一種雙光子熒光探針及其制備方法和用途
【專利摘要】本發明公開了一種雙光子熒光探針及其制備方法和用途，其中雙光子熒光探針的結構由下式表示：本發明雙光子熒光探針在半胱氨酸或高半胱氨酸與其他氨基酸共存的體系中，表現出較高的選擇性和靈敏性。細胞毒性測試表明本發明雙光子熒光探針對細胞幾乎沒有毒性作用，雙光子熒光顯微成像實驗表明本發明雙光子熒光探針對293FT細胞滲透性好，適于細胞內檢測氨基酸小分子的分布。
【專利說明】一種雙光子熒光探針及其制備方法和用途
一、【技術領域】
[0001]本發明涉及一種雙光子熒光探針、其制備方法及其用途，可以通過雙光子成像定性檢測細胞中半胱氨酸或高半胱氨酸。
二、【背景技術】
[0002]氨基酸比如半胱氨酸、高半胱氨酸以及谷胱甘肽在生物系統中發揮著重要的作用。他們有著相同的結構式，當這些氨基酸的濃度達到一定程度時，會導致一系列的疾病，比如增長放緩、頭發褪色、水腫、嗜睡、肝損傷、肌肉和脂肪減少、皮膚病變和阿爾茨海默氏癥。如何檢測他們是非常重要的并且引起很多科學家的興趣。然而定性地在細胞中檢測氨基酸分子還是很少，因此在體內外檢測氨基酸小分子尤為重要。[0003]熒光探針是在一定體系內，當一種物質或體系中某一物質性質發生變化時，熒光信號能發生相應改變的分子。熒光光譜由于其檢測方便，靈敏等優點在痕量檢測中展現了優越的性能。
[0004]喹啉具有良好的光譜特性和水溶性，并且對細胞也是低毒性。因此喹啉是一個很好的突光報告基團。喹啉作為突光團已報道的文獻很多，但大部分局限于單光子突光探針，雙光子熒光探針報道甚少。熒光探針對半胱氨酸/高半胱氨酸檢測的雙光子熒光探針更為稀少。
[0005]目前半胱氨酸/高半胱氨酸檢測熒光探針大部分為單光子熒光探針，然而單光子熒光探針不僅易使生物本體產生自發熒光干擾，而且短的激發波長還會對細胞產生光致毒。近幾年來，雙光子熒光探針作為一個科學家感興趣的研究課題，開始逐步替換單光子熒光探針，雙光子熒光探針具有近紅外激發、暗場成像、避免熒光漂白和光致毒、定靶激發、高橫向分辨率、降低生物組織吸收系數及降低組織自發熒光干擾等優點。
三、
【發明內容】
[0006]本發明旨在提供一種雙光子熒光探針及其制備方法和用途，所要解決的技術問題是通過分子設計遴選合適的熒光探針結構，以實現雙光子成像定性檢測細胞中半胱氨酸或高半胱氨酸，具有選擇性專一、靈敏度高、檢測濃度低的優點，細胞毒性測試表明本發明對細胞幾乎沒有毒性作用。
[0007]本發明雙光子熒光探針，是以喹啉為母體，簡稱熒光探針或熒光探針分子(NQ)，其結構由下式表示:
[0008]
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Wn人隱。[0009]本發明雙光子熒光探針的制備方法，按以下步驟操作:
[0010](I)將對碘苯胺15g(68.49mmol)和6mol/L的鹽酸IOOmL加入反應器中，升溫至105°C，待固體完全溶解后向反應器中滴加巴豆醛12g(171mmol)，保溫反應并用TLC跟蹤至原料反應完畢，反應結束后冷卻至室溫，反應液倒入200mL水中，用乙酸乙酷卒取以除掉未反應的巴豆醛，水相用氨水中和至pH值為8，再用乙酸乙酯萃取，合并有機相，有機相用無水硫酸鈉干燥并旋蒸后得到粗產物，重結晶(溶劑為乙酸乙酯和石油醚按體積比1:20構成的混合溶劑)后得到中間體I;
[0011](2)將中間體18g(29.74mmol)加入圓底燒瓶中，加入1，4-二氧六環溶解，隨后加熱至60°C，每隔十分鐘加一次二氧化硒0.82g(7.43mmol)，二氧化硒的加入總量是4.95g，升溫至80°C反應2.5小時，反應結束后冷卻至室溫，過濾并用1，4-二氧六環洗滌，收集有機相，旋蒸后得到粗產物，粗產物用柱層析分離提純(二氯甲烷作為洗脫劑)得到中間體2 ；
[0012](3)將中間體 24g(14.13mmol)、4- (N，N-二甲基)苯乙炔 2.08g(14.13mmol)、三苯基磷二氯化IE 0.1g (0.14mmol)、碘化亞銅0.5g (2.6mmol)以及三乙胺IOmL加入圓底燒瓶中，加入甲苯溶解，室溫反應8小時，過濾后收集濾液，將濾液旋蒸后得到粗產物，重結晶(溶劑為乙酸乙酯和石油醚按體積比1:5構成的混合溶劑)后得到雙光子熒光探針NQ。
[0013]本發明熒光探針分子NQ的合成過程如下:
[0014]
【權利要求】
1.一種雙光子熒光探針，是以喹啉為母體，其特征在于其結構由下式表示:
2.—種權利要求1所述的雙光子熒光探針的制備方法，其特征在于按以下步驟操作: (1)將對碘苯胺15g和6mol/L的鹽酸IOOmL加入反應器中，升溫至105°C，完全溶解后向反應器中滴加巴豆醛12g，保溫反應至原料反應完全，反應結束后冷卻至室溫，反應液倒入水中，用乙酸乙酯萃取以除掉未反應的巴豆醛，水相用氨水中和至pH值為8，再用乙酸乙酯萃取，合并有機相，有機相用無水硫酸鈉干燥并旋蒸后得到粗產物，重結晶后得到中間體I ; (2)將中間體18g加入圓底燒瓶中，加入I,4- 二氧六環溶解，隨后加熱至60°C，加入二氧化硒4.95g,升溫至80°C反應2.5小時,反應結束后冷卻至室溫,過濾并用1，4- 二氧六環洗滌，收集有機相，旋蒸后得到粗產物，粗產物用柱層析分離提純得到中間體2 ； (3)將中間體24g、4-(N，N-二甲基)苯乙炔2.08g、三苯基磷二氯化鈀0.lg、碘化亞銅0.5g以及三乙胺IOmL加入圓底燒瓶中，加入甲苯溶解，室溫反應8小時，反應結束后過濾，收集濾液，將濾液旋蒸后得到粗產物，重結晶后得到雙光子熒光探針NQ。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于: 步驟(2)中二氧化硒均分為六次加入，每次加入的間隔時間為10分鐘。
4.一種權利要求1所述的雙光子熒光探針的用途，其特征在于:在定性檢測細胞中半胱氨酸或高半胱氨酸時作為檢測試劑的應用。
【文檔編號】C07D215/14GK103614135SQ201310631689
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月29日 優先權日:2013年11月29日
【發明者】孟祥明, 葉維鵬, 蔡玉磊, 汪恕欣, 朱滿洲, 馮燕 申請人:安徽大學