參與調控黃瓜葫蘆素C合成的轉錄因子Csa5G157230及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種參與調控黃瓜葫蘆素C合成的轉錄因子Csa5G157230及其應用，它是首次在黃瓜基因組中發現的控制苦味合成的兩個bHLH轉錄因子（Csa5G157230和Csa5G156220）之一，兩個bHLH轉錄因子分別在果實和葉片中控制苦味的形成。利用酵母單雜交、凝膠組織體系和煙草瞬時表達證明了這兩個轉錄因子能夠結合到與苦味合成啟動子區域結合并激活合成基因的轉錄；同時在無苦味的黃瓜葉片或果實中大量表達對應的轉錄因子能夠恢復黃瓜植株的苦味性狀。本發明進一步揭示了黃瓜苦味形成的分子機制，為無苦味黃瓜育種提供了理論依據和分子輔助育種目標。
【專利說明】參與調控黃瓜葫蘆素C合成的轉錄因子Csa5G157230及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程及分子生物學領域，具體地說，涉及參與調控黃瓜葫蘆素C合成的轉錄因子Csa5G157230及其應用。
【背景技術】
[0002]黃瓜的苦味是由一類稱為葫蘆素C的三萜化合物導致的。黃瓜果實中積累葫蘆素C會嚴重影響黃瓜的口感及品質。早期的經典遺傳學試驗發現黃瓜的苦味由Bi和Bt兩個基因控制。最近研究發現一個由8個基因組成的基因簇參與黃瓜苦味的合成。其中Bi基因編碼氧化角鯊烯環化酶，它催化生成葫蘆2烯醇，是葫蘆素C合成的第一步，也是合成中最關鍵的一步。
[0003]盡管已經基本確定了黃瓜中苦味合成的分子機制，但調控苦味形成的分子機制目前還不清楚，相關合成基因也未被克隆。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供參與調控黃瓜葫蘆素C合成的轉錄因子Csa5G157230及其應用。
[0005]為了實現本發明目的，本發明的一種參與調控黃瓜葫蘆素C合成的轉錄因子Csa5G157230，其氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0006]本發明還提供編碼所述轉錄因子Csa5G157230的基因，其核苷酸序列如SEQ IDN0.3所示。
[0007]本發明還提供含有編碼所述轉錄因子Csa5G157230基因的載體、工程菌、宿主細胞及轉化的植物。
[0008]本發明還提供編碼所述轉錄因子Csa5G157230的基因在調控黃瓜苦味合成中的應用。
[0009]本發明還提供編碼所述轉錄因子Csa5G157230的基因在無苦味黃瓜分子育種中的應用。
[0010]本發明還提供一種在植物中瞬時表達基因的方法，采用農桿菌介導的方法，將含有編碼所述轉錄因子Csa5G157230基因的載體轉入植物體(如煙草)中，獲得目的基因大量表達。
[0011 ] 本發明進一步提供用于PCR擴增編碼所述轉錄因子Csa5G157230基因的引物對，包括上游引物 5' -TGTATACAATCTCCATTCCCTTTTGA-3'和下游引物 5' -TATTCCAAGTTAGTCAATTTATTCTGT-3'。
[0012]從來自湖南的一個葉片無苦味的黃瓜突變體(XY - 3)，它是由苦味黃瓜(XY - 2)自然突變而來。在突變體XY - 3中，檢測了之前發現的苦味合成基因的表達，發現苦味合成基因簇在突變體中的表達量非常的低。由此推測該突變體中調控苦味合成的基因可能發生了突變。將XY — 2和XY — 3的基因組DNA進行測序。通過比較基因組序列，重點尋找發生在轉錄因子的內部突變。通過分析，找到一個SNP，位于Csa5G156220這個轉錄因子的內部。結合轉錄組數據，發現該基因只在葉片中大量表達。進一步檢測該基因在突變體XY —3中的表達，發現該轉錄因子在突變體中的表達也大幅降低。此外，還發現干旱以及ABA等逆境處理都可以使該轉錄因子及苦味合成基因表達升高，具有很高的一致性。因此，推測該突變可能導致該轉錄因子表達量降低，從而使合成基因表達大幅降低，最終導致了葉片從苦變為不苦。
[0013]為了進一步驗證，進行了酵母單雜交和凝膠阻滯實驗，證明該轉錄因子的確能夠結合到苦味合成基因的啟動子區域。此外，還將苦味合成基因的啟動子連上報告基因(LUC)，在煙草中檢測轉錄因子對啟動子區域的激活作用，發現它可以激活報告基因的表達。由于穩定的黃瓜轉基因體系還不成熟，因此，本發明建立了黃瓜子葉瞬時表達系統，利用農桿菌將轉錄因子導入黃瓜XY - 3的無無苦味子葉中，一周后檢測子葉，發現轉錄因子和合成基因大量表達，從而導致子葉由不苦變成苦。綜合上述研究結果，本發明首次發現了在葉片中調控苦味合成基因表達的轉錄因子。將該基因命名為Bf，它通過調控合成基因的表達從而進一步調控葉片苦味的形成。
[0014]之前的遺傳分析發現黃瓜果實基因是由Bt基因控制。由于野生黃瓜果實非常的苦，因此在黃瓜馴化過程中，Bt基因必然發生了突變，導致黃瓜果實不苦，該突變受到人為選擇而保留下來。在之前的研究中，對114份黃瓜核心種質材料進行重測序分析，通過生物信息學分析黃瓜馴化發生的區域，再結合圖位克隆，將Bt基因定位到5號染色體442kb的區間內。此區間有68個候選基因。進一步分析這些基因的轉錄組數據，發現其中Csa5G157230只在野生黃瓜的果實中表達，在栽培黃瓜果實中不表達。并且Csa5G157230基因與同時發現的調控葉片苦味合成的基因是同源基因，都是bHLH類轉錄因子。通過檢測Csa5G157230基因和苦味合成Bi基因在不同黃瓜品種中以及Bt基因分離群體個體中的基因表達情況。發現它們的表達量與果實中苦味素的含量呈正相關。即Csa5G157230基因的表達量越高，則Bi基因表達量越高，從而黃瓜果實越苦。根據這些信息，推測這個基因很有可能就是Bt基因，它通過類似Bf調控苦味合成的機制調控黃瓜果實中的苦味合成。
[0015]基于之前已報道的研究體系，如酵母單雜交、凝膠阻滯證明Csa5G157230基因的確可以轉錄激活苦味合成基因的表達。由于穩定的黃瓜轉基因體系還不成熟，因此本發明建立了黃瓜果實瞬時表達系統，利用農桿菌將Csa5G157230基因導入新泰密刺果實中，三周后檢測注射區域的果實，發現Csa5G157230基因和合成基因大量表達，從而導致果實由不苦變成苦。綜合上述研究結果，認為Csa5G157230基因即為Bt基因。它通過調控合成基因的表達從而進一步調控果實苦味的形成。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1為本發明實施例1中涉及的XY-3無苦味突變體相關信息；其中，A為突變體中葫蘆素C的相對濃度，XY-2為苦味黃瓜；B為突變體中苦味合成基因的表達情況；C為重測序發現突變的位置 位于Bf轉錄因子的內部。
[0017]圖2為本發明實施例1中用干旱和ABA處理后Csa5G156220及苦味合成基因的表達情況。
[0018]圖3為本發明實施例1中用生物信息學分析結合圖位克隆，將Bt基因定位于5號染色體的情況；其中，有67個候補基因，它們在野生和栽培黃瓜果實及葉片中的表達用漸變色區分，越深代表含量越高。
[0019]圖4為本發明實施例1中檢測不同種類的黃瓜以及Bt分離群體中的個體中苦味合成基因B1、苦味調控基因Bt的表達及葫蘆素C的含量。
[0020]圖5為本發明實施例1中用酵母單雜交系統和煙草瞬時表達系統證明Bf可以結合到苦味合成基因的啟動子上，并激活下游報告基因轉錄。
[0021]圖6為本發明實施例1中用凝膠阻滯系統證明Bf可以結合到苦味合成基因的啟動子上。
[0022]圖7為本發明實施例1中用酵母單雜交系統和煙草瞬時表達系統證明Bt可以結合到苦味合成基因的啟動子上，并激活下游報告基因轉錄。
[0023]圖8為本發明實施例1中用凝膠阻滯系統證明Bf可以結合到苦味合成基因的啟動子上。
[0024]圖9為本發明實施例2中分別用葉片和果實瞬時表達系統來證明Bf和Bt的生物學功能，當Bf或Bt表達后導致苦 味合成基因Bt表達升高，最終使苦味物質葫蘆素C的含
量升高。
【具體實施方式】
[0025]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例均按照常規實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊(Sambrook J&RussellDff, Molecular cloning:a laboratory manual, 2001),或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0026]實施例1調控黃瓜葫蘆素C合成的轉錄因子挖掘與獲得
[0027]1、候補基因的挖掘
[0028]在湖南發現了一個葉片無苦味的黃瓜突變體(XY - 3)，它是由苦味黃瓜(XY - 2)自然突變而來(圖1，A)。在突變體XY - 3中，苦味合成基因簇在突變體中的表達量非常的低(圖1，B)，推測該突變體中調控苦味合成的基因可能發生了突變。將XY — 2和XY — 3的基因組DNA進行重測序。利用生物信息學分析，尋找發生在轉錄因子的內部突變。該分析找到一個SNP，位于Csa5G156220這個轉錄因子的內部(圖1，C)。轉錄組數據顯示該基因只在葉片中大量表達，且該轉錄因子在突變體中的表達也大幅降低(圖1，B)。此外，干旱以及ABA等逆境處理都可以使該轉錄因子及苦味合成基因表達升高(圖2)。因此，將該轉錄因子列為候補基因，命名為Bf。
[0029]之前的遺傳分析發現黃瓜果實苦味是由Bt基因控制。在黃瓜馴化過程中，Bt基因必然發生了突變，導致黃瓜果實不苦。對114份黃瓜核心種質材料進行重測序分析，通過生物信息學分析黃瓜馴化發生的區域，再結合圖位克隆，將Bt基因定位到5號染色體442kb的區間內。此區間有68個候選基因(圖3)。進一步分析這些基因的轉錄組數據，發現其中Csa5G157230只在野生黃瓜的果實中表達，在栽培黃瓜果實中不表達(圖3)。檢測Csa5G157230基因和苦味合成Bi基因在不同黃瓜品種中以及Bt基因分離群體個體中的基因表達情況。發現它們的表達量與果實中苦味素的含量呈正相關(圖4)。即Csa5G157230基因的表達量越高，則Bi基因表達量越高，從而黃瓜果實越苦。并且Csa5G157230基因與我們發現的調控葉片苦味合成的基因是同源基因，都是bHLH類轉錄因子。根據這些信息，推測這個基因很有可能就是Bt基因，它通過類似Bf調控苦味合成的機制調控黃瓜果實中的苦味合成。
[0030]2、黃瓜Csa5G157230基因功能驗證
[0031 ] 首先制備黃瓜葉片和果實的cDNA文庫，然后利用正向引物和反向弓丨物進行PCR擴增(引物序列見表1)。
[0032]表1引物序列(5' -3')
[0033]
【權利要求】
1.參與調控黃瓜葫蘆素C合成的轉錄因子Csa5G157230，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.編碼權利要求1所述轉錄因子Csa5G157230的基因。
3.如權利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID N0.3所示。
4.含有權利要求2或3所述基因的載體。
5.含有權利要求2或3所述基因的工程菌。
6.權利要求2或3所述基因在調控黃瓜苦味合成中的應用。
7.權利要求2或3所述基因在無苦味黃瓜分子育種中的應用。
8.一種在植物中瞬時表達基因的方法，其特征在于，采用農桿菌介導的方法，將權利要求4所述的載體轉入植物體中，獲得目的基因大量表達。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述植物包括但不限于黃瓜、煙草。
10.用于PCR擴增權利要求2或3所述基因的引物對，其特征在于，包括上游引物5' -TGTATACAATCTCCATTCCCTTTTGA-3'和下游引物 5' -TATTCCAAGTTAGTCAATTTATTCTGT-3' ο
【文檔編號】C07K14/415GK103739685SQ201310701070
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月18日 優先權日:2013年12月18日
【發明者】黃三文, 尚軼, 張慧明, 陳惠明, 張忠華 申請人:中國農業科學院蔬菜花卉研究所