一種高效純化水溶性納米銀顆粒鏈霉親和素偶聯物的方法
【專利摘要】本發明公開了一種適合規模化高效純化水溶性納米銀顆粒鏈霉親和素偶聯物的新方法，屬生物【技術領域】。針對目前納米銀顆粒鏈霉親和素偶聯物純化工藝復雜，回收率低，難以實現規模化生產的弊端，本發明通過采用單端氨基化聚乙二醇封閉納米銀顆粒鏈霉親和素偶聯物的殘留羧基，降低偶聯產物的表面ζ電位，通過調整溶液pH值至4.5，進一步降低偶聯產物在溶液中的凈電荷含量、實現普通高速離心法規模化高效純化納米銀顆粒鏈霉親和素偶聯物。本發明簡化了納米銀顆粒鏈霉親和素偶聯物的實驗操作流程，降低了對分離設備的要求，適合大批量純化納米銀顆粒鏈霉親和素偶聯物，得率在90%以上，且偶聯產物的光特性以及生物活性未見明顯變化。
【專利說明】一種高效純化水溶性納米銀顆粒鏈霉親和素偶聯物的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，涉及納米材料生物學修飾以及偶聯物純化的新方法。【背景技術】
[0002]鏈霉親和素是一種與親和素有相似生物學特性的蛋白質，可以高度特異性地結合一種水溶性的維生素:D_生物素，其與生物素的親和力非常強，它們之間的Kd值接近IO-15M0完整的鏈霉親和素是由四條相同肽鏈組成的四聚體，總分子量約為66.5kDa，并且每一個鏈霉親和素分子可以緊密結合四個生物素分子，平均每條肽鏈(單體)可以結合一個生物素分子。完整的四聚體鏈霉親和素還具有熱穩定性好，對強酸、十二烷基磺酸鈉、尿素、鹽酸胍的耐受性強等特點，這些特點使得生物素-鏈霉親和素系統具有高親和力、靈敏度高、特異性強、穩定性好，信號放大作用等眾多優勢，此外生物素具有非常易于與種類繁多的生物活性分子(如蛋白，核酸和糖類等)發生偶聯的優點，使得生物素-鏈霉親和素廣泛應用于免疫學、分子生物學和組織化學等領域，并已經取得較好的效果。
[0003]以金、銀納米顆粒為代表的貴金屬納米顆粒，具有特殊的光、電、磁等性質，已經發展為一種非常有效的生物探針。目前，金納米顆粒以其良好的生物相容性和光學穩定性，非常高的消光系數，散射光強等優勢代替了傳統的熒光標記物，在細胞成像、DNA雜交、蛋白質相互作用等領域具有廣泛的應用價值。銀納米顆粒(Sliver nanoparticle, SNP)是一種金屬膠體，它和金納米顆粒一樣具有相當強的消光系數，散射信號強，但是與之相比，同等粒徑的兩種納米顆粒，銀納米顆粒的消光系數更高，一般是其100倍左右。以20 nm的金、銀納米顆粒為例，金納米顆粒的消光系數為8.78X IO8 M—1.cm—1，而銀納米顆粒達到了
2.87X IO10 M-1.cnT1。如此強的散射信號為檢測提供了良好的信噪比，有效的降低了檢測限、提高了單分子檢測的靈敏度，為DNA/RNA、活體病毒樣本的醫療檢驗等微量以及痕量的檢測提供了良好的標記探針。`
[0004]金屬納米顆粒及其表面表現出多樣且復雜的光學特性。包括貴金屬納米顆粒的強色彩，薄金屬層的表面等離子共振吸收，以及對金屬表面附近受激發染料的淬滅等。最近發現，熒光標記物與金屬納米顆粒或者貴金屬表面的相互作用被用于獲得熒光信號的增強、基于金納米膠體淬滅的分析以及薄金屬層附近熒光標記物的定向輻射等實驗現象。銀納米顆粒在金屬-增強熒光方面也表現出很大的優勢。除了增強亮度外，金屬-熒光標記物體系還表現出熒光壽命的縮短和穩定性的增加以及光漂白的減少等優點。金屬納米材料與熒光標記物間的距離直接決定了熒光增強的效率，一般認為，10 nm是一個熒光增強效率的距離最優值。但是，在一些大分子蛋白如綠色熒光蛋白以及免疫體系中，銀納米顆粒也存在著金屬-增強熒光的特性。總之，作為一種新型的生物標記物，納米銀顆粒結合有機染料或突光染料后，在細胞標記、活體細胞成像、活體動物體內突光顯微成像以及突光標記的免疫學快速診斷技術等領域具有更為顯著的優勢。其中羧基功能團表面的水溶性納米銀顆粒應用最為廣泛，采用多羧基以及疏水鏈的兩性聚合物是油溶性納米銀顆粒轉化為羧基表面的水溶性納米銀顆粒最常用方法。[0005]由于鏈霉親和素結合生物素類似于化學偶聯的親和效果，因此納米銀顆粒鏈霉親和素偶聯產物被認為制備各類生物熒光探針的共同載體得到了廣泛的應用。羧基化納米銀顆粒鏈霉親和素偶聯常用方法為EDC/NHSS介導的活潑酯方法。在納米銀顆粒與鏈霉親和素偶聯過程中，將納米銀顆粒鏈霉親和素偶聯物與溶液中游離鏈霉親和素進行高效分離，是保證納米銀顆粒鏈霉親和素偶聯物使用效率的前提。目前，納米銀顆粒鏈霉親和素偶聯物純化方法主要包括以下幾種。第一，超速離心方法。由于水溶性納米銀顆粒納米粒子粒徑小，比表面積大，納米材料與鏈霉親和素偶聯物表面含有大量的羧基，因此采用常規離心(低于30000 g離心力)，納米銀顆粒鏈霉親和素偶聯物回收效率普遍偏低(小于50%)，若要將納米銀顆粒鏈霉親和素偶聯物回收效率提高至90%以上，離心速度一般需大于50，000go第二種常見純化方法為凝膠色譜法。該方法利用納米銀顆粒鏈霉親和素偶聯物與鏈霉親和素的分子量差異(表現為光學以及水化粒徑的差異)，利用排阻層析原理進行分離。第三種常用分離方法為超濾分離法。該法利用超濾管的超濾膜截流分子量差異將鏈霉親和素與納米銀顆粒鏈霉親和素偶聯物進行分離的一種方法。同時還有基于瓊脂糖凝膠以及瓊脂糖-聚丙烯酰胺雜合凝膠電泳等的純化分離方法。總之，利用以上純化方法雖然可以獲得較高質量的納米銀顆粒鏈霉親和素偶聯物，但仍存在操作條件苛刻，流程復雜，得率低等缺陷，很難實現規模化生產。
【發明內容】
[0006]水溶性納米銀顆粒是一種良好的納米熒光標記材料,該材料通過與抗體、鏈霉親和素、蛋白A、蛋白G以及配體或受體分子偶聯，可廣泛應用于細胞標記、活體細胞成像、活體動物體內熒光顯微成像以及免疫快速診斷等諸多領域。但是傳統的納米銀顆粒鏈霉親和素偶聯物純化方法存在操作條件苛刻，流程復雜，得率低以及很難實現規模化生產等缺陷。
[0007]本發明的目的是提供一種操作簡便、分離效率高、大批量純化納米銀顆粒鏈霉親和素偶聯物的新方法，具體包括以下步驟:
一種高效純化水溶性納米銀顆粒鏈霉親和素偶聯物的新方法，其特征在于包括以下步驟:(I)將水溶性羧基修飾的納米銀顆粒活化，加入鏈霉親和素溶液，調整溶液pH至7.0~
9.0后，偶聯反應；(2)偶聯反應結束后，溶液中加入單端氨基化聚乙二醇封閉偶聯產物中納米銀顆粒表面殘留的羧基，將反應溶液PH值調整至弱酸性；(3)高速離心，棄上清液，取沉淀。
[0008]步驟(3)后，還有將沉淀用含25%甘油，0.01% NaN3的0.05 mol/L pH 7.0~7.5
磷酸鹽緩沖液溶解步驟。
[0009]所用的水溶性納米銀顆粒為核殼結構的納米銀顆粒，殼層由雙親聚合物組成，外部為大量親水羧基表面，內層為長鏈疏水基團通過與三辛基氧化磷的疏水作用將油溶性納米銀顆粒包裹在殼層內部。
[0010]所述步驟(1)中活化為將水溶性羧基修飾的納米銀顆粒溶解于pH 5.0~6.0，
0.05 mol/L硼酸鹽緩沖液中，分別加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺以及N-羥基硫代琥珀酰亞胺，37°C反應2小時，活化納米銀顆粒羧基。
[0011]所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺以及N-羥基硫代琥珀酰亞胺與納米銀顆粒的摩爾比均為10·0~200:1，優選為150:1 ;所述鏈霉親和素與納米銀顆粒的摩爾比為I~10:1。
[0012]偶聯反應結束后，溶液中加入單端氨基化聚乙二醇至單端氨基化聚乙二醇終濃度為I~2%，充分混勻15~30分鐘。
[0013]步驟(2)中將反應溶液pH值調整至弱酸性為將pH值調整至4.5~5.0，優選為
4.5。
[0014]步驟(3)所述高速離心離心力為28,000~30,000g。
[0015]還包括將沉淀用含25%甘油，0.01% NaN3的0.05 mol/L pH 7.0~7.5磷酸鹽緩沖液溶解備用的步驟。
[0016]步驟(1)用0.1~1.0 M NaOH溶液調整溶液pH至7.5~8.5。
[0017]原理見圖1。
[0018]所述水溶性羧基修飾的納米銀顆粒制備方法為:
將濃度為98%濃硫酸(H2SO4)和濃度為30%雙氧水(H2O2)以體積比(1:3)均勻混合后，置電爐絲加熱至沸騰。取一定量的石英和硅晶片緩緩加入到上述沸溶液中，反應20 min后，用大量的蒸餾水漂洗。漂洗后的石英和硅晶片浸入到聚二烯丙基二甲基氯化銨水溶液(PDDA,1.0 mg/mL)中，反應20 min。將上述反應溶液加入到10 mM Ti (SO4)2水溶液(0.1 MH2SO4)中，反應5 min。然后將反應基質轉移到磷酸緩沖液(pH 4.0)中，放置幾秒后又轉移到另一磷酸緩沖液(pH 4.0)中，放置5 min。最后，用大量的蒸餾水漂洗并置于氮氣(N2)中干燥，形成硅基片。在50°C下，將上述硅基片浸入于10 mM AgNO3溶液，反應24 h后用蒸餾水漂洗I min并置于氮氣(N2)中干燥，形成銀離子摻雜的磷酸肽基質片。將上述基質片浸入于新鮮制備的10 mM NaBH4溶液中5 min，然后用蒸餾水漂洗I min并置于氮氣(N2)中干燥，即得到納米銀顆粒。分別取I g聚馬來酸酐十八醇酯、1.2 g 2-(2-氨基乙氧基)乙醇和1.26 g納米銀顆粒溶解于5 mL 96%乙醇溶液中，置于70°C下反應I h，加熱揮發乙醇，最后得到水溶性羧基化納米銀顆粒。
[0019] 水溶性羧基修飾的納米銀顆粒為核殼結構的納米銀顆粒，殼層由雙親聚合物組成，外部為大量親水羧基表面，內層為長鏈疏水基團，通過與三辛基氧化磷的疏水作用將油溶性納米銀顆粒包裹在殼層內部。將納米銀顆粒溶解于pH 6.0,0.05 mol/L硼酸鹽緩沖液中，加入摩爾比為100~200:1的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺以及N-羥基硫代琥珀酰亞胺，37°C反應2小時，將納米銀顆粒表面羧基轉化為酸性條件下穩定的活潑酯。加入鏈霉親和素溶液，其中鏈霉親和素與納米銀顆粒摩爾比為10:1，用I M NaOH溶液調整溶液pH至8.0~9.0。在pH 8.0~9.0條件下，鏈霉親和素氨基酸殘基中的氨基易于質子化，而納米銀顆粒表面活潑酯化的羧基在弱堿性條件下發生水解，與質子化氨基偶聯形成穩定的酰胺鍵，從而將鏈霉親和素偶聯至納米銀顆粒表面。納米銀顆粒與鏈霉親和素偶聯后，由于空間位阻的原因，納米銀顆粒表面仍會殘留大量未被偶聯的羧基，因此納米銀顆粒鏈霉親和素偶聯物仍舊保持較大的(電位，因此采用普通離心方法無法將納米銀顆粒鏈霉親和素偶聯物與未標記鏈霉親和素進行有效分離。為了降低納米銀顆粒鏈霉親和素偶聯物表面的(電位，本發明通過單端氨基化聚乙二醇的氨基與納米銀顆粒表面游離羧基發生離子交換，使納米銀顆粒鏈霉親和素偶聯物殘留羧基轉換為羥基，提高納米銀顆粒鏈霉親和素偶聯物等電點，同時進一步通過高濃度單端氨基化聚乙二醇(1%~2%)破壞鏈霉親和素表面的水化層，當將溶液PH值調整至4.5時，納米銀顆粒鏈霉親和素偶聯物在普通高速離心下(18，OOO g~20，000 g)即可與溶液中未偶聯鏈霉親和素實現有效分離，其中納米銀顆粒與鏈霉親和素偶聯物的回收率大于90%。
[0020]為了驗證單端氨基化聚乙二醇是否能有效降低羧基化納米銀顆粒的ζ電位，我們以羧基化的水溶性納米銀顆粒為原料，以單端氨基化聚乙二醇為封閉劑，采用EDC法封閉納米銀顆粒表面羧基。然后采用0.1M HCl或NaOH調整羧基化的納米銀顆粒(濃度為0.1μΜ) pH分別至2，3，4，5，6和7，同時加入同等量的0.1M HCl或NaOH溶液至相同濃度的羥基化納米銀顆粒溶液中。以上兩類不同PH值的納米銀顆粒經馬爾文表面電位粒徑儀分析，結果見表1。從表1可知，在相同PH值下，單端氨基化聚乙二醇修飾的羥基化納米銀顆粒表面電位顯著低于羥基化納米銀顆粒，當溶液PH值降至4~5之間，羥基化納米銀顆粒ζ電位下降明顯。
[0021]表1不同pH條件下，羧基化以及羥基化納米銀顆粒的表面電位
【權利要求】
1.一種高效純化水溶性納米銀顆粒鏈霉親和素偶聯物的方法，其特征在于包括以下步驟:(I)將水溶性羧基修飾的納米銀顆粒活化，加入鏈霉親和素溶液，調整溶液pH至7.0~9.0后，偶聯反應；(2)偶聯反應結束后，溶液中加入單端氨基化聚乙二醇封閉偶聯產物中納米銀顆粒表面殘留的羧基，將反應溶液PH值調整至弱酸性；(3)高速離心，棄上清液，取沉淀。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)后，還有將沉淀用含25%甘油，0.01%NaN3的0.05 mo I/L pH 7.0~7.5磷酸鹽緩沖液溶解步驟。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于水溶性納米銀顆粒為核殼結構的納米銀顆粒，殼層由雙親聚合物組成，外部為大量親水羧基表面，內層為長鏈疏水基團通過與三辛基氧化磷的疏水作用將油溶性納米銀顆粒包裹在殼層內部。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中活化為將水溶性羧基修飾的納米銀顆粒溶解于pH 5.0~6.0,0.05 mol/L硼酸鹽緩沖液中，分別加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺以及N-羥基硫代琥珀酰亞胺，37°C反應2小時，活化納米銀顆粒羧基。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺以及N-羥基硫代琥珀酰亞胺與納米銀顆粒的摩爾比均為100~200:1，優選為150:1 ;所述鏈霉親和素與納米銀顆粒的摩爾比為I~10:1。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于偶聯反應結束后，溶液中加入單端氨基化聚乙二醇至單端氨基化聚乙二醇終濃度為I~2%，充分混勻15~30分鐘。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中將反應溶液pH值調整至弱酸性為將PH值調整至4.5~5.0，優選為4.5。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)所述高速離心離心力為28，000~30，OOOg0
【文檔編號】C07K1/13GK103665117SQ201310637210
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月3日 優先權日:2013年12月3日
【發明者】許恒毅, 熊勇華, 羅微, 魏華, 賴衛華, 黃小林 申請人:南昌大學