一種提取高純度藻藍蛋白的方法
【專利摘要】本發明提供一種提取高純度藻藍蛋白的方法，在螺旋藻粉中加入緩沖溶液，攪勻后凍藏、解凍，再進行高壓勻質破壁，得到螺旋藻破壁液，經離心分離后取上清液，分別用2μm、0.45μm及0.2μm的微濾膜進行過濾，得藻藍蛋白粗提取液，過組合型樹脂進行脫色純化，收集洗脫液，即為藻藍蛋白提取液，再經羥基磷灰石色譜柱進行純化得藻藍蛋白精提取液，最后經脫鹽及濃縮后進行高速離心噴霧干燥，即得高純度藻藍蛋白。通過本發明能最大限度地提取藻藍蛋白，且產品不會被二次污染，提取螺旋藻中高純度藻藍蛋白的提取率為80.0%以上，產品純度達到A620/A280>4.0。
【專利說明】一種提取高純度藻藍蛋白的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種提取高純度藻藍蛋白的方法，屬于生物制品【技術領域】。
【背景技術】
[0002]藻藍蛋白是以螺旋藻等藻類為主要原料分離出的一種深藍色粉末。它既是一種蛋白質，又是一種極好的天然食用色素，同時又是良好的保健食品。藻藍蛋白是自然界中少見的色素蛋白之一，不僅顏色鮮艷，而且本身是一種營養豐富的蛋白質，其氨基酸組成齊全，
必需氨基酸含量高。[0003]目前，螺旋藻中藻藍蛋白的提取方法很多，但對藻藍蛋白的損失太多，提取率較低，很難進行大量提取，且容易造成產品二次污染，不宜推廣應用。因此，有必要研發一種提取率高、操作方便的藻藍蛋白提取方法。
【發明內容】
[0004]為解決現有技術中藻藍蛋白提取率低、難以推廣等問題，本發明提供一種提取高純度藻藍蛋白的方法，通過下列技術方案實現。
[0005]本發明提供的是這樣一種技術方案:一種提取高純度藻藍蛋白的方法，其特征在于經過下列各步驟:
(1)將新鮮或干燥的鈍頂螺旋藻的藻體制成螺旋藻粉；
(2)按螺旋藻粉:緩沖溶液=1:0.8~1:1.2的質量比,在步驟(1)的螺旋藻粉中加入緩沖溶液，攪勻，于-10~_20°C下凍藏12~24h，再在20~25°C下解凍完全后，在壓力為40~70MPa下進行高壓勻質破壁2~5次，得到螺旋藻破壁液；
(3)將步驟(2)所得螺旋藻破壁液經離心分離，取上清液，依次用2Mm、0.45Mm及0.2Mm的微濾膜過濾上清液，得藻藍蛋白粗提液；
(4)將步驟(3)的藻藍蛋白粗提液以5~30mL/min的流速，通過組合型樹脂進行脫色純化，收集洗脫液，即為藻藍蛋白提取液，組合型樹脂的用量是螺旋藻粉體積的0.8~2.0倍;
(5)用羥基磷灰石體積的6~8倍量、濃度為0.lmol/L的磷酸鹽緩沖溶液，清洗羥基磷灰石色譜柱，再將步驟(4)所得藻藍蛋白提取液加到羥基磷灰石色譜柱中，靜置吸附20~30min后，用羥基磷灰石體積的5~6倍量、濃度為0.03mol/L、流速為2~5mL/min的磷酸鹽緩沖溶液進行洗脫，棄去洗脫液，再用羥基磷灰石體積的4~5倍量、濃度為0.03~0.045mol/L的磷酸鹽緩沖溶液洗脫羥基磷灰石色譜柱，收集洗脫液，即為藻藍蛋白精提液；
(6)將步驟(5)所得藻藍蛋白精提液用通透量為30~50KDa的膜進行脫鹽及濃縮，得到藻藍蛋白精提液濃縮物，然后將該濃縮物進行高速離心噴霧干燥，收集粉末，即得到高純度藻藍蛋白。
[0006]所述步驟(2)的緩沖溶液是pH為6~7、濃度為0.1M的磷酸鉀。[0007]所述步驟(2)的高壓勻質破壁是在常規的高壓勻質機上完成的。
[0008]所述步驟(3)的離心分離是在轉速為3500~5000r/min的條件下離心分離20~30mino
[0009]所述步驟(4)的組合型樹脂為D900型離子交換樹脂、HPD-300L型樹脂、BEHP-3型大網孔非極性吸附樹脂、BEHP-4型大網孔非極性吸附樹脂、D112陽樹脂中的一種或幾種，且幾種的組合是任意的。
[0010]所述步驟(5)的磷酸鹽緩沖溶液是pH為6.75~6.95、含有0.05~0.15mol/L氯化鈉的磷酸鹽緩沖溶液。
[0011]所述步驟(6)的高速離心噴霧干燥是在加液速度為2~8L/h、進風溫度為180~320°C、出風溫度為80~90°C、干燥溫度為160~220°C的條件下進行的。
[0012]本發明具備的優點和效果:通過本發明能最大限度地提取藻藍蛋白，且產品不會被二次污染，本發明從破壁、分離純化，到干燥等步驟的操作均方便易行，操作性、可行性強，能實現規模化生產，生產過程中不排放污染物，是一種對環境友好的藻藍蛋白提取方法。藻藍蛋白在螺旋藻中的含量一般僅為3~10%，采用本發明從螺旋藻中提取高純度藻藍蛋白時，提取率為80.0%以上，產品純度達到A620/A280M.0。
【具體實施方式】
[0013]下面通過實施例對本發明做進一步說明。
[0014]實施例1
(1)將新鮮的優質鈍頂螺旋藻(Arthrospiraplatensis)的藻體除去雜質后,按常規制成螺旋藻粉；
(2)按螺旋藻粉:緩沖溶液=1:1的質量比,在步驟(1)的螺旋藻粉中加入pH為6.8、濃度為0.1M的磷酸鉀緩沖溶液，攪勻后，于_18°C下凍藏20h，再在20°C下解凍完全，然后送入高壓勻質機中，在55MPa壓力下進行高壓勻質破壁2次，得到螺旋藻破壁液；
(3)將步驟(2)所得螺旋藻破壁液在轉速為5000r/min的條件下進行離心分離25min后，取上清液，然后將上清液依次用2Mffl、0.45Mm及0.2Mm的微濾膜進行過濾，過濾后得到藻監蛋白粗提液；
(4)將步驟(3)所得藻藍蛋白粗提液，以20mL/min的流速通過組合型樹脂進行脫色純化，收集洗脫液，即為藻藍蛋白提取液，其中:該組合型樹脂的用量是螺旋藻粉體積的1.5倍，該組合型樹脂是:D900型離子交換樹脂:BEHP-3型大網孔非極性吸附樹脂:D112陽樹脂=3:2:2的體積比；
(5)用羥基磷灰石體積的6倍量、濃度為0.lmol/L、pH為6.85、含有0.lmol/L氯化鈉的磷酸鹽緩沖溶液，清洗羥基磷灰石色譜柱，再將步驟(4)所得藻藍蛋白提取液加到羥基磷灰石色譜柱中，靜置吸附20min后，用羥基磷灰石體積的5倍量、濃度為0.03mol/L、流速為2mL/min、pH為6.85、含有0.lmol/L氯化鈉的磷酸鹽緩沖溶液進行洗脫，棄去洗脫液，再用羥基磷灰石體積的4倍量、濃度為0.03mol/L、pH為6.85、含有0.lmol/L氯化鈉的的磷酸鹽緩沖溶液洗脫羥基磷灰石色譜柱，收集洗脫液，該洗脫液為深藍色液體，即為藻藍蛋白精提液；
(6)將步驟(5)所得藻藍蛋白精提液用通透量為45KDa的膜進行脫鹽及濃縮，得到藻藍蛋白精提液濃縮物，然后將該濃縮物在加液速度為6L/h、進風溫度為220°C、出風溫度為85°C、干燥溫度為170°C的條件下，進行高速離心噴霧干燥，收集粉末，即得到高純度藻藍蛋白，其提取率為80.0%以上，純度為A620/A280 > 4.0。
[0015]實施例2
(1)將干燥的優質鈍頂螺旋藻(Arthrospiraplatensis)的藻體除去雜質后,按常規制成螺旋藻粉；
(2)按螺旋藻粉:緩沖溶液=1:0.8的質量比,在步驟(1)的螺旋藻粉中加入pH為6.0、濃度為0.1M的磷酸鉀緩沖溶液，攪勻后，置于-10°C下凍藏24h，再在25°C下解凍完全，送入高壓勻質機中，在壓力為40MPa下進行高壓勻質破壁3次，得到螺旋藻破壁液；
(3)將步驟(2)所得螺旋 藻破壁液在轉速為4000r/min的條件下進行離心分離30min后取上清液，然后將上清液分別用2Mm、0.45Mffl及0.2Mffl的微濾膜進行過濾，過濾后得到藻監蛋白粗提取液；
(4)將步驟(3)所得藻藍蛋白粗提液，以30mL/min的流速通過組合型樹脂進行脫色純化，收集洗脫液，即為藻藍蛋白提取液，其中:該組合型樹脂的用量是螺旋藻粉體積的0.8倍，該組合型樹脂是:HPD-300L型樹脂:BEHP-4型大網孔非極性吸附樹脂=1:1的體積比；
(5)用羥基磷灰石體積的8倍量、濃度為0.lmol/L、pH為6.85、含有0.lmol/L氯化鈉的磷酸鹽緩沖溶液，清洗羥基磷灰石色譜柱，再將步驟(4)所得藻藍蛋白提取液加到羥基磷灰石色譜柱中，靜置吸附30min后，用羥基磷灰石體積的6倍量、濃度為0.03mol/L、流速為5mL/min、pH為6.85、含有0.lmol/L氯化鈉的磷酸鹽緩沖溶液進行洗脫，棄去洗脫液，再用羥基磷灰石體積的5倍量、濃度為0.045mol/L、pH為6.85、含有0.lmol/L氯化鈉的的磷酸鹽緩沖溶液洗脫羥基磷灰石色譜柱，收集洗脫液，該洗脫液為深藍色液體，即為藻藍蛋白精提液；；
(6)將步驟(5)所得藻藍蛋白精提取液用通透量為30KDa的膜進行脫鹽及濃縮，得到藻藍蛋白精提取液濃縮物，然后將藻藍蛋白精提取液濃縮物在加液速度為8L/h、進風溫度為320°C、出風溫度為80°C、干燥溫度為220°C的條件下進行高速離心噴霧干燥，收集粉末，SP得到高純度藻藍蛋白，其提取率為80.0%以上，純度為A620/A280 > 4.0。
[0016]實施例3
(1)以新鮮的優質鈍頂螺旋藻(Arthrospiraplatensis)的藻體除去雜質后,按常規制成螺旋藻粉；
(2)按螺旋藻粉:緩沖溶液=1:1.2的質量比,在步驟(1)的螺旋藻粉中加入pH為7、濃度為0.1M的磷酸鉀緩沖溶液，攪勻后，置于_20°C下凍藏12h，再在23°C下解凍完全，送入高壓勻質機中，在壓力為70MPa下進行高壓勻質破壁5次，得到螺旋藻破壁液；
(3)將步驟(2)所得螺旋藻破壁液在轉速為3500r/min的條件下進行離心分離20min后，取上清液，然后將上清液依次用2Mffl、0.45Mm及0.2Mm的微濾膜進行過濾，過濾后得到藻監蛋白粗提液；
(4)將步驟(3)所得藻藍蛋白粗提液，以5mL/min的流速通過D900型離子交換樹脂進行脫色純化，收集洗脫液，即為藻藍蛋白提取液，其中:該組合型樹脂的用量是螺旋藻粉體積的2.0倍；
(5)用羥基磷灰石體積的7倍量、濃度為0.lmol/L、pH為6.85、含有0.lmol/L氯化鈉的磷酸鹽緩沖溶液，清洗羥基磷灰石色譜柱，再將步驟(4)所得藻藍蛋白提取液加到羥基磷灰石色譜柱中，靜置吸附25min后，用羥基磷灰石體積的5倍量、濃度為0.03mol/L、流速為3mL/min、pH為6.85、含有0.lmol/L氯化鈉的磷酸鹽緩沖溶液進行洗脫，棄去洗脫液，再用羥基磷灰石體積的5倍量、濃度為0.035mol/L、pH為6.85、含有0.lmol/L氯化鈉的的磷酸鹽緩沖溶液洗脫羥基磷灰石色譜柱，收集洗脫液，該洗脫液為深藍色液體，即為藻藍蛋白精提液；
(6)將步驟(5)所得藻藍蛋白精提取液用通透量為50KDa的膜進行脫鹽及濃縮，得到藻藍蛋白精提取液濃縮物，然后將該濃縮物在加液速度為2L/h、進風溫度為180°C、出風溫度為90°C、干燥溫度為160°C的條件下進行高速離心噴霧干燥，收集粉末，即得到高純度藻藍蛋白；其提取率為80.0%以 上 ，純度為A620/A280 > 4.0。
【權利要求】
1.一種提取高純度藻藍蛋白的方法，其特征在于經過下列各步驟: (1)將新鮮或干燥的鈍頂螺旋藻的藻體制成螺旋藻粉； (2)按螺旋藻粉:緩沖溶液=1:0.8~1:1.2的質量比,在步驟(1)的螺旋藻粉中加入緩沖溶液，攪勻，于-10~_20°C下凍藏12~24h，再在20~25°C下解凍完全后，在壓力為40~70MPa下進行高壓勻質破壁2~5次，得到螺旋藻破壁液； (3)將步驟(2)所得螺旋藻破壁液經離心分離，取上清液，依次用2Mm、0.45Mm及0.2Mm的微濾膜過濾上清液，得藻藍蛋白粗提液； (4)將步驟(3)的藻藍蛋白粗提液以5~30mL/min的流速，通過組合型樹脂進行脫色純化，收集洗脫液，即為藻藍蛋白提取液，組合型樹脂的用量是螺旋藻粉體積的0.8~2.0倍; (5)用羥基磷灰石體積的6~8倍量、濃度為0.lmol/L的磷酸鹽緩沖溶液，清洗羥基磷灰石色譜柱，再將步驟(4)所得藻藍蛋白提取液加到羥基磷灰石色譜柱中，靜置吸附20~30min后，用羥基磷灰石體積的5~6倍量、濃度為0.03mol/L、流速為2~5mL/min的磷酸鹽緩沖溶液進行洗脫，棄去洗脫液，再用羥基磷灰石體積的4~5倍量、濃度為0.03~0.045mol/L的磷酸鹽緩沖溶液洗脫羥基磷灰石色譜柱，收集洗脫液，即為藻藍蛋白精提液； (6)將步驟(5)所得藻藍蛋白精提液用通透量為30~50KDa的膜進行脫鹽及濃縮，得到藻藍蛋白精提液濃縮物，然后將該濃縮物進行高速離心噴霧干燥，收集粉末，即得到高純度藻藍蛋白。`
2.根據權利要求1所述的提取高純度藻藍蛋白的方法，其特征在于:所述步驟(2)的緩沖溶液是pH為6~7、濃度為0.1M的磷酸鉀。
3.根據權利要求1所述的提取高純度藻藍蛋白的方法，其特征在于:所述步驟(3)的離心分離是在轉速為3500~5000r/min的條件下離心分離20~30min。
4.根據權利要求1所述的提取高純度藻藍蛋白的方法，其特征在于:所述步驟(4)的組合型樹脂為D900型離子交換樹脂、HPD-300L型樹脂、BEHP-3型大網孔非極性吸附樹脂、BEHP-4型大網孔非極性吸附樹脂、D112陽樹脂中的一種或幾種，且幾種的組合是任意的。
5.根據權利要求1所述的提取高純度藻藍蛋白的方法，其特征在于:所述步驟(5)的磷酸鹽緩沖溶液是PH為6.75~6.95、含有0.05~0.15mol/L氯化鈉的磷酸鹽緩沖溶液。
6.根據權利要求1所述的提取高純度藻藍蛋白的方法，其特征在于:所述步驟(6)的高速離心噴霧干燥是在加液速度為2~8L/h、進風溫度為180~320°C、出風溫度為80~90°C、干燥溫度為160~220°C的條件下進行的。
【文檔編號】C07K1/36GK103613661SQ201310592245
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月22日 優先權日:2013年11月22日
【發明者】熊巍, 劉海周, 許瑞珂 申請人:云南藍鉆生物科技有限公司