一種抗仔豬腹瀉IgY的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種抗仔豬腹瀉IgY的制備方法，該抗仔豬腹瀉IgY的制備方法包括以下步驟：分離純化豬傳染性胃腸炎病毒TGEV；TGEV+弗氏佐劑制備免疫原；免疫8周齡的產蛋雞，雞胸部肌肉分點注射免疫原1mL，10天后第二次免疫，第二次免疫10天后第三次免疫；第三次免疫之后，15天收集蛋雞所產雞蛋，分離蛋黃；蛋黃加入硫酸葡聚糖，充分攪拌，離心處理；取離心上清，加30％冷乙醇，充分攪拌，離心處理后所得沉淀即為抗仔豬腹瀉IgY；抗仔豬腹瀉IgY能有效治療豬傳染性胃腸炎，見效快，效果好。
【專利說明】一種抗仔豬腹瀉IgY的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于醫藥制備【技術領域】，尤其涉及一種抗仔豬腹瀉IgY的制備方法。
【背景技術】
[0002]豬傳染性胃腸炎又稱幼豬的胃腸炎，是一種高度接觸傳染性，傳播迅速，數日內可蔓延全群，以嘔吐、嚴重腹瀉、脫水，致兩周齡內仔豬高死亡率為特征的病毒性傳染病。
[0003]該病1933年在美國的伊利諾斯州就有相關報道，1946年確定病原體為病毒，并對此進行了相關的研究。隨后，在日本、英國、中南美洲、加拿大、朝鮮和菲律賓都相繼報道了TGEV0目前在北緯30度以北的溫帶至寒帶地區，均有TGE發生。我國的四川、陜西、湖北、北京、吉林、廣州、臺灣等省市也有本病的發生。2周齡內仔豬死亡率非常高，日齡越小，死亡越快，5周齡以上的豬只死亡率較低，較大的或成年豬發病幾乎沒有死亡，但是這些豬往往成為僵豬，飼料報酬低。TGEV常常與其他疾病混合發生或繼發，是引起規模化養豬場仔豬腹瀉性死亡的重要原因之一，給養殖業帶來了巨大的經濟損失。
[0004]TGEV感染時被吞咽進入消化道，抵抗消化道內的胃酸和蛋白水解酶進入小腸，小腸是TGEV主要的靶器官。TGEV感染腸上皮細胞后，迅速破壞功能性上皮細胞，阻礙小腸內營養物質的分解。不能被分解的營養物質如乳糖等在腸腔中的大量聚集，致使腸腔內滲透壓升高，從而引起腹瀉和脫水。
[0005]現有技術未能提供一種有效治療豬傳染性胃腸炎的藥物。
【發明內容】
[0006]本發明提供了一種抗仔豬腹瀉IgY的制備方法，旨在解決現有技術未能提供一種有效治療豬傳染性胃腸炎的藥物的問題。
[0007]本發明的目的在于提供一種抗仔豬腹瀉IgY的制備方法，該抗仔豬腹瀉IgY的制備方法包括以下步驟:
[0008]步驟一，分離純化豬傳染性胃腸炎病毒TGEV:取發病仔豬的空腸和腸系膜淋巴結置于乳缽內，剪碎，反復研磨，加入PH值為7.0的PBS制成1: 5的組織勻漿，-70°C反復凍融3次；5000轉/分鐘離心20分鐘，取上清液經0.22 μ m的微孔濾膜過濾，然后加入雙抗100IU/mL, _70°C保存，備用；
[0009]將處理病料接種于長成單層的ST細胞，每個樣品接種3瓶，37°C吸附I小時；傾去病毒液，加入含5%血清的DMEM繼續培養，觀察4d，不出現病變者繼續盲傳5代；有細胞病變者繼續傳代，直到細胞病變穩定；
[0010]將出現80%細胞病變者連同培養基一起于-70°c反復凍融3次；5000轉/分鐘離心20分鐘，取上清液經0.22 μ m的微孔濾膜過濾，然后加入雙抗100IU/mL，用于制作TGEV免疫原；
[0011]步驟二，TGEV與`弗氏完全或不完全佐劑按照1:1的比例，振蕩器充分震蕩混勻，即為免疫原；[0012]步驟三，免疫8周齡的產蛋雞，雞胸部肌肉分點注射免疫原lmL，10天后用不完全佐劑免疫原進行第二次免疫，第二次免疫10天后用不完全佐劑免疫原教學第三次免疫；
[0013]步驟四，第三次免疫之后，15天收集蛋雞所產雞蛋，分離蛋黃；
[0014]步驟五，蛋黃加入硫酸葡聚糖濃度3.5%，充分攪拌，5000轉/分鐘離心30分鐘，取上清；
[0015]步驟六，上清物加30 %乙醇，充分攪拌，離心處理后所得沉淀即為抗仔豬腹瀉IgY。 [0016]技術效果:
[0017]本發明提供的抗仔豬腹瀉IgY的制備方法，該抗仔豬腹瀉IgY的制備方法包括以下步驟:分離純化豬傳染性胃腸炎病毒TGEV ;TGEV+弗氏佐劑制備免疫原；免疫8周齡的產蛋雞，雞胸部肌肉分點注射免疫原lmL，10天后第二次免疫，第二次免疫10天后第三次免疫；第三次免疫之后，15天收集蛋雞所產雞蛋，分離蛋黃；蛋黃加入硫酸葡聚糖，充分攪拌，離心處理；取離心上清，加30%乙醇，充分攪拌，離心處理后所得沉淀即為抗仔豬腹瀉IgY ；抗仔豬腹瀉IgY能有效治療豬傳染性胃腸炎，見效快，效果好。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1是本發明實施例提供的抗仔豬腹瀉IgY的制備方法的實現流程圖。
【具體實施方式】
[0019]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步的詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定發明。
[0020]圖1示出了本發明實施例提供的抗仔豬腹瀉IgY的制備方法的實現流程。
[0021]該抗仔豬腹瀉IgY的制備方法包括以下步驟:
[0022]步驟SlOl，分離純化豬傳染性胃腸炎病毒TGEV ；
[0023]步驟S102，TGEV+弗氏佐劑制備免疫原；
[0024]步驟S103，免疫8周齡的產蛋雞，雞胸部肌肉分點注射免疫原lmL，10天后第二次免疫，第二次免疫10天后第三次免疫；
[0025]步驟S104，第三次免疫之后，15天收集蛋雞所產雞蛋，分離蛋黃；
[0026]步驟S105，蛋黃加入硫酸葡聚糖，充分攪拌，離心處理；
[0027]步驟S106，取離心上清，加30%乙醇，充分攪拌，離心處理后所得沉淀即為抗仔豬腹瀉IgY。
[0028]本發明的具體方法為:
[0029]步驟一，分離純化豬傳染性胃腸炎病毒TGEV:取發病仔豬的空腸和腸系膜淋巴結置于乳缽內，剪碎，反復研磨，加入PH值為7.0的PBS制成1: 5的組織勻漿，-70°C反復凍融3次；5000轉/分鐘離心20分鐘，取上清液經0.22 μ m的微孔濾膜過濾，然后加入雙抗100IU/mL, _70°C保存，備用；
[0030]將處理病料接種于長成單層的ST細胞，每個樣品接種3瓶，37°C吸附I小時；傾去病毒液，加入含5%血清的DMEM繼續培養，觀察4d，不出現病變者繼續盲傳5代；有細胞病變者繼續傳代，直到細胞病變穩定；
[0031]將出現80%細胞病變者連同培養基一起于_70°C反復凍融3次；5000轉/分鐘離心20分鐘，取上清液經0.22 μ m的微孔濾膜過濾，然后加入雙抗100IU/mL，用于制作TGEV免疫原；
[0032]步驟二，TGEV與弗氏完全或不完全佐劑按照1:1的比例，振蕩器充分震蕩混勻，即為免疫原；
[0033]步驟三，免疫8周齡的產蛋雞，雞胸部肌肉分點注射免疫原lmL，10天后用不完全佐劑免疫原進行第二次免疫，第二次免疫10天后用不完全佐劑免疫原教學第三次免疫；
[0034]步驟四，第三次免疫之后，15天收集蛋雞所產雞蛋，分離蛋黃；
[0035]步驟五，蛋黃加入硫酸葡聚糖濃度3.5 %，充分攪拌，5000轉/分鐘離心30分鐘，取上清；
[0036]步驟六，上清物加30 %乙醇，充分攪拌，離心處理后所得沉淀即為抗仔豬腹瀉IgY。
[0037]下面結合附圖及具體實施例對本發明的應用原理作進一步描述。
[0038]實例一:商南縣瑞生實業有限責任公司豬存欄5000頭，適繁母豬300頭，2012年出現?日齡以內仔豬大量腹瀉，發病率53%，死亡率37%，2013年3月開始試用本技術試驗制劑，至6月，發病率降至13%，死亡率降至5.3%。
[0039]星光良種豬繁養殖有限公司豬存欄10000頭，適繁母豬800頭，2012年5月開始試用本試驗制劑，與前期相比，初生仔豬腹瀉發病率減少26%，死亡率減少17%，7日齡仔豬成活率達到94%，顯著提高了公司的經濟效益。
[0040]丹鳳縣山凹凹生態發展有限公司豬存欄7000頭，適繁母豬500頭，2013年5月試用本技術試驗制劑，7日齡以內仔豬腹瀉發病率減少30.6%，死亡率減少25.3%，本制劑能使初生仔豬獲得對豬傳染性胃腸炎病毒強有力的免疫力，有效降低因豬傳染性胃腸炎導致的大量死亡。
[0041]新起源牧業有限公司豬存欄2000頭，適繁母豬1000頭，2012年9月試用本技術的試驗制劑后，發病率和死亡率顯著降低，分別比前期降低36%和30%，顯著防止了仔豬的腹瀉的發生。
[0042]本發明實施例提供的抗仔豬腹瀉IgY的制備方法，該抗仔豬腹瀉IgY的制備方法包括以下步驟:分離純化豬傳染性胃腸炎病毒TGEV ;TGEV+弗氏佐劑制備免疫原；免疫8周齡的產蛋雞，雞胸部肌肉分點注射免疫原lmL，10天后第二次免疫，第二次免疫10天后第三次免疫；第三次免疫之后，15天收集蛋雞所產雞蛋，分離蛋黃；蛋黃加入硫酸葡聚糖，充分攪拌，離心處理；取離心上清，加30 %乙醇，充分攪拌，離心處理后所得沉淀即為抗仔豬腹瀉IgY ;抗仔豬腹瀉IgY能有效治療豬傳染性胃腸炎，見效快，效果好。
[0043]以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種抗仔豬腹瀉IgY，其特征在于，該抗仔豬腹瀉IgY的配方組成:按照1: 5的比例用無菌生理鹽水將卵黃粉(純度> 95% )稀釋。
2.如權利要求1所述的抗仔豬腹瀉IgY，其特征在于，該抗仔豬腹瀉IgY的使用方法為:仔豬出生后，立即口服1.0mL，3小時后再允許仔豬吃初乳。
3.一種抗仔豬腹瀉IgY的制備方法，其特征在于，該抗仔豬腹瀉IgY的制備方法包括以下步驟: 步驟一，分離純化豬傳染性胃腸炎病毒TGEV:取發病仔豬的空腸和腸系膜淋巴結置于乳缽內，剪碎，反復研磨，加入PH值為7.0的PBS制成1: 5的組織勻漿，_70°C反復凍融3次；5000轉/分鐘離心20分鐘，取上清液經0.22 μ m的微孔濾膜過濾，然后加入雙抗100IU/mL，-70°C保存，備用； 將處理病料接種于長成單層的ST細胞，每個樣品接種3瓶，37°C吸附I小時；傾去病毒液，加入含5%血清的DMEM繼續培養，觀察4d，不出現病變者繼續盲傳5代；有細胞病變者繼續傳代，直到細胞病變穩定； 將出現80%細胞病變者連同培養基一起于_70°C反復凍融3次；5000轉/分鐘離心20分鐘，取上清液經0.22 μ m的微孔濾膜過濾，然后加入雙抗100IU/mL，用于制作TGEV免疫原； 步驟二，TGEV與弗氏完全或不完全佐劑按照1:1的比例，振蕩器充分震蕩混勻，即為免疫原； 步驟三，免疫8周齡的產蛋雞，雞胸部肌肉分點注射免疫原lmL，10天后用不完全佐劑免疫原進行第二次免疫，第二次免疫10天后用不完全佐劑免疫原教學第三次免疫；` 步驟四，第三次免疫之后，15天收集蛋雞所產雞蛋，分離蛋黃； 步驟五，蛋黃加入硫酸葡聚糖濃度3.5 %，充分攪拌，5000轉/分鐘離心30分鐘，取上清； 步驟六，上清物加30%乙醇，充分攪拌，離心處理后所得沉淀即為抗仔豬腹瀉IgY。
【文檔編號】C07K16/02GK103724429SQ201310718916
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月24日 優先權日:2013年12月24日
【發明者】敬曉棋, 黃光東, 張瓊, 陳生葉 申請人:黃光東