新的腫瘤血清標志物及其應用的制作方法

新的腫瘤血清標志物及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種新的腫瘤血清標志物及其應用，具體地說，本發明涉及POTE蛋白的自身抗體在作為腫瘤血清標志物中的應用，還涉及檢測POTE蛋白的自身抗體的試劑在制備用于癌癥的檢測、輔助診斷和/或預后判斷的組合物中的應用，同時涉及檢測POTE蛋白的自身抗體的試劑、檢測POTE蛋白的自身抗體的方法，還涉及富集純化POTE蛋白的自身抗體的方法，此外還涉及按照所述方法富集純化得到的POTE自身抗體及其應用。
【專利說明】新的腫瘤血清標志物及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種新的腫瘤血清標志物及其應用，屬于生物技術和醫學領域，具體地說,本發明涉及一種新的腫瘤血清標志物POTE的自身抗體、自身抗體相應識別抗原的序列和這種抗原蛋白的重組技術、富集和純化POTE自身抗體的親和層析柱的制備方法、從人血清富集純化這種自身抗體的方法和以及檢測人血清POTE自身抗體的技術方法。本發明還公開了 POTE自身抗體和相應檢測方法的用途，如用于診斷和治療腫瘤。
【背景技術】
[0002]腫瘤是目前世界第二大死因。在2008年，約有1，270萬新發病例，因腫瘤死亡的人數達到760萬。盡管現代醫學飛速發展，并且在腫瘤研究和治療方面也不斷大量投入，但是當腫瘤發生局部擴散和遠端轉移等后期階段時，現代治療手段也是一籌莫展，對腫瘤治療收效甚微；而許多患者的腫瘤在被診斷時已經處于晚期階段。在過去幾十年中，這些晚期腫瘤患者的5年生存率沒有發生太大變化。相反的是，早期腫瘤患者的預后相對來說要好很多(Etzioni R, Urban N, Ramsey S，McIntosh M, Schwartz S，Reid B, Radich J, AndersonG&Hartwell L (2003).The case for early detection.Nat Rev Cancer3, 1- 10)。現代醫學科學的進步和先進的醫療手段對于早期階段的腫瘤，特別是原位腫瘤的治療具有顯著的療效。因此，現代醫學已經把重點聚焦于腫瘤的早期發現，使腫瘤在發展到晚期之前得到有效的治療。
[0003]腫瘤早期檢測和發現就是要在腫瘤擴散和轉移之前、或在腫瘤發展到不可治療之前發現腫瘤。在腫瘤還處在原位或可治愈階段發現腫瘤，不但可以降低死亡率，而且還可以降低腫瘤發病率和因治療腫瘤而帶來的巨大經濟和社會負擔。
[0004]腫瘤的早期診斷和發現研究主要包括以下階段:1、潛在腫瘤標志物如基因、蛋白或抗原的發現或腫瘤影像工具的發明；2、將發現的腫瘤標志物轉化為甄別腫瘤的篩選工具，應用于臨床；3、對所建立的腫瘤早期診斷方法及其應用的評估。
[0005]腫瘤標志物是指在腫瘤的發生、發展過程中，由腫瘤細胞本身所產生的、或者由機體應對腫瘤細胞而產生的特異性分子。這些分子可以反映腫瘤的存在和進展，往往特異性出現在腫瘤患者，而在正常人不存在、或其表達水平與腫瘤患者相比有顯著差異。這些分子通常屬于蛋白質、多肽、核酸或小分子化合物，主要包括癌基因及其產物、激素、酶(同工酶)、腫瘤特異或相關抗原以及相應針對這些抗原的自身抗體、多胺等。比如，1846年發現的Bence-Jones蛋白被應用于多發骨髓瘤的診斷,使其成為第一個腫瘤標志物；1956年發現的AFP，應用于肝癌的診斷；1965年發現了 CEA，應用于結腸癌的診斷。1978年Herberman在美國NCI召開的人類免疫及腫瘤免疫診斷會上首次提出腫瘤標志物的概念以后，腫瘤標志物廣泛應用于臨床。目前發現的具有臨床意義的腫瘤標志物已達100多種。理想的腫瘤標志物應有以下特征:(I)靈敏度高；(2)特異性好；(3)能對腫瘤進行定位；(4)與病情嚴重程度、腫瘤大小或分期有關；(5)能監測對腫瘤治療的效果；(6)監測腫瘤的復發；(7)預測腫瘤的預后。由于腫瘤病因的復雜性，沒有一種腫瘤是單一類型的，故發現“理想”的腫瘤標志物就十分困難。至今為止，尚無一種“理想”的腫瘤標志物。
[0006]目前發現的具有臨床意義的100多種腫瘤標志物中，有一大部分是存在于患者的血液中，比如許多腫瘤相關抗原(TAA)或腫瘤特異或癌胚抗原，腫瘤相關抗體或自身抗體等。這些血清中的腫瘤標志物的存在給腫瘤早期的檢測和診斷提供了可能和便捷途徑。一方面這些血清標志物方便檢測，避免了對病變部位的各種傷害性探查，從而易于對人群進行大規模篩查；另一方面，有些血清標志物，如腫瘤相關的自身抗體或特異抗體，在腫瘤早期階段出現，而且靈敏度較高，可作為腫瘤的早期診斷指標。因此，探索和發現那些在腫瘤發生之前和起始階段的血清標志物，對于腫瘤的早期發現和診斷具有重要意義(WagnerPD, Verma M&Srivastava S (2004).Challenges for biomarkers in cancer detection.AnnN Y AcadSci1022,9-16)。
[0007]腫瘤相關自身抗體是一類最具吸引力的腫瘤標志物。在正常細胞早期癌變過程中和腫瘤發生的起始階段，腫瘤細胞表達的相關抗原可能出現在病變部位。機體的免疫應答可以誘導產生針對這些分子的較高滴度的相應抗體，它們存在于人體血液循環系統(Lu H，Goodell V,Disis ML.Humoral immunity directed against tumor associatedantigens as potential biomarkers for the early diagnosis of cancer.J ProteomeRes2008;7:1388 - 94 ;Anderson KS，Labaer J.The sentinel within: exploiting theimmune system for cancer biomarkers.J ProteomeRes2005;4:1123 - 33)。這些自身抗體具有在血液中穩定性高、停留期長、出現早等特點，而且通過免疫學等手段和方法很容易被檢測。相反，許多腫瘤相關抗原如傳統的腫瘤標志物CA-15-3、CA-19-9, CA-125和CEA等是從較大的腫瘤組織脫落釋而來，只有當腫瘤生長到較大體積時，才能在血清中達到足夠的濃度；其次，它們釋放出來后經過血液稀釋后濃度很低；而且還可能進一步被機體的免疫系統清除(J.-Y.Zhang, C.A.Casiano, X.-X.Peng, J.A.Koziol, E.K.L.Chan, andE.M.Tan, ^Enhancement of antibody detection in cancer using panel of recombinanttumor-associated antigens,，，Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention,vol.12，n0.2，pp.136 - 143，2003)。因此，相對而言，腫瘤相關抗原的自身抗體作為腫瘤早期標志物，在腫瘤早期發現中更具潛在價值，在臨床上應用前景廣泛。目前，一系列腫瘤相關抗原的自身抗體被發現，包括p53，MUC-l，熱休克蛋白(HSP-27，HSP-60，HSP-90)、HER2、c_myc、CT抗原NY-ES0-1、lipophi I in B等；它們與腫瘤的發生和預后存在一定關系。但是這些分子的自身抗體作為腫瘤早期發現和診斷的指標都缺乏較高的特異性和敏感性，不能單獨用于腫瘤的早期診斷和預后評估(Piura E, Piura B.Autoantibodies to tumor-associatedantigens in breast carcinoma.J Oncol.2010; 2010:264926)。造成這些抗體特異性和敏感性低的一個主要的原因是，誘導這些自身抗體產生的相應腫瘤相關抗原分子并非腫瘤細胞所特有，在正常細胞也普遍表達。因此，尋找腫瘤特異性抗原分子的自身抗體，對于解決以上特異性和敏感性問題，對于腫瘤早期發現和診斷具有重要意義。
[0008]腫瘤特異性抗原是腫瘤細胞發生發展過程中所表達的、絕大部分正常組織和細胞不表達的蛋白質分子；從理論上講，這樣的抗原能夠誘導機體產生的特異性的自身抗體。腫瘤睪丸(Cancer-Testis, CT)抗原就屬于這樣一類分子。CT抗原主要表達于人類生殖細胞，而在成年體細胞表·達很低或不表達；但是，當細胞癌變和腫瘤發生時，這類CT抗原基因可以重新激活，異常高水平表達。大約一半以上的CT抗原由X性染色體編碼，它們也因此被稱之為CT-X，以便區分于常染色體來源的編碼CT抗原(G.Curiglianoj G.Vialej M.Ghioni et al.，Cancer-testis antigen expression in triple-negative breastcancer, ” Annals of Oncology ；T.Suyamaj T.Shiraishij Y.Zeng et al.，“Expressionof cancer/testis antigens in prostate cancer is associated with disease progression, ”Prostate，vol.70，n0.16，pp.1778 - 1787，2010)。CT 抗原的表達往往與腫瘤預后和腫瘤病理分級和臨床分期相關。近期研究發現，一些CT抗原如NY-ES0-1、MAGE-A 在三陰性(ER-，PR-, and HER2-)乳腺癌表達增高(G.Curiglianoj G.Vialej M.Ghioni et al.，“Cancer-testis antigen expression in triple-negative breastcancer，，，Annals of Oncology ；Grigoriadis A, Caballero OL，Hoek KSj da Silva L，ChenYT，Shin SJ，Jungbluth AA，Miller LDj Clouston D，Cebon J，Old LJ，Lakhani SR，SimpsonAJj Neville AM.CT-X antigen expression in human breast cancer.Proc Natl Acad SciU S A.2009; 106(32): 13493-8)。
[0009]針對CT抗原的自身抗體如NY-ESO-1已經在許多腫瘤包括乳腺癌中被證實，并與其他腫瘤標志物聯合使用可用于臨床腫瘤早診(C.Chapman, A.Murray, J.Chakrabartiet al., “Autoantibodies in breast cancer: their use as an aid to earlydiagnosis, ^Annals of Oncology, vol.18，n0.5，pp.868 - 873，2007)。血清 CT 抗原的自身抗體的存在為腫瘤早期發現和診斷以及預后都有重要意義。但是，一個普遍存在的難題是，目前尚不清楚哪些CT抗原可以誘導機體產生一定滴度的、可檢測的自身抗體；通過什么方法可以證實這些自身抗體的存在，以及如何檢測這些自身抗體。另外，對于這些新型自身抗體與腫瘤早期發現、診斷和預后之間的關系不清楚，很大程度限制了其臨床應用價值。
[0010]因此，探索和發現CT抗原自身抗體及其檢測方法具有重要意義。

【發明內容】

[0011]本發明的目的在于研究提供一種新的自身抗體及其相關檢測方法與應用，為人類腫瘤早期發現、診斷和治療以及預后判斷提供依據。
`[0012]本案發明人在研究發現了一個的蛋白質分子POTE的自身抗體。
[0013]POTE是一組只表達于前列腺、卵巢、睪丸和胎盤組織的一組蛋白家族分子。在人類基因組中，13個高度同源的、不同亞型的POTE基因分別分布在8個不同的染色體上(2，8，13，14，15，18，21，和22)。盡管不同亞型分子大小不一，但它們所編碼的蛋白在N端都有3個富含半胱氨酸結構域；此外分子中還有分別包含4-7個ankyrin重復序列和SPECTRIN樣螺旋結構域。這個分子在細胞的定位主要在細胞質膜和胞漿(BeraTKj Zimonjic DB，Popescu NCj Sathyanarayana BK，Kumar V,Lee B，Pastan 1.POTEj ahighly homologous gene family located on numerous chromosomes and expressedin prostate, ovary, testis, placenta, and prostate cancer.Proc Natl Acad Sci U SA.2002;99(26): 16975-80)。
[0014]盡管POTE在人體大部分重要組織不表達，但是在許多腫瘤如乳腺癌、前列腺癌、肺癌等異常表達；其次，某些亞型還在人類胚胎干細胞中表達(Bera TKj Saint Fleur A, LeeY, Kydd A, Hahn Y，Popescu NCj Zimonjic DB，Lee B，Pastan 1.POTE paralogs are inducedand differentially expressed in many cancers.Cancer Res.2006Janl;66(I):52-6 ；Bera TK，Saint Fleur A，Ha D，Yamada M，Lee Y，Lee B，Hahn Y，Kaufman DS，Pera M，Pastan1.Selective POTE paralogs on chromosome2are expressed in human embryonic stemcells.Stem Cells Dev.2008; 17 (2): 325-32)。因此，理論上，POTE 具備 CT 抗原的特點，其自身抗體是潛在的重要的腫瘤標志物。
[0015]盡管理論上POTE是一個CT抗原，具有誘導機體產生自身抗體的可能性，但是一直以來沒有人在人體血液中證明和檢測到這種蛋白質自身抗體的存在。本發明中首先通過構建不同結構區域POTE蛋白的原核表達蛋白、純化這些重組蛋白質并利用它們作為抗原去富集人類不同類型腫瘤患者血清中的抗體，證實了該自身抗體的存在；其次，利用本發明所表達純化的POTE片段，成功建立了檢測POTE自身抗體的ELISA方法；進一步，通過對正常人、腫瘤患者和非腫瘤患者血清POTE的檢測，發現POTE特異性存在于70-80%腫瘤患者血清，而在健康人血清中幾乎檢測不到(1%)，這些結果提示，POTE自身抗體是一種特異性和靈敏度高的腫瘤血清標志物，可用于腫瘤的篩查和早期發現，對腫瘤的治療和預后都有重要價值。
[0016]從而，根據本發明的實驗研究，本發明提供了 POTE蛋白的自身抗體在作為腫瘤血清標志物中的應用。POTE自身抗體是一種特異性和靈敏度高的腫瘤血清標志物。
[0017]根據本發明的具體實施方案，一方面，本發明提供了檢測POTE蛋白的自身抗體的試劑在制備用于癌癥的檢測、輔助診斷和/或預后判斷的組合物中的應用。本發明通過實驗證實，通過檢測POTE自身抗體的方法來診斷腫瘤具有比其他腫瘤抗原檢測方法如CA199、CA125、CEA等更具敏感性和特異性。
[0018]根據本發明的具體實施方案，優選地，所述檢測POTE蛋白的自身抗體的試劑包括?與POTE蛋白的自身抗體特異性結合的重組POTE蛋白或POTE多肽片段，或用于在PCR中合成編碼所述POTE蛋白或POTE多肽片段的基因DNA鏈和/或其cDNA鏈的PCR引物，或編碼所述POTE蛋白或POTE多肽片段的基因序列或包含該基因序列的表達載體。
[0019]根據本發明的具體實施方案，所述與POTE蛋白自身抗體特異性結合的POTE多肽片段優選包括:
[0020](a)由 SEQ ID N0.USEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3 或 SEQ ID N0.4 所示的氨基酸序列組成的多肽片段；或
[0021](b)在(a)限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且與(a)具有相同功能的由(a)衍生的多肽片段；
[0022]更優選地，所述與POTE蛋白自身抗體特異性結合的POTE多肽片段還可進一步包括:由SEQ ID N0.6所示的氨基酸序列組成的多肽片段，和/或由SEQ ID N0.8所示的氨基酸序列組成的多肽片段。或進一步包括與POTE-E多肽片段(如SEQ ID N0.USEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3,SEQ ID N0.4,SEQ ID N0.6 或 SEQ ID N0.8)高度同源的其他 POTE 家族成員的多肽片段，例如來自 POTE-A、POTE-B, POTE-C, POTE-D, POTE-F, POTE-G, Ρ0ΤΕ-Η、Ρ0ΤΕ-Ι、POTE-J、POTE-M的多肽片段。
[0023]所述與POTE蛋白自身抗體特異性結合的重組POTE蛋白包括:
[0024](c)由SEQ ID N0.5所示的氨基酸序列組成的融合蛋白；或
[0025](d)在(C)限 定的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且與(C)具有相同功能的由(C)衍生的蛋白；[0026]更優選地，所述與POTE蛋白自身抗體特異性結合的重組POTE蛋白還可進一步包括:
[0027]由SEQ ID N0.7所示的氨基酸序列組成的融合蛋白，和/或由SEQ ID N0.9所示的氨基酸序列組成的融合蛋白。
[0028]在本發明中，由SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列組成的多肽片段為POTE-E蛋白第1-144位氨基酸序列組成的多肽；由SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列組成的多肽片段為POTE-E蛋白第20-53位氨基酸序列組成的多肽；由SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列組成的多肽片段為POTE-E蛋白第57-90位氨基酸序列組成的多肽；由SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列組成的多肽片段為POTE-E蛋白第94-127位氨基酸序列組成的多肽。本發明通過實驗研究證實，這些多肽片段能夠特異性結合血清中的POTE蛋白的自身抗體，從而能夠有效地將血清中的POTE蛋白的自身抗體富集并純化。由SEQ ID N0.6所示的氨基酸序列組成的多肽片段為POTE-E蛋白第390-524位氨基酸序列組成的多肽，由SEQ ID N0.8所示的氨基酸序列組成的多肽片段為POTE-E蛋白第528-641位氨基酸序列組成的多肽。其中，由SEQ ID N0.6所示的氨基酸序列組成的多肽片段也能夠特異性結合血清中的POTE蛋白的自身抗體；由SEQ ID N0.8所示的氨基酸序列組成的多肽片段盡管不能特異性結合血清中的POTE蛋白的自身抗體，但可以與其他特異性片段組合用于結合血清中的POTE蛋白的自身抗體。本發明的這些多肽片段也稱為POTE多肽片段。
[0029]本發明的重組POTE蛋白和POTE多肽片段均可以通過常規方法獲得。例如，可以依據標準的PCR擴增技術將cDNA、mRNA或者基因組DNA作為模板，并選取合適的寡核苷酸引物擴增得到編碼所述POTE蛋白或POTE多肽片段的核苷酸。這樣得到的核苷酸可以克隆進合適的載體中，用各種已知的方法通過轉化宿主細胞并在被轉化的宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用適當的方法誘導啟動子，然后繼續培養，培養完成后，回收和純化本發明的POTE蛋白或POTE多肽片段。本發明中，作為重組POTE蛋白，可帶有或未帶有標簽。例如，在本發明的一具體實施方案中，是通過PCR方法，將分別編碼POTE蛋白分子l-144aa(或2_144aa)、390_524aa和528_641aa區域的基因序列克隆到pGEX_6P_3載體，構建 pGEX-GST-P0TE_144、pGEX-GST-P0TE_390 和 pGEX-GST_P0TE_528 融合蛋白表達載體。再將上述質粒 pGEX-GST-P0TE_144、pGEX-GST-P0TE_390 和 pGEX_GST_P0TE_528 分別轉化大腸桿菌BL21或Rosette,培養和IPTG誘導，表達目的蛋白。之后用Sepharose4B Glutathione親和層析、Pressicion酶切割和陽離子交換法純化目的蛋白，獲取POTE的GST-144 (SEQID N0.5)、GST-390 (SEQ ID N0.7)和 GST-528 (SEQ ID N0.9)融合蛋白，以及 POTEE 的多肽片段 l-144aa (SEQ ID N0.l)、390_524aa (SEQ ID N0.6)和 528_641aa (SEQ ID N0.8)。
[0030]編碼POTE蛋白分子l_144aa的核苷酸序列請參見SEQ ID N0.10 ;編碼POTE蛋白分子390-524aa的核苷酸序列請參見SEQ ID N0.11 ;編碼POTE蛋白分子528_641aa的核苷酸序列請參見SEQ ID N0.12。
[0031]另一方面，本發明還提供了一種檢測POTE蛋白的自身抗體的試劑，該試劑包括:與POTE蛋白的自身抗體特異性結合的重組POTE蛋白或POTE多肽片段，或用于在PCR中合成編碼所述POTE蛋白或POTE多肽片段的基因DNA鏈和/或其cDNA鏈的PCR引物；
[0032]優選地，所述與POTE蛋白自身抗體特異性結合的POTE多肽片段包括:
[0033](a)由 SEQ ID N0.USEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3 或 SEQ ID N0.4 所示的氨基酸序列組成的多肽片段；或
[0034](b)在(a)限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且與(a)具有相同功能的由(a)衍生的多肽片段；
[0035]更優選地，所述與POTE蛋白自身抗體特異性結合的POTE多肽片段還可進一步包括:
[0036]由SEQ ID N0.6所示的氨基酸序列組成的多肽片段，和/或由SEQ ID N0.8所示的氨基酸序列組成的多肽片段。
[0037]所述與POTE蛋白自身抗體特異性結合的重組POTE蛋白包括:
[0038](c)由SEQ ID N0.5所示的氨基酸序列組成的融合蛋白；或
[0039](d)在(C)限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且與(C)具有相同功能的由(C)衍生的蛋白；
[0040]更優選地,所述與POTE蛋白自身抗體特異性結合的重組POTE蛋白還可進一步包括:
[0041]由SEQ ID N0.7所示的氨基酸序列組成的融合蛋白，和/或由SEQ ID N0.9所示的氨基酸序列組成的融合蛋白。
[0042]另一方面，本發明還提供了一種檢測POTE蛋白的自身抗體的方法，該方法包括:
[0043]利用檢測POTE蛋白的自身抗體的試劑，采用ELISA方法、DOT BLOT方法、WESTERNBLOT方法和/或免疫熒光方法檢測血清樣品中POTE自身抗體的存在。
[0044]在本發明的一具體實施方案中，利用ELISA技術方法，分別檢測了正常人組、不同類型腫瘤包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、食管癌、鼻咽癌、胃癌、結直腸癌、闌尾粘液腺癌、喉癌、肺神經內分泌癌、肝癌、胰腺癌或非霍基金式淋巴瘤等患者血清POTE自身抗體的滴度，發現POTE蛋白的自身抗體具有很高的靈敏性和特異性，與病情嚴重程度、腫瘤大小或分期有關；可用于監測對腫瘤治療的效果；對監測腫瘤的復發和預測腫瘤的預后也有重要意義。
[0045]另一方面，本發明還提供了一種富集純化POTE蛋白的自身抗體的方法，該方法包括:
[0046]制備固相化親和層析柱:采用Thermo的固化二氨基二丙基氨瓊脂糖與POTE多肽片段分別混勻，并加入EDC偶聯劑偶聯；
[0047]利用以上層析柱對腫瘤患者血清進行親和層析，獲取POTE蛋白的自身抗體。
[0048]根據本發明的具體實施方案，本發明的方法中，用于制備固相化親和層析柱的所述 POTE 多肽片段包括由 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3 或 SEQ ID N0.4 所示的氨基酸序列組成的多肽片段中的一種或多種；優選地，所述POTE多肽片段還可進一步包括SEQ ID N0.6和/或SEQ ID N0.8所示的氨基酸序列組成的多肽片段。
[0049]在本發明的一具體實施方案中，以由SEQ ID N0.1所示氨基酸序列組成的多肽片段、由SEQ ID N0.6所示氨基酸序列組成的多肽片段、由SEQ ID N0.8所示氨基酸序列組成的多肽片段三種原核表達的切除標簽的片段制備固相化親和層析柱，按照上述方法富集純化POTE自身抗體，通過電泳和免疫印跡證明了按照上述方法富集純化得到的POTE抗體的存在。
[0050]另一方面，本發明還提供了按照本發明的方法富集純化得到的POTE自身抗體。[0051]本發明還提供了所述的POTE蛋白的自身抗體在制備用于診斷和/或治療癌癥的診斷制劑或藥物組合物中的應用。其中，所述癌癥可以為乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、食管癌、鼻咽癌、胃癌、結直腸癌、闌尾粘液腺癌、喉癌、肺神經內分泌癌、肝癌、胰腺癌或非霍基金式淋巴瘤。具體而言，本發明的POTE自身抗體至少可以應用于以下方面:1、本發明的POTE抗體(包括其各種修飾抗體)可以用于各種目的如通過免疫熒光、免疫印跡、免疫組化等方法用于檢測人源細胞，特別是人腫瘤細胞和組織POTE家族抗原，從而用于腫瘤診斷，為腫瘤治療提供依據。由于POTE家族N端蛋白質序列的高度同源性，通過本發明前述方法所純化得到的POTE抗體，不但可以檢測細胞Ρ0ΤΕ-Ε，而且也可以同時用于檢測其他POTE家族成員分子，包括Ρ0ΤΕ-Α,-B,-B-like, -C, -F, -G, -H, -1, -J和M等不同亞型。2、結合POTE自身抗體特異識別POTE家族抗原的特點，以及腫瘤細胞特異表達POTE的特點，通過對POTE自身抗體進行修飾，偶聯上不同分子和化合物如核素、熒光分子、治療性蛋白質或多肽等分子，可以用于腫瘤定位檢測、腫瘤轉移監視和腫瘤治療等目的。比如，在POTE自身抗體上偶聯熒光分子或放射性核素，可以用于腫瘤臨床影像學如CT、PET-CT掃描等，實現對腫瘤的原位檢測、腫瘤轉移監視，從而應用于腫瘤診斷、治療和預后分析等；另外，利用本發明的抗體具有特異性識別腫瘤細胞表面POTE抗原的特點，在POTE自身抗體通過各種方法和手段與抗腫瘤藥物、分子等結合，作為這些抗腫瘤藥物和分子的導向劑，靶向識別腫瘤細胞，實現對腫瘤細胞的殺傷和清除，因而在臨床腫瘤治療中發揮重要作用。
[0052]綜上所述，本發明發現了蛋白質分子POTE的自身抗體，并提供了其鑒定和檢測方法；同時提供該自身抗體在人類腫瘤早期發現、診斷和治療和預后中的應用方法。由于POTE蛋白是類CT抗原分子，在正常組織不表達。但是，當細胞癌變和腫瘤發生時POTE蛋白開始表達。從理論上講，POTE作為抗原可能誘導和激發機體的免疫系統，產生針對POTE抗原分子的自身抗體。因此，這些自身抗體在血清中的出現可以提示腫瘤的發生、發展和預后，并可以作為一個腫瘤標志物運用于腫瘤的篩查、診斷和治療分析，對監測腫瘤的復發和預測腫瘤的預后也有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0053]圖1:Ρ0ΤΕ片段的原核蛋白表達GST-144，GST-390，GST-528。其中，圖片第4、6泳道:GST-144 ?’第 8 泳道:GST-390，`第 10 泳道:GST_528。
[0054]圖2:純化的POTE自身抗體電泳鑒定。
[0055]圖3A和圖3B:純化的POTE自身抗體WB鑒定。其中，圖3A:原核表達總蛋白。圖3B:GST純化蛋白抗原親和層析純化POTE自身抗體的WB檢測:以GST-144，GST-390，GST-528為抗原；用經過GST-144，GST-390, GST-528親和層析柱純化的腫瘤患者血清雜交；結果表明GST-144，GST-390純化抗體可以特異性結合抗原，但GST-528純化抗體不特異性。
[0056]圖4:純化的POTE自身抗體表位鑒定。
[0057]圖5 =Elisa法檢測人血清POTE自身抗體。
[0058]圖6:D0T BLOT法檢測人血清POTE自身抗體。
[0059]圖7:GST-144為抗原WESTERN BLOT方法檢測血清POTE自身抗體。其中:P1，P8為腫瘤患者血清為；N3為正常人血清。Pl，P8血清中檢測到POTE自身抗體。
[0060]圖8:免疫熒光方法檢測POTE自身抗體的熒光顯微鏡觀察結果。[0061]圖9:利用ELISA技術方法檢測種類患者血清POTE自身抗體的滴度。
【具體實施方式】
[0062]下面結合具體實施例進一步闡明本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0063]以下實施例中，所用原始試劑和材料均可商購獲得，主要試劑和材料為:TRIzol(Invitrogen) ;IPTG(Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside), Sepharose4BGlutathione (GE) ; PreScission Protease (GE) ; EDC (l-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl)carbodiimide);固化二氨基二丙基氨瓊脂糖(Thermo Scientific) ; Rosetta E.coli strain;pGEX-6P-3;pcDNA3.1-FLAG-HA-P0TE; 96 孔酶標板(Elisa 板)。
[0064]實施例1、POTE片段抗原的原核表達載體構建、表達和純化
[0065](I) POTE 基因 cDNA 的克隆
[0066]用TRIzol試劑提取HELA細胞mRNA并進行逆轉錄(RT)為cDNA。以此cDNA為模板，PCR擴增獲得POTE的兩個亞型2A和2C的cDNA片段，經測定，其序列如SEQID N0.13(P0TE-2A ORF 序列)和 SEQ ID N0.14 (P0TE-2C ORF 序列)所示。
[0067](2) POTE多肽片段原核表達載體構建
[0068]通過PCR方法，將分別編碼POTE-E蛋白分子l_144aa(或2_144aa)的基因序列(參見SEQ ID N0.10)、編碼POTE-E蛋白分子390-524aa區域的基因序列(參見SEQ ID N0.11)和編碼POTE-E蛋白分子528-641aa區域的基因序列(參見SEQ ID N0.12)克隆到pGEX-6P-3載體，構建 pGEX-GST-P0TE_144、pGEX-GST-P0TE_390 和 pGEX_GST_P0TE_528 融合蛋白表達載體。
[0069](3) GST-P0TE_144、GST_P0TE_390 和 GST_P0TE_528 融合蛋白的表達、純化
[0070]將上述質粒pGEX-GST-P0TE_144、pGEX-GST-P0TE_390 和 pGEX-GST_P0TE_528 分別轉化大腸桿菌Rosetta培養和IPTG誘導,表達目的蛋白。用Sepharose4B Glutathione親和層析、Pressicion酶切割和陽離子交換法純化目的蛋白，獲取POTE-E的GST-144、GST-390和GST-528融合蛋白，以及POTE的多肽片段l_144aa、390_524aa和528_641aa，所有載體序列均經過DNA測序鑒定核證(圖1)。GST-144、GST-390和GST-528融合蛋白的序列分別如 SEQ ID N0.5,SEQ ID N0.7,SEQ ID N0.9 所示；多肽片段 l_144aa 如 SEQ ID N0.1 所示，390-524aa 如 SEQ ID N0.6 所示;528_641aa 如 SEQ ID N0.8 所示。
[0071]實施例2、POTE自身抗體的純化及鑒定
[0072]本實施例中，為了證明POTE自身抗體的存在，首先制備了 POTE多肽片段固相化親和層析柱，并用此柱對腫瘤患者血清進行富集和純化，得到POTE自身抗體。具體操作如下:
[0073]POTE多肽片段固相化親和層析柱制備:(I) POTE多肽制備:將原核表達的 GST-P0TE-144 片段(GST-144)用 Glutathione-Sepharose beads 親和結合后，用precission酶孵育，切除與144多肽連接的GST標簽，然后，酶切混合物用IOkDa孔徑超濾管14000rpmll離心，超濾去除precission酶，得到純化的POTE-144 (P0TE-E-144)多肽片段。以同樣的方法可以獲得P0TE-390 (390-524aa)和P0TE-528 (528_641aa)多肽片段。(2)采用 ThermoScientific 的固化二氨基二丙基氨瓊脂糖(diaminodipropylamineimmobilized to4%agarose)分別與 POTE-144 (l_144aa)，P0TE-390 (390_524aa)，POTE-528(528-641aa)三種多肽片段分別混勻，并加入 EDC (l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)偶聯劑偶聯,獲得POTE多肽片段固相化親和層析柱。此柱可用于后續的血清POTE自身抗體純化。
[0074]POTE的自身抗體純化:利用以上層析柱對腫瘤患者血清進行親和層析，可獲取POTE的自身抗體,具體純化步驟如下:(I)人血清用PBS稀釋10倍后與Protein G-Agrose在4°C孵育2小時，PBS洗滌3次，用IOOmM Glycine (pH3.0)洗脫液洗脫結合的抗體，并用1/10體積的IM TrisCl (pH8.0)中和。此步獲得人血清中的總抗體。(2)將偶聯了 P0TE-144多肽片段的S^harose與上述(I)步中得到的人血清總抗體混合，4°C孵育2小時，然后用PBS洗滌3次。用IOOmM Glycine (pH3.0)洗脫液洗脫結合的抗體，并用1/10體積的IM TrisCl (pH8.0)中和。此步獲得人血清中針對P0TE-144片段表位的特異性抗體。由于P0TE-144的氨基酸序列與POTE家族其他成員相同或高度同源，因此以上方法所獲得的抗體除了針對POTE-E蛋白外，也包含針對其他POTE家族成員分子。
[0075]對所純化所得抗體進行電泳鑒定，證明POTE抗體的存在(圖2)。圖2中左圖為純化的血清總IgG，中間圖為利用P0TE-E-144純化的POTE自身抗體，右圖為P0TE-E-390，P0TE-E-528所純化的POTE自身抗體。
[0076]用上述純化抗體分別與POTE原核表達蛋白(細菌總蛋白:圖3A)或純化的POTE原核表達蛋白(細菌GST純化蛋白:圖3B)進行WESTERN免疫印跡予以證明。
[0077]實施例3、POTE自身抗體表位的鑒定
[0078]通過GST-144親和層析柱從腫瘤患者血清中純化所得POTE自身抗體可能是針對POTE的l_144aa片段多肽內不同序列表位的多克隆抗體。為了鑒定POTE自身抗體的表位，本實施例中分別通過PCR方法，將分別編碼POTE-E蛋白N端144個氨基酸殘基內的可能區域表位即第 20-53aa (SEQ ID N0.2)、第 57_90aa (SEQ ID N0.3)和第 94_127aa (SEQ IDN0.4)區域所對應的基因序列克隆到pGEX-6P-3載體，構建pGEX-GST-P0TE_20_53、_57_90和_94_127aa融合蛋白表達載體。將上述質粒轉化Rosetta大腸桿菌，IPTG誘導表達原核蛋白即POTE-E相應片段蛋白。超聲破碎和裂解大腸桿菌，用通過GST-144親和層析所得POTE自身抗體與這些片段的GST融合蛋白進行免疫印跡，檢測是否可以相互結合，從而進行表位判別。如圖4所示，P0TE20-53aa、57-90aa和94_127aa的GST融合蛋白都可以和通過GST-P0TE-144所純化抗體有反應，表明人體POTE自身抗體含有針對20_53aa、57_90aa和94_127aa等表位的抗體。值得注意的是，以上三個表位序列非常相似。
[0079]實施例4、血清POTE自身抗體的檢測方法
[0080]本實施例中，采用以下三種方法對人體血清中的POTE自身抗體進行檢測:
[0081]ELISA方法:利用抗原抗體特異性結合和反應這一特點，以POTE的144( l_144aa)為抗原包被96孔酶標板，采用Elisa方法檢測血清POTE自身抗體的滴度。具體如下:采用包含GST純化并柱上切割標簽后的原核表達的144片段各3.3ug的混合溶液IOOul/每96孔，4°C coating 過夜，Tecan 洗板機 200ulPBS 洗 4 次，10%BSA4°C 200ul 每孔封閉過夜，PBS洗4次，血清1:1000稀釋后·IOOul每孔4°C過夜，PBS洗4次，山羊抗人二抗1:5000稀釋室溫2h，PBS洗4次后OPD法避光顯色20min，酶標儀592nm讀數。結果參見圖5。圖5表示以P0TE-144片段包被ELISA96孔板，5%BSA封閉，不同稀釋倍數腫瘤病人及非腫瘤病人血清作為一抗，HRP標記山羊抗人二抗孵育，以(PD顯色法進行顯色，最后用酶標儀在592nm發射波長進行檢測。此實驗的旨在檢測腫瘤病人血清中是否存在可能與P0TE-144片段結合的抗體及探索適宜的具有較大區分度的血清稀釋比例。橫坐標為血清稀釋倍數，分別為1:10, 1:50, 1:300, 1:900, 1:2700, 1:8100, 16200 及空白對照；縱坐標為 ELISA檢測數值，Pl ?P8為不同腫瘤病人血清；Na為正常人血清樣本。圖5結果表明，ELISA檢測血清POTE自身抗體的敏感性很高，即使在1:3000稀釋后認可有效檢測到POTE自身抗體。因此血清稀釋度可以在1:10到1:3000,而在1:100至1:1000范圍有最好的區分度。
[0082]DOT BLOT方法:以實施例1中重組POTE的GST-144、GST-390和GST-528融合蛋白，或POTE的多肽片段l-144aa、390-524aa和528_641aa點膜，分別與正常人和腫瘤患者血清雜交，鑒定血清中是否存在POTE自身抗體，另外，以GST作為對照(圖6)。如圖6所示，GST-144和P0TE144多肽(l_144aa)作為抗原，可以檢測到腫瘤患者血清(Pl，P8, P14)中存在POTE抗體，而對照正常人血清(NI，N12, N14)中沒有；以POTE的390_524aa多肽片段作為抗原，也可以特異檢測到腫瘤患者而不是正常人中有POTE自身抗體的存在。但是，P0TE528-641aa片段作為抗原并不特異，無法區別正常人和腫瘤患者。這個結果與圖3的結論一致，即POTE的144 (l-144aa)和390 (390_524aa)片段可以較為特異識別POTE自身抗體。因此，P0TE1-144和390-524片段多肽是理想的抗原，可用于ELISA方法特異性檢測血清POTE自身抗體。
[0083]WESTERN BLOT 方法:以 GST、重組 POTE 的 GST-144，GST-390，GST-528 融合蛋白進行SDS-PAG電泳，轉膜后分別與正常人(N3)和腫瘤患者(Pl，P8)血清雜交，鑒定血清中是否存在POTE自身抗體(圖7)。如圖7所示，GST-P0TEE-144做為抗原，可以特異性檢測到腫瘤血清中POTE自身抗體(Pl，P8)，但正常人血清中(N3)無法檢測到。其他兩種抗原，即GST-390和GST-528效果不好。因此，POTE1-144多肽片段是較理想的檢測POTE及其家族其他成員的表達。
[0084]免疫熒光方法:為了證實所純化的POTE自身抗體，我們構建了與P0TE-2C C端融合的HA-FLAG標簽的表達載體pcDNA31-P0TE-2C-HA-FLAG (質粒序列見SEQ ID N0.15)，轉染HELA細胞，在細胞中外源表達P0TE-2C/HA-FLAG融合蛋白。細胞經4%PFA固定，PBS洗滌后，0.l%Triton-X100穿透，羊血清封閉I小時。分別用純化的人血清P0TEE-144抗體(1:50)和小鼠抗HA單克隆抗體(1:2000,Covance)孵育37°C 2小時，PBST洗滌5次。孵育羊抗人FITC-1gG和羊抗小鼠TRITC-1gG37°C孵育I小時，PBST洗滌5次，封片(含DAPI )。熒光顯微鏡觀察。如圖8所示，表達P0TE-2C/HA-FLAG融合蛋白的細胞(HA染色陽性)可以被P0TEE-144純化的人血清抗體染色，二者存在共定位。以上結果表明通過GST-P0TEE-144所純化的抗體可以特異識別細胞表達的P0TE-2C蛋白，證明人血清中存在抗POTE的自身抗體。
[0085]實施例5、POTE自身抗體的檢測及其在腫瘤診斷和預后中的作用
[0086]本實施例中利用ELISA技術方法，分別檢測了正常人組(100例)、不同類型腫瘤包括乳腺癌(70例)、肺癌(27例)、鼻咽癌(35例)、宮頸癌和卵巢癌(12例)、胃癌(7例)、結直腸癌(9例)、食管癌(12例)、肝癌(4例)、和非何金杰式淋巴癌(5例)等患者血清POTE自身抗體的滴度(見圖9)。經統計學檢驗，發現該自身抗體在乳腺癌(P=〈0.001)、肺癌(P=〈0.001)、鼻咽癌(P=〈0.001)、宮頸癌和卵巢癌(P=0.001)、結直腸癌(P=〈0.001)、食管癌(P=〈0.001)和胃癌(P=〈0.001)等多種腫瘤患者血清中滴度顯著高于正常人血清，提示POTE血清自身抗體的檢測可能與這些腫瘤的發生和臨床病理有關；可用于這些腫瘤的早期檢測。POTE自身抗體也有望于監測對腫瘤治療的效果；對監測腫瘤的復發和預測腫瘤的預后也有重要意義。
【權利要求】
1.POTE蛋白的自身抗體在作為腫瘤血清標志物中的應用。
2.檢測POTE蛋白的自身抗體的試劑在制備用于癌癥的檢測、輔助診斷和/或預后判斷的組合物中的應用； 優選地，所述檢測POTE蛋白的自身抗體的試劑包括:與POTE蛋白的自身抗體特異性結合的重組POTE蛋白或POTEE多肽片段，或用于在PCR中合成編碼所述POTE蛋白或POTE多肽片段的基因DNA鏈和/或其cDNA鏈的PCR引物，或編碼所述POTE蛋白或POTE多肽片段的基因序列或包含該基因序列的表達載體。
3.根據權利要求1或2所述的應用，其中，所述癌癥為乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、食管癌、鼻咽癌、胃癌、結直腸癌、闌尾粘液腺癌、喉癌、肺神經內分泌癌、肝癌、胰腺癌或非霍基金式淋巴瘤。
4.根據權利要求2所述的應用，其中， 所述與POTE蛋白自身抗體特異性結合的POTE多肽片段包括:
(a)由SEQ ID N0.USEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3 或 SEQ ID N0.4 所示的氨基酸序列組成的多肽片段；或 (b)在(a)限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且與(a)具有相同功能的由(a)衍生的多肽片段； 更優選地，所述與POTE蛋白自身抗體特異性結合的POTE多肽片段還可進一步包括:由SEQ ID N0.6所示的氨基酸序列組成的多肽片段，和/或由SEQ ID N0.8所示的氨基酸序列組成的多肽片段；或進一步包括與 SEQ ID N0.USEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.6 或 SEQ ID N0.8 高度同源的來自 POTE-A、POTE-B, POTE-C, POTE-D, POTE-F,POTE-G, POTE-H、POTE-1、POTE-J、POTE-M 的多肽片段； 所述與POTE蛋白自身抗體特異性結合的重組POTE蛋白為: (c)由SEQID N0.5所示的氨基酸序列組成的融合蛋白；或 (d)在(c)限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且與(c)具有相同功能的由(c)衍生的蛋白； 更優選地，所述與POTE蛋白自身抗體特異性結合的重組POTE蛋白還可進一步包括: 由SEQ ID N0.7所示的氨基酸序列組成的融合蛋白，和/或由SEQ ID N0.9所示的氨基酸序列組成的融合蛋白。
5.一種檢測POTE蛋白的自身抗體的試劑，該試劑包括與POTE蛋白的自身抗體特異性結合的重組POTE蛋白或POTE多肽片段，或用于在PCR中合成編碼所述POTE蛋白或POTE多肽片段的基因DNA鏈和/或其cDNA鏈的PCR引物； 優選地，所述與POTE蛋白自身抗體特異性結合的POTE多肽片段為:
(a)由SEQ ID N0.USEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3 或 SEQ ID N0.4 所示的氨基酸序列組成的多肽片段；或 (b)在(a)限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且與(a)具有相同功能的由(a)衍生的多肽片段； 所述與POTE蛋白自身抗體特異性結合的重組POTE蛋白為: (c)由SEQID N0.5所示的氨基酸序列組成的融合蛋白；或 (d)在(c)限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且與(c)具有相同功能的由(C)衍生的蛋白。
6.—種檢測POTE蛋白的自身抗體的方法，該方法包括: 利用檢測POTE蛋白的自身抗體的試劑，采用ELISA方法、DOT BLOT方法、WESTERN BLOT方法和/或免疫熒光方法檢測血清樣品中POTE自身抗體的存在。
7.一種富集純化POTE蛋白的自身抗體的方法，該方法包括: 制備固相化親和層析柱:采用Thermo的固化二氨基二丙基氨瓊脂糖與POTE多肽片段分別混勻，并加入EDC偶聯劑偶聯； 利用以上層析柱對腫瘤患者血清進行親和層析，獲取POTE蛋白的自身抗體。
8.根據權利要求7所述的方法，其中，所述POTE多肽片段包括由SEQID N0.USEQ IDN0.2,SEQ ID N0.3或SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列組成的多肽片段；優選地，所述POTEE多肽片段還包括由SEQ ID N0.6所示的氨基酸序列組成的多肽片段和/或由SEQ ID N0.8所示的氨基酸序列組成的多肽片段。
9.按照權利要求7或8所述的方法富集純化得到的POTE蛋白的自身抗體。
10.POTE蛋白的自身抗體在制備用于診斷和/或治療癌癥的診斷制劑或藥物組合物中的應用，其中，優選地，所述癌癥為乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、食管癌、鼻咽癌、胃癌、結直腸癌、闌尾粘液腺癌、喉癌、肺神經內分泌癌、肝癌、胰腺癌或非霍基金式淋巴瘤。
【文檔編號】C07K1/22GK103675294SQ201310611491
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月26日 優先權日:2013年11月26日
【發明者】邵根澤, 朱柏力, 李莉, 王亞清, 王曉珍, 蔡小青, 林明, 張沙, 周柔麗, 嚴考文, 匡靜宇, 易娟, 盧廣 申請人:北京大學