犬細小病毒單域抗體及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種犬細小病毒單域抗體及其制備方法和應用，所述犬細小病毒單域抗體具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，是以犬細小病毒滅活疫苗免疫羊駝，取外周血得到羊駝抗犬細小病毒血清；提取外周血中RNA，反轉錄生成cDNA；特異引物擴增純化VHH片段；將VHH片段與噬菌粒載體連接并轉化TG1，構建犬細小病毒單域抗體庫；利用犬細小病毒結構蛋白VP2富集所述抗體庫，導入表達菌株E.coilHB2151，IPTG誘導具有生物活性的犬細小病毒單域抗體VHH表達。本發明制備的犬細小病毒單域抗體檢測活性15μg/ml，檢測靈敏度250ng/ml，可作為藥物應用于犬細小病毒病犬的治療中。
【專利說明】犬細小病毒單域抗體及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于臨床獸醫及抗體工程【技術領域】，涉及到一種病毒抗體，特別是涉及一種主要依托羊駝的重鏈抗體來實現其生物表達的犬細小病毒單域抗體，以及該抗體的制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]犬細小病毒病由犬細小病毒(Canine parvovirus,CPV)引起，以發病率高、死亡率高、傳染性強為特點，一年四季皆可發生，出血性腸炎型和心肌炎型犬細小病毒病的死亡率分別為10%~50%、60%~100%，可造成嚴重經濟損失。預防犬細小病毒病的疫苗主要有:滅活苗、弱毒苗和多聯苗，優化的免疫程序可取得較好的免疫效果。但是對市場上疫苗的免疫效果進行檢測調查研究發現，僅20%的疫苗能產生100%保護力的抗體。資料表明，我國寵物犬數量達1.5億，隨著寵物犬的數量增多，研究犬細小病毒病的診斷和防治具有重要意義。
[0003]基于抗原與抗體特異性結合的診斷試劑盒，可檢測抗原，也可檢測抗體，敏感性高、特異性強、穩定性好、操作簡便快速、結果易于分析判定。特異性的抗體對于診斷試劑盒的生產至關重要，目前常用抗體有單克隆抗體、多克隆抗體。在治療方面，早期應用犬細小病毒單克隆抗體及犬細小病毒抗血清等進行特異性治療，可以取得較好的效果。但單克隆抗體規模化生產耗時長，抗血清規模化生產不能保證市場需求而且質量不穩定，而且單克隆抗體和抗血清的免疫原性強，在治療過程中都存在副作用。因此，研究相關特異性強、親和力高、免疫原性低、可規模化生產的抗體具有重要意義。
[0004]普通抗體IgG(免疫球蛋白G)是血清中最重要的抗體，約占血清中免疫球蛋白總量的75%~80%，在體液免疫中起著“主力免疫”作用。IgG具有2條重鏈(H鏈)和2條輕鏈(L鏈)，整個抗體分子分為恒定區(C區)和可變區(V區)，分子量為150~160kDa。研究表明，羊駝血清中除了普通抗體IgG，有近一半的IgG為重鏈抗體，只具有重鏈可變區(VH)、一個鉸鏈區和兩個恒定區(CH2和CH3`)，而對重鏈抗體的可變區克隆構建只有一個重鏈可變區的抗體稱為單域抗體(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody,VHH)，分子量僅為15kD，具有分子量小、結構單一、穿透性好、特異性強、親和力高以及可溶性高、穩定性強、易克隆、高表達、易純化等特點。因此，VHH可減少治療過程中的副作用，可作為生物傳感器診斷用靶標試劑，可用于構建免疫融合物、進行靶向治療，可用于商品化大規模生產。目前，抗體在疾病的治療方面僅限于細胞表面靶標，全抗體由于分子結構復雜，在細胞內表達困難，限制了其在細胞內的應用，VHH免疫原性低，很難激發T細胞的免疫反應，可以作為治療性抗體而長期用藥。總之，VHH作為一種小型化的基因工程抗體，獨特的理化和生物學特性使其在基礎研究、藥物開發和疾病診斷治療等領域具有廣闊的應用前景。
[0005]隨著對基因表達的深入研究，抗體庫的出現為抗體制備提供了一種新的手段，利用抗體庫技術能夠實現抗體的規模化制備，相關的噬菌體展示技術也是近年來建立和發展的利用噬菌體表達外源基因的一項新技術，是一種基因表達產物和親和篩選相結合的技術，其基本原理是將目的基因與編碼噬菌體外殼蛋白的基因相連，插入到噬菌體的表達載體上，從而使多肽或蛋白質與外殼蛋白融合表達并展示在噬菌體的表面，被展示的多肽或蛋白質可保持相對獨立的空間結構和生物活性；利用噬菌體在大腸桿菌系統易于分離擴增，可以通過與配體的結合選擇出表達相應受體的噬菌體顆粒，通過“吸附-洗脫-擴增”的富集過程，可從中篩選出特異性抗體基因，并可直接測定所展示的多肽或蛋白質的某些生物學活性。這些技術在抗體工程中已有應用。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是針對現有犬細小病毒單克隆抗體及犬細小病毒抗血清等特異性治療制劑的缺陷，提供一種分子量小、免疫原性低、特異性強、穩定性強、易克隆表達的犬細小病毒單域抗體，以及該犬細小病毒單域抗體的制備方法和應用。
[0007]為達到上述發明目的，本發明利用噬菌體展示技術，從犬細小病毒滅活疫苗免疫羊駝的外周血中提取RNA，構建CPV-VHH犬細小病毒單域抗體庫，并從抗體庫中篩選獲得具有生物活性的單域抗體。
[0008]本發明的犬細小病毒單域抗體具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0009]本發明上述犬細小病毒單域抗體采用以下步驟進行制備:
1)、提取經犬細小病毒免疫后羊駝外周血中的RNA，反轉錄生成cDNA;特異引物擴增純化犬細小病毒單域抗體VHH片段；
2)、犬細小病毒單域抗體VHH片段與噬菌粒載體連接構建噬菌體重組載體，轉化感受態大腸桿菌TG1，構建犬細小病毒噬菌體單域抗體庫；
3)、以犬細小病毒結構蛋白VP2加入活化的犬細小病毒噬菌體單域抗體庫中，甘氨酸溶液競爭性洗脫，富集噬菌 粒重組載體導入感受態細胞疋HB2151菌株中，IPTG誘導產生具有生物活性的犬細小病毒單域抗體VHH蛋白。
[0010]更具體的，步驟1)中是分別以重鏈可變區特異引物CALL01/ CALL02和VHH特異引物VHH For2/VHH Rev2進行第一次和第二次PCR擴增，回收純化犬細小病毒單域抗體VHH片段。
[0011]步驟2)中，是先以犬細小病毒單域抗體VHH片段與質粒載體PMD-18T simple連接構建質粒表達載體PMD-18T-VHH，轉化大腸桿菌感受態DH5 α，回收純化VHH，與噬菌粒載體構建噬菌體重組載體，轉化感受態大腸桿菌TG1，構建犬細小病毒噬菌體單域抗體庫。
[0012]其中，所述的噬菌粒載體為pCANTAB 5E，構建的噬菌體重組載體為pCANTAB5E-VHH。
[0013]本發明獲得的犬細小病毒單域抗體可以作為治療藥物，應用于犬細小病毒病犬的治療中。
[0014]本發明基于羊駝獨特的重鏈抗體，利用抗體庫技術、噬菌體表面展示技術，以犬細小病毒免疫羊駝、建立犬細小病毒單域抗體庫，并從中獲得了具有生物活性的犬細小病毒單域抗體，可實現抗體的規模化制備。
[0015]羊駝血清中除了普通抗體IgG，有近一半的IgG為重鏈抗體。以皮下多點免疫法對兩只健康成年羊駝進行犬細小病毒免疫，4個免疫周期后，抗血清效價高于1:64。試驗表明，以飽和硫酸銨鹽析法從羊駝抗犬細小病毒抗血清中初步分離IgG，通過蛋白G親和層析可以分離純化出IgGl和IgG3，分子量分別在90kDa和180kDa左右；未結合IgG通過蛋白A親和層析可以分離出IgG2，分子量在75kD左右。純化后的羊駝IgG各亞型SDS-PAGE電泳
條帶單一。
[0016]本發明利用細胞形態學和噻唑藍染色，試驗觀察本發明制備的羊駝抗犬細小病毒抗血清對F81細胞生長及增殖抑制率的影響，結果表明，羊駝抗犬細小病毒抗血清組、犬細小高免血清組細胞生長旺盛，緊密相連，細胞均質而透明；PBS組細胞數量減少、細胞游離、呈拉網狀態。細胞增殖抑制率檢測表明，羊駝抗犬細小病毒抗血清組、犬細小高免血清組、PBS組與病毒同時作用于F81細胞96h后，細胞增殖抑制率分別為3.9%, 6.2%, 80.8%。
[0017]本發明制備的基于羊駝重鏈抗體表達的犬細小病毒單域抗體具有分子量小、結構單一、穿透性好、特異性強、親和力高等特點。本發明利用五輪“吸附-洗脫-擴增”富集法，對噬菌體抗體庫進行篩選富集，使噬菌體抗體庫富集增長了近4000倍，陽性率達到92%。以ELISA檢測犬細小病毒單域抗體的檢測活性為15Pg/ml，檢測靈敏度為250ng/ml。
[0018]本發明制備的犬細小病毒單域抗體制劑與常規治療相比，可使死亡率降低，治愈率提高，并可縮短治療周期，使治愈一只犬細小病犬的費用降低10%~20%。
【具體實施方式】
[0019]下面通過實施例對本發明做進一步的詳細說明。應該理解的是，下述實施例僅用于更加清楚地解釋本發明，但不能以此限定本發明的保護范圍。在本發明權利要求所限定的保護范圍內，對其進行的無實質性變化的改變、修改或等效變更，都應落入本發明的保護范圍內。
[0020]1、犬細小病毒滅活疫苗免疫羊駝
取CPV病毒液置入三角燒瓶中，加分析純甲醛稀釋至終濃度0.25wt%,邊加邊搖勻，加塞子并用滅菌紗布包之，37°C作用24~48h ;去塞子，用紗布包三角燒瓶口，間隔搖動，至甲醛味散盡。
[0021]等量病毒液與弗氏完全佐劑乳化，檢測效價，作為第一次免疫疫苗；等量病毒液與弗氏不完全佐劑乳化，用血凝試驗(HA試驗)檢測其血凝價，測得結果為29，以此作為疫苗對羊駝進行免疫。
[0022]健康成年雄性羊駝兩頭(B014、D007)，皮下多點免疫，每隔10天免疫一次，共分四次。每次免疫前頸總動脈取血5mL，離心后收集上層血清，4°C保存。每次免疫完后,血凝抑制試驗(HI試驗)測抗體效價，效價高于1:64后頸總動脈取血10mL，離心后收集上層血清，獲得羊駝抗犬細小病毒血清。
[0023]2、構建犬細小病毒單域抗體庫
向250 μ L新鮮全血中加入1000 μ L紅細胞裂解液，12000r/min離心30s，留下的白細胞團中加入ImL trizol,Trizol法提取外周血RNA,用NanoDrop ND-1000全波長紫外/可見光掃描分光光度計測定RNA濃度和OD值，用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的完整性。
[0024]以RNA為模板,反轉錄生成cDNA,以β-actin For、β-actin Rev為引物,擴增內參基因β -actin檢測cDNA有效性。
[0025]β -actin For:5，-ACCCTCATAGATGGGCACAG-3，。
β-actin Rev:5’ -AGCCATGTACGTAGCCATCC-3’。
[0026]以cDNA為模板，用重鏈可變區特異引物CALL01、CALL02為引物進行第一次擴增，特異擴增產物為600bp的VHH-CH2和900bp的VH-CH1-CH2。
[0027]CALL01:5’ -GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3’。
[0028]CALL02:5’ -GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3’。
[0029]凝膠回收試劑盒回收純化VHH-CH2，以其為模板，VHH特異引物VHH For2、VHH Rev2為引物進行第二次擴增，特異擴增產物為400bp的VHH。回收純化犬細小病毒單域抗體VHH片段，用1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。
[0030]VHH For2:5， -CCTTTCTATGCAGGCCCAGCCGGCCGCATGGCCGAKGTSCAGCT-3，。
[0031 ] VHH Rev2:5，-GTTATTATTATTCAGATTATTATGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCWGGGTCC-3，。
[0032]凝膠回收試劑盒回收純化犬細小病毒單域抗體VHH，于10 μ L連接體系中連接VHH與質粒載體PMD-18T simple，構建連接物質粒表達載體pMD-18T-VHH。以連接物轉化大腸桿菌感受態DH5a，并以藍白斑篩選挑取白色單克隆菌落于5mL LB培養基中，37°C，200r/min，振蕩培養12~16h，質粒提取試劑盒提取菌液質粒，引物VHH For2、VHH Rev2進行PCR鑒定，并進行Not I和Sfi I酶切鑒定。
[0033]Sfi I/Not I雙酶切質粒表達載體pMD-18T-VHH和噬菌粒載體pCANTAB 5E，回收純化的VHH，與噬菌粒載體pCANTAB 5E連接構建噬菌體重組載體pCANTAB 5E-VHH。乙醇沉淀法純化連接產物，并轉化經氯化鈣法制備的感受態大腸桿菌TG1，挑取單克隆菌落，PCR鑒定和酶切鑒定后，陽性克隆質粒第2次轉化TG1，挑取單克隆菌落進行PCR鑒定。取二次轉化的菌液進行10倍、100倍、1000倍滴度稀釋，涂布于平板上培養，37°C倒置培養過夜，次日計菌落數，100倍稀釋菌生長良好，單克隆明顯，100 μ L的涂布菌液生長出約200個單克隆。隨機挑取單克隆菌株，PCR鑒定陽性率為90%，有效庫容1.8Χ 107。
[0034]3、犬細小病毒單域抗體表達
利用抗原抗體親和吸附原理，以犬細小病毒結構蛋白VP2為捕捉抗原，加入活化的犬細小病毒噬菌體單域抗體上清，室溫靜置90min以上，中間不斷反復搖動96孔板，棄去未結合噬菌體，用PBS/Tween20(0.05%)洗滌，甘氨酸-鹽酸洗脫緩沖液競爭性洗脫，以五輪“吸附-洗脫-擴增”富集法對噬菌體抗體庫進行篩選富集，噬菌體抗體庫原始庫容1.8X107cfu,活化庫容3.6X10ncfu,第一次到第五次富集庫容分別為7.8X10ncfu,
1.07X1012cfu, 3.24X1012cfu,9.8X1013cfu,3.lX1015cfu。
[0035]第五次富集結束后，取噬菌體抗體質粒轉染TG1菌過夜培養，隨機挑選平板上單菌落進行PCR檢測，陽性率92%。
[0036]噬菌體抗體庫(pCANTAB 5E-VHH)和噬菌粒(pCANTAB 5E)分別轉染HB2151感受態細胞，挑取單菌落培養，進行菌液PCR實驗，同時提取質粒，用Sfi I/Not I雙酶切pCANTAB 5E-VHH噬菌粒，檢驗導入正確目的載體。
[0037]富集后的噬菌體重組載體pCENTAB 5E-VHH導入到感受態細胞疋co7i HB2151菌株中，由于該宿主細菌無抑制琥珀終止密碼子的功能，琥珀終止密碼子正常作用，在IPTG誘導下大量表達犬細小病毒單域抗體VHH，產生具有生物活性的可溶性蛋白質。
[0038]利用pCENTAB 5E載體的融合蛋白質標簽E_tag特點，設計一抗為兔源Ant1-E-Tag, 二抗為羊抗兔IgG-HRP,進行western-blot檢測，蛋白樣品中都含有Ε-Tag標簽的目的蛋白。
[0039]96孔板包被VP2·蛋白(終濃度15Pg/ml)，將重組表達的VHH蛋白進行梯度稀釋，ELISA檢測單域抗體活性15Pg/ml。用不同濃度的VP2蛋白包被96孔板，加入VHH蛋白50μ1，ELISA檢測單域抗體的靈敏度為250ng/ml。
[0040]將大量表達且經檢測具有生物活性的犬細小病毒單域抗體VHH真空冷凍干燥，分裝安瓿瓶中封口保存。
[0041]以上述制備的羊駝抗犬細小病毒單域抗體對20只犬細小病犬進行治療，觀察其治療效果，常規治療組平均連續治療9天后，死亡率40%，存活率60% ；VHH單域抗體治療組平均連續治療8天后，死亡率20%，存活率為80%。
[0042]我國寵物犬數量達1.5億，犬細小可造成嚴重經濟損失。本發明制備的犬細小病毒單域抗體用于犬細小病犬的治療，常規治療組每只病犬治愈期間(9天)總計費用800元,VHH單域抗體治療組每只病犬治愈期間(8天)總計費用640~720元。與常規治療相t匕，VHH單域抗體治療可使死亡率降低，治愈率提高，可縮短治療周期，使治愈一只犬細小病犬的費用降低10%~20% 。
【權利要求】
1.犬細小病毒單域抗體，具有SEQID N0.1所示的核苷酸序列。
2.權利要求1犬細小病毒單域抗體的制備方法，采用以下步驟進行制備:1)、提取經犬細小病毒免疫后羊駝外周血中的RNA，反轉錄生成cDNA;特異引物擴增純化犬細小病毒單域抗體VHH片段；2)、犬細小病毒單域抗體VHH片段與噬菌粒載體連接構建噬菌體重組載體，轉化感受態大腸桿菌TG1，構建犬細小病毒噬菌體單域抗體庫；3)、以犬細小病毒結構蛋白VP2加入活化的犬細小病毒噬菌體單域抗體庫中，甘氨酸溶液競爭性洗脫，富集噬菌粒重組載體導入感受態細胞疋HB2151菌株中，IPTG誘導產生具有生物活性的犬細小病毒單域抗體VHH蛋白。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征是所述步驟1)中，分別以重鏈可變區特異引物CALL01/ CALL02和VHH特異引物VHH For2/VHH Rev2進行第一次和第二次PCR擴增，回收純化犬細小病毒單域抗體VHH片段。
4.根據權利要求2所述的制備方法，其特征是先以犬細小病毒單域抗體VHH片段與質粒載體pMD-18T simple連接構建質粒表達載體pMD-18T_VHH，轉化大腸桿菌感受態DH5 α，回收純化VHH，與噬菌粒載體構建噬菌體重組載體，轉化感受態大腸桿菌TG1，構建犬細小病毒噬菌體單域抗體庫。
5.根據權利要求2或4所述的制備方法，其特征是所述的噬菌粒載體為pCANTAB5E。
6.根據權利要求2或4所述的制備方法，其特征是所述構建的噬菌體重組載體為pCANTAB 5E-VHH。
7.權利要求1犬細 小病毒單域抗體在制備治療犬細小病毒病藥物中的應用。
【文檔編號】C07K16/08GK103665152SQ201310636895
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月2日 優先權日:2013年12月2日
【發明者】段智變, 孫耀貴, 程志學, 員世宇, 詹俊杰, 楊妍麗, 李小茜 申請人:山西農業大學