誘導成骨多肽、其制備方法和用途
【專利摘要】本發明涉及一種誘導成骨多肽，其結構式為KIPKASSVPTELSAISTLYLCC。該誘導成骨多肽具有較強的骨誘導活性、能夠大規模合成和價格較低的優點。其克服了現有基因重組BMP-2生產設備、制備工藝非常復雜，生產周期長，產率低，難以大規模生產，價格過于昂貴等不足，市場前景廣闊。
【專利說明】誘導成骨多肽、其制備方法和用途
【技術領域】
[0001]本發明屬于臨床醫學領域，更具體地說它涉及一種誘導成骨多肽，其制備方法及在制備用于促進骨再生、骨缺損修復的藥物中的用途。
【背景技術】
[0002]中國社會逐步步入老齡化社會，中老年性骨科疾病發生率也將大幅度上升，因此中國也將面臨人工骨移植材料的極大需求。據統計，中國有肢體不自由患者1500萬，由于缺乏重建技術和材料已有300萬人截肢,全國每年骨缺損和骨損傷患者近350萬,按年手術40萬例計算，整個中國骨移植材料的市場規模也將達到24億人民幣以上的規模，這還不包括大量牙科矯形手術中需要的骨移植材料。在美國，每年實施45萬例骨移植手術，骨移植材料市場高達80億美元。對于歐洲市場，骨替代產品35%為合成材料，并且以每年41.7%的速率增長，2000年骨移植手術145775例，骨移植材料市場價值達35億美元。上述數據尚未包括牙科用骨移植材料。牙科用骨移植材料估計有骨科用骨移植材料的1/4。作為生物醫學材料中一個重要的組成部分，人工骨移植材料的市場銷售額在以每年50%的速率增長，由此可見人工骨材料的市場規模與潛力將十分巨大。
[0003]目前市場上的人工骨修復材料大都缺少誘導成骨活性因子，這些材料植入人體后成骨的時間和數量受限，一定程度上限制了新骨的形成。骨形態發生蛋白(bonemorphogenetic proteins, BMPs)是目前發現唯一能夠單獨誘導成骨的生長因子,骨形成蛋白(bone morphogenetic protein BMP)作為最有效的成骨誘導活性物質，已被廣泛應用在骨缺修復損及骨折愈合的研究中。其中以BMP-2的成骨能力最強。但天然的BMP-2半衰期短，局部應用時很快被稀釋和代謝，不僅數量有限，活性不穩定，遠遠不能滿足臨床需要，而且混入載體中有許多副作用。
·[0004]目前國內外多采用分子生物學和基因工程學等技術生產基因重組骨形態發生蛋白，制備工藝復雜，生產周期長，產率低，價格亦非常昂貴，難以大規模生產。運用轉基因技術制備的基因重組BMP-2 (rhBMP2)也存在轉染效率低、表達時間較短及病毒載體的潛在致癌性等缺點。2002年美國FDA雖然批準了 rhBMP-2基因工程產品，但尚未進入國內。這些問題極大地限制了骨形態發生蛋白的臨床應用。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于克服上述現有技術的不足之處，特別是克服現有BMP-2生產設備、制備工藝非常復雜，生產周期長，產率低，難以大規模生產，價格過于昂貴等不足，而提供一種誘導成骨多肽。
[0006]本發明的另一目的在于提供這樣的誘導成骨多肽的合成方法。
[0007]本發明的又一目的在于提供這樣的誘導成骨多肽在制備用于促進骨再生、骨缺損修復的藥物中的用途。
[0008]本發明提供一種誘導成骨多肽，其特征在于結構式為KIPKASSVPTE LSAISTLYLCC。[0009]本發明還提供了這樣的誘導成骨多肽的合成方法，其特征在于采用采用多肽合成儀通過FMOC/tBu固相多肽合成法合成。所得粗肽經過凝膠層析初步純化，最后經過高效液相色譜法分析其純度，冷凍而得。
[0010]本發明的誘導成骨多肽具有較強的骨誘導活性、能夠大規模合成和價格較低的優點，其在克服了現有BMP-2生產設備、制備工藝非常復雜，生產周期長，產率低，難以大規模生產，價格過于昂貴等不足的同時，保持了高的骨誘導活性，因此，市場前景十分廣闊。
【具體實施方式】
[0011]下面詳細介紹本發明的誘導成骨多肽的細胞試驗。
[0012]1.本發明誘導成骨多肽的合成
通過本領域中公知的FMOC/tBu固相多肽合成法合成法得到本發明的誘導成骨多肽KIPKASSVPTE LSAISTLYLCCο
[0013]2.細胞試驗
(1)試驗相關儀器設備
￥器名稱I型號I生產廠家
潔凈工作臺_NU-126-006 Nuaire
研究級倒置顯微鏡?Χ41' OLYMPUS
冷凍離心機5810REPPEND0RF`
二氧化碳孵箱NU4750ENuaire
(2)試驗相關材料
SD MSC—株(RASMX-Ol001)，來源:Cyagen 細胞狀態:細胞狀態好，形態均一。
[0014]細胞無菌檢測結果:陰性
(3)試驗相關試劑
SD 大鼠間充質干細胞完全培養基(RASMX-90011-500)、1XPBS (PBS-10001-100)，
SD大鼠間質干細胞成骨誘導分化完全培養基(RASMX-90021-200)，0.25%Trypsin_0.04%EDTA(TEDTA-10001-100)、
(以上試劑均來自Cyagen)
BMP-2(北京義翹神舟生物技術有限公司)
本發明的誘導成骨多肽
堿性磷酸酶測定試劑盒(南京建成科技有限公司)
(4)試驗步驟
1、細胞準備:在SD MSC細胞融合達80%時，將細胞進行傳代，接種于經0.1%明膠包被過的24孔板中，用于成骨誘導。
[0015]A.細胞消化、接種:
a.棄去上清，用IXPBS清洗細胞2次，加入ImlPBS和Iml0.25%Trypsin_0.04%EDTA消化細胞；
b.消化1-2分鐘，顯微鏡下可見細胞間隙增大，細胞變圓，用手輕拍培養器皿的壁，立即加入2mL的SDMSC完全培養基終止消化。
[0016]c.用吸管吸取液體，輕輕吹打培養器皿表面，反復3-5次，使細胞徹底脫離瓶皿底壁，將細胞移入離心管中，再向培養瓶中加入IXPBS洗1-2次，并將洗液一并轉移至離心管中。
[0017]d.1lOOrpm進行離心4分鐘；
e.棄去上清加入完全培養液，充分混勻，平均接種于3個包被過明膠的12孔板中，搖勻，放置于37°C的二氧化碳培養箱中培養。
[0018]I1、誘導成骨多肽的準備:將誘導成骨多肽稱量分裝成3份(Img/份)，取其中一份進行溶解，其他保存于_20°C冰箱以供備用。加入Iml無菌用水溶解Img成骨素于離心管中，過濾，分裝于EP管中，保存于-80°C冰柜中以供使用。
[0019]II 1、誘導成骨:
A.初誘導:待細胞融合達80%左右時，進行成骨誘導。每組兩個復孔，其中2孔陰性對照:使用間充質干細胞完全培養液培養；2孔陽性對照:使用間質干細胞成骨誘導分化完全培養液培養；2孔含10ug/ml的BMP-2間充質干細胞完全培養液培養；2孔含30ug/ml的BMP-2間充質干細胞完全培養液培養；2孔含10ug/ml的本發明的誘導成骨多肽間充質干細胞完全培養液培養；2孔含30ug/ml的本發明的誘導成骨多肽間充質干細胞完全培養液培養。2板重復。
[0020]B.每3天進行誘導換液。
[0021]IV.堿性磷酸酶檢測:
取不同檢測時間點細胞，根據堿性磷酸酶(AKP)測定試劑盒(南京建成)對各組AKP含量進行檢測。具體操作如下:
A.消化各孔細胞，離心后，進行細胞計數，調整細胞數量，保證50ul細胞重懸液含有大于 5X IO'的細胞。 0.05mI緩沖液d.細胞,按K灰依次加入相R溶液
【權利要求】
1.誘導成骨多肽，其特征在于其結構式為KIPKASSVPTELSAISTLYLCC0
2.制備權利要求1的誘導成骨多肽的方法，其特征在于采用多肽合成儀通過FMOC/tBu固相多肽合成法合成。
3.權利要求1 的誘導成骨多肽在制備用于促進骨再生藥物的用途。
【文檔編號】C07K14/51GK103665143SQ201310681283
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月16日 優先權日:2013年12月16日
【發明者】甘少磊, 王超 申請人:北京博恩康生物科技有限公司