一種制備豬源干擾素-λ3的方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種制備豬源干擾素-λ3（IFN-λ3）蛋白的方法和應用，屬于基因工程產品制備領域。包括編碼豬源干擾素-λ3基因的克隆，含不包括信號肽序列的豬源干擾素-λ3基因的原核表達載體的構建，用所述含豬源干擾素-λ3基因的重組原核表達載體轉化大腸桿菌和誘導表達，最佳誘導溫度、時間和IPTG濃度分別為誘導溫度20℃，時間16h，IPTG濃度0.4mM。通過本方法制備的產品為研究豬源干擾素-λ3生物活性及其作用機理提供了基礎，也可在制備抗豬流行性腹瀉病毒藥物中應用。
【專利說明】—種制備豬源干擾素- λ 3的方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程產品制備領域，具體涉及一種制備豬源干擾素-λ 3(IFN-λ 3)蛋白的方法和應用。
【背景技術】
[0002]干擾素(interferon, IFN)是人和動物細胞受到病毒感染,或者受核酸、細菌內毒素、促細胞分裂素等作用后，由受體細胞分泌的一種具有高度生物學活性的糖蛋白。干擾素具有生物學活性及其速效多能、無毒害等優點，成為預防和治療豬病毒性疾病的的理想生物制品。干擾素除具有抗病毒活性外，還具有免疫調節作用，同時可作為免疫佐劑提高疫苗的免疫活性。根據干擾素的生物學活性和抗原活性不同可將其分為三類:IFN-a、IFN_i3、IFN-Y，并將具有共同表面受體的IFN-α和IFN-β歸屬于I型干擾素；而與IFN-α、IFN-β具有不同表面受體的IFN-Y，歸屬于II型干擾素。
[0003]目前，國內外學者對I型和II型IFN生物學功能和抗病毒作用已經進行了深入的研究，而對于III型IFN的研究卻相對滯后。III型IFN又稱為IFN-λ，包括IFN-λ 1，IFN-λ 2和IFN-λ 3，由于其基因結構與IL-10相似，所以又稱為IL-29、IL-28A、IL-28B。雖SIFN-X在基因組水平上與IL-10超家族成員具有相似的內含子/外顯子結構，但在蛋白質水平上與I型IFN關系更為密切。現有研究顯示，IFN-λ s與IFN-α有相似的抗病毒、抑制腫瘤細胞生長以及具免疫調節功能等生物學活性，但由于其骨髓抑制及毒副作用少而生物學作用具有長效性，且在人醫臨床試驗研究已經取得了突破性進展，有望在不久的將來成為一個新的基因工程藥物。因此IFN-λ s基因的表達和應用前景成為亟待解決的科研問題。
【發明內容】
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[0004]為克服現有技術的缺點和不足，本發明的首要目的在于提供一種制備豬源干擾素-λ 3 (IFN-λ 3)蛋白的方法，本發明的方法具體地說是利用RT-PCR技術克隆豬源IFN-λ 3，并構建了原核表達載體，在原核表達系統一BL21 (DE3)plysS表達IFN-λ 3。
[0005]本發明的另一目的在于提供所述IFN- λ 3的應用。
[0006]本發明的目的通過下述技術方案實現:一種在大腸桿菌中表達豬源IFN-λ 3基因的方法，具體步驟如下:
[0007](I)用 poly (1:C) (polyinosinic-polycytidylie acid,多聚胞苷酸)誘導培養ST細胞，收獲誘導培養的細胞，用Trizol試劑提取細胞總RNA ；
[0008](2)設計擴增豬源IFN-λ 3基因全長的特異性引物(SI和S2)，以及擴增不含信號肽序列的豬源IFN-λ 3的特異性引物(Pl和P2)，引物如下:
[0009]上游引物S1:5，-ATGGCCCTGGGTGGCTCG-3，；
[0010]下游引物S2:5 ’ -TCAGACACACAGGTCTCC-3 ’ ；
[0011]上游引物P1: 5 ’ -CGGGTACCGTGCCTGTCCCTGAAGCCC-3，引入 Kpn I 酶切位點；[0012]下游引物P2:5’ -CCGCTCGAGGACACACAGGTCTCCACT-3’ 引入 Xho I 酶切位點；
[0013](3)利用引物SI和S2通過RT-PCR技術擴增豬源IFN-λ 3基因全長，；
[0014](4)將豬源IFN-λ 3基因克隆入pMD-18T載體、進行測序鑒定，獲得重組載體PMD-18T-1FN-λ 3 ；
[0015](5)以pMD-18T-1FN-X 3克隆載體為模板，利用引物Pl和P2擴增不含信號肽序列的豬源IFN-λ 3的基因，并利用Kpn I和Xho I這兩個多克隆位點，將豬源IFN-λ 3基因定向亞克隆至原核表達載體pET-32a，獲得重組表達質粒pET-32a-Po-1FN- λ 3 ；
[0016](6)重組表達質粒 pET-32a-Po-1FN_A3 轉化大腸桿菌 BL21(DE3)plysS ；
[0017](7)確定原核表達系統中表達豬源IFN- λ 3的最佳誘導溫度、時間和IPTG濃度； [0018](8)豬源IFN-λ3在大腸桿菌BL21(DE3)plysS中的誘導表達。
[0019]步驟(7)中所述的最佳誘導溫度、時間和IPTG濃度為誘導溫度為20°C，時間為16h, IPTG 濃度為 0.4mM0
[0020]上述方法獲得的豬源IFN-X3蛋白在制備抗PEDV病毒(豬流行性腹瀉病毒，porcine epidemic diarrhea virus)藥物中的應用。
[0021]本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果:
[0022]①pET載體表達系統表達效率非常高。
[0023]②pET載體表達系統攜帶His標簽，便于純化。
[0024]③在構建pET_32a的原核表達載體時，通過引物設計將IFN- λ 3的信號肽序列去除，使得構建獲得的重組表達質粒pET-32a-Po-1FN- λ 3具有更高的蛋白表達效率。
[0025]④將制備獲得的IFN- λ 3應用于抗流行性腹瀉病毒，從而為制備抗流行性腹瀉病毒的藥物提供很好的選擇。
[0026]⑤本發明制備獲得PoIFN- λ 3抗PEDV活性高，能夠達到5Χ 103U/mg。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0027]圖1是構建含有PoIFN- λ 3基因的重組克隆載體的流程圖；
[0028]圖2是IFN- λ 3的SDS-PAGE電泳圖；其中M:蛋白Markers ; 1:無IPTG誘導對照組(上清)；2:無IPTG誘導對照組(沉淀)；3:0.4mM IPTG20°C過夜誘導(上清)；4:0.4mMIPTG20°C過夜誘導(沉淀);5:0.4mM IPTG25°C過夜誘導(上清);6:0.4mM IPTG25°C過夜誘導(沉淀)；7:0.4mM IPTG30°C過夜誘導(上清)；8:0.4mM IPTG30°C過夜誘導(沉淀)；9:0.4mMIPTG37°C誘導 5h (上清)；10:0.4mM IPTG37°C誘導 5h (沉淀)。
[0029]圖3 是 IFN-λ 3 的 Western-blot 圖。其中，l:pET_32a 空載體；2:pET-32a-Po-1FN-A 3。
【具體實施方式】
[0030]下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。
[0031]實施例1、豬源IFN-λ 3的制備方法，依次進行以下步驟:
[0032](I)構建克隆載體:
[0033]①用poly (1:0誘導(1.5呢，211)培養51'細胞(1\105/1111)，收獲誘導培養的細胞，用Trizol試劑提取細胞總RNA ；
[0034]②根據GenBank上發表的唯——條豬源IFN- λ 3基因序列(GQ996936)設計特異性的引物，設計擴增豬源IFN-λ 3基因全長的特異性引物(SI和S2)，
[0035]上游引物S1: 5，-ATGGCCCTGGGTGGCTCG-3，
[0036]下游引物S2:5，-TCAGACACACAGGTCTCC-3，；
[0037]③利用RT-PCR技術擴增豬源IFN- λ 3基因全長(用PrimeScript RT-PCR Kit進行 PCR 擴增)；RT-PCR 的反應條件為 50°C 30min ；94°C 3min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 40s,35 個循環；72°C IOmin ；
[0038]④通過轉化ToplO大腸桿菌，將豬源IFN-λ 3基因克隆入pMD-18T載體、進行測序鑒定，獲得正確的重組載體PMD-18T-1FN- λ 3。
[0039](2)構建表達載體
[0040] ①設計擴增不含信號肽序列的豬源IFN-λ 3的特異性引物(Pl和Ρ2)，引物如下:
[0041]Pl:5’ -CGGGTACCGTGCCTGTCCCTGAAGCCC-3’(含 Kpn I 酶切位點)；
[0042]Ρ2:5’ -CCGCTCGAGGACACACAGGTCTCCACT-3’(含 Xho I 酶切位點)；
[0043]豬源IFN- λ 3核苷酸序列如下:
[0044]ATGGCCCTGGGTGGCTCGCTGGTGCTGGTGCTGGTGCTGATGACGGTGGCTCCACCCAGGACAGGAGCGGTGCCTGTCCCTGAAGCCCTCAGGGCCCTCCCAGGAGCAAGGGGCTGCCACTTGGCCCAGTTCAAGTCTCTGTCCCCACAAGCGCTGCAGGCCTTCAAGAGGGCCAAGGATGCCTTTGAAGAGTCCCTCTTGGAGGACTGGAACTGCAGCTCCCGCATCTTCCCCAGGAGCAGGGACCTGAAGCAGCTGCAGGTGTGGGAGCGCCCCGTGGCCTTGGAGGCCGAGGTGGCCCTGACCCTCAGCGTCCTGGGCTCCTTGGCGAACTCATCCCTGCACAGCAGCCTGGACCAGCCCCTTCACACGCTGCGCCACATCCACGCCCAGCTCCAGGCCTGTGTCCCAGCTCAGCCCATGGCAGGCCCCCGGCCCCGGGGCCGCCTCCACCACTGGCTGCACCGGCTCCAGGAGGCCCAGAAGAAGGAGCCCCAGAGCTGCCTGGAAGCCTCTGTCATGTTCAACCTCTTCCGCCTCCTCACCCGGGACCTGAAATGTGTCGCCAGTGGAGACCTGTGTGTCTGA。
[0045]豬源IFN- λ 3氨基酸序列如下(下劃線部分為信號肽序列):
[0046]MALGGSLVLVLVLMTVAPPRTGAVPVPEALRALPGARGCHLAQFKSLSPQALQAFKRAKDAFEESLLEDWNCSSRIFPRSRDLKQLQVWERPVALEAEVALTLSVLGSLANSSLHSSLDQPLHTLRHIHAQLQACVPAQPMAGPRPRGRLHHWLHRLQEAQKKEPQSCLEASVMFNLFRLLTRDLKCVAS⑶LCV。
[0047]②以測序正確的pMD-18T-1FN-λ 3克隆載體為模板，利用Pl和Ρ2擴增不含信號肽序列的豬源IFN- λ 3的基因，將擴增獲得的目的片段和原核表達載體pET-32a分別經KpnI和Xho I雙酶切后回收進行連接，并轉化至大腸桿菌BL21(DE3)plysS，涂布于含IOOyg/ml氨芐青霉素的LB平板培養過夜；取氨芐青霉素LB平板生長的菌落經PCR鑒定目的基因，陽性克隆菌質粒進行雙酶切鑒定，鑒定為陽性者表示表達載體pET-32a-PoIFN-A 3構建成功；
[0048]其中，pET-32a-PoIFN_A 3重組表達載體的構建過程示意圖見圖1。
[0049](3 )重組蛋白的表達:
[0050]挑取載體構建成功的含pET-32a-Po_IFN-λ 3重組表達菌BL21 (DE3)plysS，于含氨芐青霉素的LB培養基中加入異丙基硫代半IPTG (異丙基_β -D-硫代半乳糖苷)誘導表達，確定原核表達系統中表達豬源IFN-λ 3的最佳誘導溫度、時間(20°C，16h)和IPTG濃度；重組表達菌大量擴增培養3h后，至細菌到達對數生長期，細菌在0D600值為0.6左右，方加入誘導劑IPTG，IPTG終濃度為0.4mM。
[0051](4)鑒定重組蛋白:
[0052]經步驟(3)中IPTG誘導后，菌體蛋白經SDS-PAGE蛋白電泳及考馬斯亮藍染色顯示，其中IFN-λ 3的SDS-PAGE電泳圖見圖2，與轉化空質粒的菌相比，在32KDa左右有一條濃染的新增蛋白條帶。經Western-blot鑒定(結果如圖3所示),能與His單抗發生強陽性反應。
[0053](5)純化重組蛋白，得到粗制品干擾素。
[0054]純化重組蛋白的具體步驟為:
[0055]①將載體構建成功的含pET-32a_Po-1FN- λ 3重組表達菌接種到含100 μ g/mL氨芐青霉素的LB培養液中，37°C 200r/min振搖培養過夜。取過夜培養的新鮮菌液按1: 100接種，37°C振搖培養至0D600nm達到0.6左右時，以0.2mmol/L的IPTG誘導過夜。4°C 6000r/min離心IOmin收集菌體；棄上清，向菌體沉淀中加入0.01mol/L pH7.4的PBS緩沖液，洗漆菌體；4? 6000r/min離心IOmin ;棄上清，向菌體沉淀中加入適量buffer A裂解液(約500mL菌液用50mL bufferA),小心懸浮菌體；向懸浮的菌體中加入溶菌酶(終濃度為100μ g/mL)，混勻；冰浴裂解30min ;超聲波破碎細胞(工作時間5s (功率400W)、間隔時間10s、持續5min,以超聲波儀間歇5min為一個工作循環,重復3個循環)；4°C 8000r/min離心IOmin離心收集包涵體；
[0056]buffer A:pH8.5 的 PBS (含 10 μ g/mL DNase, 0.5mmol/L PMSF)。
[0057]②將上清液轉移到另外一個離心管中，向沉淀中加入包涵體洗滌液(4mol/L的尿素)，洗滌包涵體5min ；4°C 8000r/min離心IOmin離心收集沉淀，將上清液轉入另一干凈離心管中；向沉淀中加入適量b`uffer B (約200mL菌液用IOmLbuffer B)，4°C過夜，溶解包涵體。
[0058]buffer B =N1-Denature-GuHCl 含 IOOmM NaH2PO4, 300mM NaCl，4M GuHCl，ρΗ7.0 ；
[0059]③4°C 12000r/min離心lOmin,將上清用0.45 μ m濾膜過濾后，用N1-NTA親和層析柱純化，具體步驟及溶液配制見本上海生工生物工程有限公司N1-NTA純化說明書BSP079-3，收集60-250mM咪唑的洗脫液即為IFN-λ 3重組蛋白。
[0060]④重組蛋白的復性和濃縮:將洗脫下來的蛋白裝入透析袋中，夾緊透析袋兩端，依次在復性液1、2、3、4中透析4小時，最后在緩沖液IOMm Tris-Hcl,0.15Μ NaCl (ρΗ9.0)中透析12-24小時，將透析袋放入一大平皿中用PEG-20000中濃縮，收集濃縮好蛋白于_80度保存。
[0061]配復性液1:1OmMTris-Hcl，0.2M NaCl，8M 尿素，調 pH 至 7.0 后加入 0.5mM 還原型谷胱甘肽,0.2mM氧化型谷胱甘肽；
[0062]配復性液2:10mMTris-Hcl，(λ 2M NaCl，6M 尿素，調 pH 至 7.0 后加入 0.5mM 還原型谷胱甘肽,0.2mM氧化型谷胱甘肽；
[0063]配復性液3:10mMTris-Hcl，(λ 2M NaCl，4M 尿素，調 pH 至 7.0 后加入 0.5mM 還原型谷胱甘肽,0.2mM氧化型谷胱甘肽；
[0064]配復性液4:10mMTris-Hcl，(λ 2M NaCl，調pH至7.0后加入2mM還原型谷胱甘肽，
0.4mM氧化型谷胱甘肽。
[0065]實施例2、本發明實施例1制備的豬源IFN- λ 3的活性檢定:[0066]用微量細胞病變抑制法，以MDBK細胞(MDBK牛腎細胞)/VSV (水泡性口腔炎病毒)為基本檢測系統。將抑制50%細胞病變(CPE)的干擾素的最高稀釋度定義為一個干擾素單位(U)。活性檢測結果表明，豬源IFN-λ 3的生物學活性為2X 103U/mg。目前所有表達的1、II型干擾素都是以MDBK細胞/VSV來檢測干擾素的表達活性，所以我們也先以該系統分析我們表達的IFN-λ 3是否有生物活性，然后再分析抗其他病毒的活性
[0067]實施例3、豬源IFN- λ 3蛋白的抗PEDV病毒(豬流行性腹瀉病毒)作用
[0068]在ST細胞系(ST豬睪丸細胞)上測定PoIFN-λ 3 (其中，Po為porcine的簡寫)抗PEDV的作用，采用細胞病變抑制法。將ST細胞懸液按I X IOVmL密度接種96孔細胞培養板，每孔體積100 μ L，過夜培養；將復性后的PoIFN- λ 3用含2%FBS的DMEM培養基以2^28梯度稀釋，每孔加100 μ L,每個梯度8個重復孔，370C，體積分數5%的CO2誘導培養24h后吸棄培養液，加入IOOTCID5ci的PEDV，24h后開始觀察病變，連續觀察3天，同時設細胞對照和病毒對照；參照病毒毒價計算法，以病變抑制孔代替毒價測定中病變孔，按Reed-Muench法計算PoIFN- λ 3抗PEDV的活性單位，其中PoIFN- λ 3生物活性效價測定結果見表1。
[0069]表1 PoIFN- λ 3生物活性效價測定
[0070]
【權利要求】
1.一種在大腸桿菌中表達豬源IFN-λ 3基因的方法，其特征在于具體步驟如下: (1)用poly(1: C)誘導培養ST細胞，收獲誘導培養的細胞，用Trizol試劑提取細胞總RNA ； (2)設計擴增豬源IFN-λ3基因全長的特異性上游引物SI和下游引物S2，以及擴增不含信號肽序列的豬源IFN- λ 3的特異性上游引物Pl和下游引物Ρ2，引物如下:
上游引物 S1:5’ -ATGGCCCTGGGTGGCTCG-3’ ；
下游引物 S2:5’ -TCAGACACACAGGTCTCC-3’ ；
上游引物 Pl:5’ -CGGGTACCGTGCCTGTCCCTGAAGCCC-3’ ；
下游引物 Ρ2:5’ -CCGCTCGAGGACACACAGGTCTCCACT-3’ ； (3)利用引物SI和S2通過RT-PCR技術擴增豬源IFN-λ3基因全長，； (4)將豬源IFN-X3基因克隆入pMD-18T載體、進行測序鑒定，獲得重組載體PMD-18T-1FN-λ 3 ； (5)以pMD-18T-1 FN-A3克隆載體為模板，利用引物Pl和P2擴增不含信號肽序列的豬源IFN-λ 3的基因，并利用KpnI和XhoI這兩個多克隆位點，將豬源IFN-λ 3基因定向亞克隆至原核表達載體pET-32a，獲得重組表達質粒pET-32a-Po-1FN- λ 3 ； (6)重組表達質粒pET-32a-Po-1FN-λ3轉化大腸桿菌BL21 (DE3)plysS ； (7)確定原核表達系統中表達豬源IFN-λ3的最佳誘導溫度、時間和IPTG濃度； (8)豬源IFN-λ3在大腸桿菌BL21(DE3)plySS中的誘導表達。
2.根據權利要求1所述的在大腸桿菌中表達豬源IFN-λ3基因的方法，其特征在于步驟(7)中所述的最佳誘導溫度、時間和IPTG濃度為誘導溫度為20°C，時間為16h，IPTG濃度為 0.4mM。
3.權利要求1或2所述方法獲得的豬源IFN-λ 3蛋白在制備抗豬流行性腹瀉病毒藥物中的應用。
【文檔編號】C07K14/57GK103757041SQ201310750013
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年12月31日 優先權日:2013年12月31日
【發明者】郭鵬舉, 沈海燕, 張春紅, 張建峰, 周恒 , 朱余軍, 劉志成, 孫俊穎 申請人:廣東省農業科學院動物衛生研究所