體-融合蛋白。
[0039] 在本發明的內容中，"單鏈Fvs"或"scFv"抗體片段具有抗體的V1^P八結構 域，其中，這些結構域存在于單一的多肽鏈中。一般而言，scFv多肽還包括Vh和八結構域 之間的多肽接頭，其使得scFv形成抗原結合所需的結構。生產單鏈抗體的技術在，例如 Pliickthun 的 The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Rosenburg和 Moore eds. Springer-Verlag，N.Y. 113(1994),269-315 中有描述。
[0040] 本發明中所使用的"Fab片段"包含一條輕鏈以及重鏈的CH1和可變區。Fab分子 的重鏈不能與另一重鏈分子形成二硫鍵。
[0041] "Fc"區包含抗體CH2和CH3結構域的兩個重鏈片段。所述的兩個重鏈片段通過兩 個或以上的二硫鍵以及CH3結構域的疏水相互作用保持在一起。
[0042] "Fab'片段"包含一條輕鏈以及一條重鏈的一部分，所述重鏈部分包含Vh結構域， ChI結構域以及ChI和CH2結構域之間的區域，由此，可以在Fab'片段的兩重鏈之間形成鏈 間二硫鍵，以形成F (ab'）2分子。
[0043] "F(ab'）2片段"包含兩條輕鏈和兩條重鏈，其中的重鏈包含C0I和CH2結構域之間 的恒定區的一部分，由此在上述兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵。F(ab'）2片段由兩個Fab' 片段組成，所述兩個Fab'片段通過兩條重鏈間的二硫鍵保持在一起。
[0044] "Fv區"包含來自重鏈和輕鏈的可變區，但缺乏恒定區。
[0045] 值得注意的是，本發明的雙特異性抗體分子可能包含，除此處所定義的第一 (Ig-衍生的）結構域和（Ig-衍生的）第二結構域之外的附加的結構域，例如用于通過重組 方式生產的構建體的分離和/或制備。
[0046] 應當注意的是，根據本發明，不僅是以上描述的本發明的分子或構建體（S卩，本 申請所述的雙特異性抗體分子）的第一結構域可以被修飾，所述第一結構域特異性地與 ⑶8+T-細胞上的、非天然地存在于⑶8+T-細胞之中和/或之上（人）的抗原相互作用/ 結合。也可以預計，（Ig-衍生的）第一結構域，（Ig-衍生的）第二結構域和/或連接接 頭-區，被修飾，例如人源化抗體，CDR移植抗體或完全人抗體。
[0047] "人源化方式"是本領域公知的，特別是有關抗體分子，例如Ig-衍生的分子的描 述。術語"人源化的"指非-人（例如鼠）抗體的、或其片段（如Fv，Fab，Fab'，F(ab'），SCFv S或抗體的其他抗原-結合部分序列）的人源化形式，所述的片段包含有衍生自非-人抗體 的序列的一些部分。人源化抗體包括人免疫球蛋白，其中來自人免疫球蛋白互補決定區 (CDR)的殘基被具有所需特異性，親和力以及能力的、來自非-人種如小鼠，大鼠或兔的 CDR的殘基替代。通常，人源化抗體基本上包含至少一個，通常是兩個可變結構域的全部， 其中，全部或基本上全部的CDR區相應于非-人免疫球蛋白中的那些區域，全部或基本上全 部的FR區是人免疫球蛋白共有序列中的那些區域。所述人源化抗體還可以包括至少一部 分免疫球蛋白恒定區（Fe)，最佳地，人免疫球蛋白的恒定區；具體參見，尤其是，Jones等，N ature321 (1986)，522-525, Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 (1992)，593-596。非-人抗體 的人源化方法是本領域公知的。通常，人源化抗體具有一個或以上被引入其中的非-人來 源的氨基酸，但其仍然保持其固有的抗體結合活性。有關抗體/抗體分子人源化的方法， 在 Jones 等，Nature321 (1986) ,522-525 ;Reichmann 等，Nature332(1988) ,323-327 ;和 Verhoeyen等，Science239 (1988)，1534-1536中有更詳細的描述。人源化抗體的具體示例， 例如定向針對EpCAM的抗體是本領域已知的，參見例如（LoBuglio, Proceedings of the American Society of Clinical Oncology Abstract(1997)，1562and Khor, Proceedings of the American Society of Clinical Oncology Abstract (1997)，847)〇 [0048] 在本發明的內容中特別提供了雙特異性抗體分子，其是人源化的并可以被成功地 應用于藥物組合物。在本發明的內容中，所述的（人源化的）雙特異性抗體分子可應用于 下述的試劑盒中。
[0049] 在本發明的內容中，所述雙特異性抗體分子的（Ig-衍生的）第一結構域包含對非 天然地存在于CD8+T-細胞之中和/或之上的抗原具有特異性的抗原-相互作用-位點。
[0050] 所用的術語"非天然地存在于⑶8+T-細胞之中和/或之上的抗原"指摻入到 ⑶8+T-細胞中的分子，其天然狀態下不存在于⑶8+T-細胞之中和/或⑶8+T-細胞表面上， 并且非（內源性地）在（非-轉導的）CD8+T-細胞之中或之上表達。因此，非天然地存在于 ⑶8+T-細胞之中和/或之上的抗原/標記是通過人工的方式引入到⑶8+T細胞中的。在本 發明的內容中，所述的CD8+T-細胞是由本申請所定義的待治療的受試者分離/獲取的。在 本發明的內容中，天然地存在于/內源性地表達于⑶8+T-細胞的T-細胞受體的抗原肽從 上述術語"非天然地存在于CD8+T-細胞上的抗原"中被排除。因此，這些通過人工方式引 入并隨后呈現于所述⑶8+T-細胞之中和/或所述⑶8+T-細胞表面上的分子包含能夠接近 (體外或體內）（Ig-衍生的）結合結構域，優選抗體，抗體的片段或衍生物的結構域或表位， 其非天然地存在于CD8+T-細胞之中和/或之上。在本發明的內容中，如下文中所述，這些 人工方式引入的分子是在（反轉錄病毒）轉導后呈現在⑶8+T-細胞之中和/或⑶8+T-細 胞表面上的。
[0051] 在本發明的內容中，術語"非天然地存在于⑶8+T-細胞之中和/或之上的抗 原"指具有高于 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 或 1000 抗原分子 / 每個 CD8+T-細胞的、非天然地存在于/非內源性地表達于CD8+T-細胞之中和/或之上的抗原/ 標記。由此，所述的抗原/標記不以高于1. 0, 1. 1，1. 2, 1. 3, 1. 4, 1. 5, 1. 6, 1. 7, 1. 8, 1. 9或 S-OcVcitl(Promille)存在于/內源性地表達于正常的（非-轉導的）⑶8+T-細胞群細胞之中 和/或之上。所述天然地存在于CD8+T-細胞之中和/或之上的抗原/標記的存在和數量 可通過本領域已知的方法，如FACS分析，ELISA，共焦顯微術，分析HPLC等等，監控。
[0052] 這些分子的示例包括非-免疫源性的蛋白質，優選人來源的。換言之，所述的分 子可能或者其本身是功能上惰性的蛋白質分子，或將通過本領域已知的基因重組技術成為 功能上惰性的（示例可以是缺失了細胞內信號結構域的蛋白質分子（如所附加的實施例 中所說明的，通過沒有細胞內信號結構域的（人）EGFR，指本申請中所述的del-hEGFR構 建體（SEQ ID NOs: 11和12))或胞外結構域的失活點突變使得所述的分子成為功能上惰 性的）。突變的（人）EGFR形式（version)的另一個示例是所附加的實施例中所使用的 (^1-1^?1^111構建體（5￡〇10勵：17所示的0嫩，5￡〇10勵：18所示的（編碼的）氨基酸 序列）。hEGFRvIII是在膠質母細胞瘤和乳腺癌，卵巢癌和肺癌中發現的人表皮生長因子受 體的突變體。所述突變體的受體在其胞外結構域中有缺失（Lorimer等，Proc. Natl. Acad. Sci USA93:14815-14820(1996))。
[0053] 下文中給出了符合上述標準的標記的示例，其包括但不限于cripto (隱蔽家族蛋 白(cryptic family protein))，CD (分化族（cluster of differentiation))-家方矣（非 T-細胞）的成員，EGFR或TSH-R。
[0054] 在本發明的內容中所描述的雙特異性抗體分子與非天然地存在于CD8+T-細胞之 中和/或之上的抗原結合，所述抗原選自cripto (隱蔽家族蛋白），CD (分化簇）-家族（非 T-細胞）的成員，EGFR和TSH-R。由此本申請所述的雙特異性抗體分子與（排他地）不是天 然地存在于T-細胞（CD8+T-細胞）（如術語"非T-細胞"所稱的）之中和/或之上CD-家 族的成員，cripto, EGFR或TSH-R(排他地）相互作用/結合。在本發明的內容中，所述的 雙特異性抗體分子與非內源性的在T-細胞（CD8+T-細胞）（如術語"非T-細胞"所稱的） 之中和/或之上表達的⑶-家族的成員，cripto, EGFR或TSH-R相互作用/結合。
[0055] (人）cripto(隱蔽家族蛋白）成員，CD(分化簇）_家族（非T-細胞）家族成 員，EGFR或TSH-R的氨基酸序列可獲自UniProtKB/Swiss-Prot數據庫并可在http: //www. uniDrot.org/uniprot/? auery = reviewed% 3Ayes 找至丨丨。這些（蛋白質）序列也涉及 經注釋的修飾序列。本發明還提供技術和方法，其中用到本申請中的簡明序列（concise sequences)的同源序列、遺傳等位基因變體（genetic allelic variants)等等。優選地， 使用所述簡明序列的"變體"等等。優選地，此類"變體"是遺傳變體。本領域技術人員能 夠容易地推斷出這些數據庫條目（entries)中的這些（蛋白質）序列的相關編碼區，所述 的數據庫還可能包括基因組DNA以及mRNA/cDNA的條目。
[0056] 本申請中所用的、與"非天然地存在于⑶8+T-細胞/非內源性地在⑶8+T-細胞之 中和/或之上表達的抗原"相關的術語"CD (分化簇）-家族（非T-細胞）"指選自下組的
【權利要求】
1. 試劑盒，其包括： (A) 雙特異性抗體分子，其包含： (i) 與CD8+T-細胞上的抗原結合的第一結合結構域，所述的抗原非天然地存在于 ⑶8+T-細胞之中或之上；和 (ii) 與天然地存在于腫瘤細胞表面上的腫瘤-特異性抗原結合的第二結合結構域；和 (B) 用非天然地存在于所述⑶8+T-細胞之中或之上的抗原轉導獲自待治療的受試者 的⑶8+T-細胞所需的材料。
2. 權利要求1的試劑盒，其中，所述轉導CD8+T-細胞所需的材料是編碼非天然地存在 于所述⑶8+T-細胞之中或之上的抗原的核酸。
3. 雙特異性抗體分子，其包含： (i) 與CD8+T-細胞上的抗原結合的第一結合結構域，所述的抗原非天然地存在于 ⑶8+T-細胞之中或之上；和 (ii) 與天然地存在于腫瘤細胞表面上的腫瘤-特異性抗原結合的第二結合結構域 用作藥物（medicament)，其中，所述的雙特異性抗體分子在施用來自所述受試者的、經 轉導的⑶8+T-細胞之前、同時或之后施用，所述的⑶8+T-細胞包含非天然地存在于⑶8+T 細胞之中或之上的抗原。
4. 藥物組合物，其包含雙特異性抗體分子，所述的雙特異性抗體分子包含： (i) 與CD8+T-細胞上的抗原結合的第一結合結構域，所述的抗原非天然地存在于 ⑶8+T-細胞之中或之上；和 (ii) 與天然地存在于腫瘤細胞表面上的腫瘤-特異性抗原結合的第二結合結構域 其與包含非天然地存在于CD8+T細胞之中或之上的抗原的、經轉導的CD8+T-細胞結合 施用，其中，所述的雙特異性抗體分子在施用所述經轉導的CD8+T-細胞之前、同時或之后 施用，并且所述的CD8+T-細胞由待治療的受試者獲得。
5. 雙特異性抗體分子，其包含： (i) 與CD8+T-細胞上的抗原結合的第一結合結構域，所述的抗原非天然地存在于 ⑶8+T-細胞之中或之上；和 (ii) 與天然地存在于腫瘤細胞表面上的腫瘤-特異性抗原結合的第二結合結構域 用于治療惡性疾病（malignantdisease)的方法，其中，所述的雙特異性抗體分子在施 用包含非天然地存在于CD8+T細胞之中或之上的抗原的、經轉導的CD8+T-細胞之前、同時 或之后施用，并且所述的CD8+T-細胞由待治療的受試者獲得。
6. 惡性疾病治療方法，所述方法包括向所需受試者施用雙特異性抗體分子，所述的雙 特異性抗體分子包含： (i) 與CD8+T-細胞上的抗原結合的第一結合結構域，所述的抗原非天然地存在于 ⑶8+T-細胞之中或之上；和 (ii) 與天然地存在于腫瘤細胞表面上的腫瘤-特異性抗原結合的第二結合結構域， 其中，所述的雙特異性抗體分子在施用來自所述受試者的經轉導的CD8+T-細胞之前、 同時或之后施用，所述的CD8+T-細胞包含非天然地存在于CD8+T細胞之中或之上的抗原。
7. 權利要求5的雙特異性抗體，或權利要求6的方法，其中，所述的惡性疾病選自：起 源于上皮、內皮或間皮的癌以及血液癌癥。
8. 權利要求1或2的試劑盒，權利要求4的藥物組合物，權利要求3、5或7任一項的 雙特異性抗體分子，或權利要求6或7的方法，其中，所述的雙特異性抗體分子選自：完全抗 體，F(ab)_，Fab' -SH-，Fv_，Fab' _，F(ab'）2-片段，嵌合抗體，CDR-移植抗體，完全人抗體， 二價抗體-構建體，抗體-融合蛋白，合成抗體，二價抗體，三價抗體，四價抗體，二價單鏈抗 體，三價單鏈抗體和多價單鏈抗體。
9. 權利要求1、2或8的試劑盒，權利要求4或8的藥物組合物，權利要求3、5、7或8的 雙特異性抗體分子，或權利要求6-8任一項的方法，其中所述的非天然地存在于CD8+T-細 胞之中或之上的抗原選自：cripto(隱秘家族蛋白（crypticfamilyprotein))，CD(分化 族（clusterofdifferentiation))-家族（非T_ 細胞）成員，EGFR和TSH-R。
10. 權利要求1，2, 8或9的試劑盒，權利要求4,8或9的藥物組合物，權利要求3、5或 7-9中任一項的雙特異性抗體分子，或權利要求6-9中任一項的方法，其中，所述的天然地 存在于腫瘤細胞表面上的抗原選自：EpCAM，HER-1，HER-2,HER-3,CD20,CD22,CD33,CD52,C A-12-5,HLA-DR，MUC-1 (黏蛋白），A33-抗原，PSMA(前列腺特異性膜抗原），運鐵蛋白-受 體，生腱蛋白和CA-IX。
11. 權利要求1，2或8-10中任一項的試劑盒，權利要求4或8-10中任一項的藥物組 合物，權利要求3、5或7-10中任一項的雙特異性抗體分子，或權利要求6-10中任一項的方 法，其中，所述的第一結構域和/或第二結合結構域是人的和/或人源化的。
12. 權利要求1，2或8-11中任一項的試劑盒，權利要求4或8-11中任一項的藥物組 合物，權利要求3、5或7-11中任一項的雙特異性抗體分子，或權利要求6-11中任一項的方 法，其中，所述經轉導的⑶8+T-細胞還包括天然地存在于所述T-細胞上的T-細胞受體和 /或通過基因工程引入所述T-細胞的T-細胞受體。
13. 權利要求1，2或8-12中任一項的試劑盒，權利要求4或8-12中任一項的藥物組 合物，權利要求3、5或7-12中任一項的雙特異性抗體分子，或權利要求6-12中任一項的方 法，其中，所述的雙特異性抗體分子由核酸序列編碼。
14. 載體，其包含權利要求13的核酸序列。
15. 權利要求14的載體，其中，所述的載體還包括與權利要求13的核酸序列可操作連 接的調節序列。
16. 權利要求14或權利要求15的載體，其中，所述的載體是表達載體。
17. 用權利要求14-16中任一項所定義的載體轉化的宿主細胞。
18. 用于生產權利要求1-11中任一項所定義的雙特異性抗體分子的方法，所述方法包 括： (a) 在允許如權利要求1-11中任一項所定義的雙特異性抗體分子表達的條件下，培養 權利要求17所定義的宿主細胞；和 (b) 從所述的培養物中回收所產生的雙特異性抗體分子。
19. 權利要求1-11中任一項所定義的雙特異性抗體分子，其包含： (i) 與CD8+T-細胞上的抗原結合的第一結合結構域，所述的抗原非天然地存在于 ⑶8+T-細胞之中或之上；和 (ii) 與天然地存在于腫瘤細胞表面上的腫瘤-特異性抗原結合的第二結合結構域， 其中，所述的抗體分子由權利要求18的方法生產。
20. 在受試者中治療疾病的方法，其包括下述步驟： (a) 由受試者分離CD8+T-細胞； (b) 如上述權利要求1-11中任一項所述，用非天然地存在于所述⑶8+T-細胞之中和/ 或之上的抗原轉導上述分離的⑶8+T-細胞；和 (c) 將所述經轉導的CD8+T-細胞施用于所述受試者。
21. 權利要求20的方法，其中，所述經轉導的CD8+T-細胞通過靜脈輸注施用于所述受 試者。
22. 權利要求20或21的方法，其中，所述經轉導的CD8+T-細胞與T-細胞受體共-轉 導。
23. 權利要求20-22任一項的方法，其中，所述經轉導的⑶8+T-細胞通過抗-⑶3和 抗-⑶28抗體擴增。
24. 權利要求23的方法，其中，所述經轉導的CD8+T-細胞的擴增在細胞因子，優選白介 素-2(IL-2)和/或白介素-15(IL-15)存在下進行。
25. 權利要求20-24任一項的方法，其還包括： (d) 將權利要求1-11或19中任一項所定義的雙特異性抗體分子施用于所述受試者。
26. 權利要求20-25中任一項的疾病治療方法，其中，所述的雙特異性抗體在所述經轉 導的CD8+T-細胞施用之前、同時或之后施用。
27. 權利要求20-26中任一項的疾病治療方法，其中，所述的疾病是惡性疾病。
28. 權利要求27的治療方法，其中，所述的惡性疾病選自起源于上皮、內皮或間皮的癌 以及血液癌癥。
【文檔編號】C07K16/30GK104379601SQ201380016362
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年1月24日 優先權日:2012年2月3日
【發明者】C.布爾奎因, R.卡斯托爾蒂, S.恩德雷斯, C.克萊恩, S.科博爾德, G.尼德菲爾納, C.蘇斯特曼 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司, 慕尼黑路德韋格馬克西米利安斯大學