抗日本血吸蟲Sjp40雞卵黃抗體及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供的抗日本血吸蟲Sjp40雞卵黃抗體可與Sjp40特異性結(jié)合，其抗原特異性結(jié)合活性檢測(cè)中可識(shí)別Sjp40，且OD值隨著抗體稀釋度降低而減小,具有抗原濃度依賴性，所述抗體是由下述方法得到的：（1）收集用純化的SjP40抗原初次免疫的健康SPF級(jí)產(chǎn)蛋雞的雞蛋，采用水稀釋硫酸銨沉淀法從雞蛋中初步提取IgY；（2）再依次經(jīng)透析袋、DEAE-FF陰離子交換柱進(jìn)一步純化IgY；（3）用聚丙烯酰胺凝膠電泳、Western?blotting及ELISA對(duì)IgY進(jìn)行分析鑒定；所述抗體是特異性針對(duì)日本血吸蟲Sjp40的雞卵黃免疫球蛋白（IgY），為日本血吸蟲病的早期診斷和防治提供新的思路。
【專利說明】抗日本血吸蟲Sjp40雞卵黃抗體及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是抗日本血吸蟲Sjp40雞卵黃抗體及其制備方法
與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]血吸蟲病是一種熱帶寄生蟲引起的疾病，它是一種重要的人畜共患病，目前全球8億人受威脅，2億人感染，每年約有280萬人死于該病。我國(guó)為日本血吸蟲病流行區(qū)，是全球血吸蟲病危害最嚴(yán)重的國(guó)家之一。血吸蟲病的主要危害在于蟲卵所分泌的可溶性蟲卵抗原(soluble egg antigen, SEA)導(dǎo)致的肉芽腫病變。若能實(shí)現(xiàn)早期診斷,可及時(shí)及早地診治病人與家畜，對(duì)阻斷嚴(yán)重病變的發(fā)生和發(fā)展具有重要意義。
[0003]研究表明P38蛋白(Sjp40)是SEA中分子量約為38kD，是一種新型的優(yōu)勢(shì)抗原分子。以感染前和感染后2周、4周、6周兔混合血清以及急性、慢性日本血吸蟲病人和正常人血清，對(duì)日本血吸蟲蟲卵可溶性抗原(soluble egg antigen, SEA)進(jìn)行了全面的分析與篩選。結(jié)果38kDa能被IgG、IgM、IgA三種抗體所識(shí)別，它是SjSEA中具有潛力的早期診斷靶抗原。
[0004]抗體由于針對(duì)抗原具有高特異性、高敏感性的特點(diǎn)，使之在感染疾病的診斷方法具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。目前已有應(yīng)用單克隆抗體反向間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)(McAb-RIHA)檢測(cè)日本血吸蟲循環(huán)抗原，有較好的敏感性和特異性，但對(duì)不同寄生蟲病人及感染動(dòng)物存在不同情況的交叉反應(yīng)。
[0005]雞卵黃免疫球蛋白(egg yolk immunoglobulin, IgY)是雞血液中的IgG被選擇性轉(zhuǎn)移到卵黃中形成的多克隆抗體。IgY以其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和免疫特性成為近年來的研究熱點(diǎn)，IgY分子量約為180KDa，由65_70KDa的重鏈和22_30KDa的輕鏈組成。IgY與哺乳動(dòng)物免疫球蛋白相比，IgY用于免疫檢測(cè)診斷有許多優(yōu)點(diǎn):它從雞蛋中獲得，避免動(dòng)物出血，不與類風(fēng)濕因子發(fā)生非特異性反應(yīng)，不會(huì)激活補(bǔ)體系統(tǒng)，具有顯著的耐酸堿性、溫度和胃蛋白酶。
[0006]醫(yī)學(xué)工作者對(duì)檢測(cè)日本血吸蟲病進(jìn)行大量的研究，已取得了一定的進(jìn)展，但以IgY用作日本血吸蟲Sjp40抗原的研究方面尚未有報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供抗日本血吸蟲Sjp40雞卵黃抗體。
[0008]本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題在于提供所述抗日本血吸蟲Sjp40雞卵黃抗體的制備方法。
[0009]本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題在于提供所述抗日本血吸蟲Sjp40雞卵黃抗體的應(yīng)用。
[0010]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0011]抗日本血吸蟲S jp40雞卵黃抗體，可與S jp40特異性結(jié)合，其抗原特異性結(jié)合活性檢測(cè)中可識(shí)別Sjp40，且OD值隨著抗體稀釋度降低而減小，具有抗原濃度依賴性，所述抗體是由下述方法得到的:
[0012](I)收集用純化的SjP40抗原初次免疫的健康SPF級(jí)產(chǎn)蛋雞的雞蛋，采用水稀釋硫酸銨沉淀法從雞蛋中初步提取IgY ；
[0013](2)再依次經(jīng)透析袋、DEAE-FF陰離子交換柱進(jìn)一步純化IgY ；
[0014](3)用聚丙烯酰胺凝膠電泳、Western blotting及ELISA對(duì)IgY進(jìn)行分析鑒定。
[0015]上述抗日本血吸蟲Sjp40雞卵黃抗體的制備方法，具體步驟為: [0016](I)收集用純化的SjP40抗原初次免疫的健康SPF級(jí)產(chǎn)蛋雞的雞蛋，采用水稀釋硫酸銨沉淀法從雞蛋中初步提取IgY ；
[0017](2)再依次經(jīng)透析袋、DEAE-FF陰離子交換柱進(jìn)一步純化IgY ；
[0018](3)用聚丙烯酰胺凝膠電泳、Western blotting及ELISA對(duì)IgY進(jìn)行分析鑒定。
[0019]優(yōu)選的，上述抗日本血吸蟲Sjp40雞卵黃抗體的制備方法，具體步驟為:
[0020](I)收集用純化的SjP40抗原初次免疫10天后的健康SPF級(jí)產(chǎn)蛋雞的雞蛋，取卵黃與蒸餾水按1:8稀釋，鹽酸調(diào)PH至4.2-4.4，攪勻4°C靜置過夜后，4°C，12000r/min離心30min收集上清得水溶性組分。向WSF中滴加等體積40%硫酸銨鹽析，再同上法4°C靜置過夜并離心；
[0021](2)用適量IXPBS重懸沉淀，置常規(guī)處理過的透析袋中，4°C下PBS透析48h，每隔4h換次透析液，最后聚乙二醇20000 (PEG20000)濃縮至2ml，-20°C保存?zhèn)溆?；采用HiTrapDEAE-FF陰離子交換預(yù)裝柱進(jìn)一步純化，上樣平衡緩沖液為0.01mol/L、PH=7.4的磷酸鹽緩沖液，洗脫緩沖液為含終濃度為lmol/L NaCl的PH=7.4的磷酸鹽緩沖液，抗Sjp40IgY用上樣平衡緩沖液稀釋經(jīng)0.22um微孔濾膜脫氣緩慢進(jìn)樣，線性梯度洗脫，線速度lml/min，最后收集的洗脫峰_20°C保存；
[0022](3)用聚丙烯酰胺凝膠電泳、Western blotting及ELISA對(duì)IgY進(jìn)行分析鑒定。
[0023]上述抗日本血吸蟲Sjp40雞卵黃抗體在識(shí)別Sjp40方面的應(yīng)用。
[0024]優(yōu)選的，上述抗日本血吸蟲Sjp40雞卵黃抗體在制備膠體金診斷試紙條或診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0025]本發(fā)明的有益效果是:
[0026]本發(fā)明所述抗日本血吸蟲Sjp40雞卵黃抗體，為日本血吸蟲病在免疫診斷方面提供了一個(gè)特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)勢(shì)抗體，是特異性針對(duì)日本血吸蟲Sjp40的雞卵黃免疫球蛋白(IgY)，為日本血吸蟲病的早期免疫診斷檢測(cè)提供了一個(gè)優(yōu)秀的候選分子，也為日本血吸蟲病的早期診斷和防治提供新的思路；采用水稀釋硫酸銨鹽沉淀法結(jié)合DEAE-FF陰離子交換柱制備得到了純度高的抗日本血吸蟲Sjp40的特異性IgY，該方法簡(jiǎn)單、高效、安全。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0027]圖1為抗Sjp40IgY ELISA效價(jià)的檢測(cè)圖；
[0028]圖2為考馬斯亮藍(lán)R-250染色抗Sjp40IgY的非還原型SDS-PAGE分析圖，
[0029]其中，M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)1:透析袋純化的IgY ；
[0030]圖3為考馬斯亮藍(lán)R-250染色抗Sjp40IgY的還原型SDS-PAGE分析圖，
[0031]其中，M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)1:透析袋純化的IgY ；
[0032]圖4為考馬斯亮藍(lán)R-250染色抗Sjp40IgY的還原型SDS-PAGE分析圖，[0033]其中，M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)1:DEAE-FF柱純化IgY ；
[0034]圖 5 為抗 Sjp40IgY Western blotting 分析圖；
[0035]圖6為抗Sjp40IgY和抗Sjp40McAb抗原特異性結(jié)合活性圖，
[0036]其中，*:p〈0.05與抗S jp40單抗組相比。
【具體實(shí)施方式】
[0037]實(shí)施例1
[0038]1材料與方法
[0039]1.1SPF雞的免疫及收集重組Sjp40免疫22周齡的SPF級(jí)來航蛋雞(北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，0.1mg每次，首次免疫要與等量福氏完全佐劑(美國(guó)SIGMA公司)混合，采用皮下多點(diǎn)肌肉注射。然后第5W、6W、7W進(jìn)行加強(qiáng)免疫，免疫時(shí)用福氏不完全佐劑，收集每次免疫后的雞蛋，4°C保存，以制備卵黃抗體。1.2IgY的提取和純化采用水稀釋硫酸銨鹽沉淀法分離純化蛋黃中IgY。取卵黃與蒸餾水按1:8稀釋，鹽酸調(diào)PH至4.2-4.4，攪勻4°C靜置過夜后，4°C, 12000r/min 離心 30min 收集上清得水溶性組分(Water-Solution Fraction, WSF)。向WSF中滴加等體積40%硫酸銨鹽析，再同上法4°C靜置過夜并離心。用適量IXPBS重懸沉淀，置常規(guī)處理過的透析袋中，4°C下PBS透析48h，每隔4h換次透析液，最后聚乙二醇20000 (PEG20000)濃縮至2ml。_20°C保存?zhèn)溆?。采用HiTrap DEAE-FF陰離子交換預(yù)裝柱(GE HEALTH公司)，儀器為AKTA FPLC蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)一步純化，上樣平衡緩沖液為
0.01mol/L、PH=7.4的磷酸鹽緩沖液，洗脫緩沖液為含終濃度為lmol/L NaCl的PH=7.4的磷酸鹽緩沖液，抗Sjp40IgY用上樣平衡緩沖液稀釋經(jīng)0.22um微孔濾膜脫氣緩慢進(jìn)樣，線性梯度洗脫，線速度lml/min，最后收集的洗脫峰-20°C保存。
[0040]1.3IgY滴度檢測(cè)用間接ELISA法檢測(cè)不同免疫次數(shù)IgY的滴度。包被20_40ug/ml的Sjp40抗原于96孔酶標(biāo)板并4°C過夜，PBST洗滌3次，3%BSA封閉Ih，重復(fù)洗滌。加梯度稀釋的IgY，37°C溫育lh。洗滌后加入二抗驢抗雞HRP-1gY(北京康為世紀(jì)公司)，37°C溫育lh。以包被抗原的碳酸鹽緩沖液為空白對(duì)照，以碳酸鹽緩沖液為陰性對(duì)照。底物為TMB溶液，顯色lOmin，2mol/L硫酸終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上讀取波長(zhǎng)為450nm的OD值。
[0041]1.4DEAE-FF離子交換預(yù)裝柱純化IgY采用HiTrap DEAE-FF離子交換預(yù)裝柱(GEHEALTH公司)，儀器為AKTA FPLC蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)一步純化，上樣平衡緩沖液為0.01mol/L、PH=7.4的磷酸鹽緩沖液，洗脫緩沖液為含終濃度為lmol/L NaCl的PH=7.4的磷酸鹽緩沖液，IgY用上樣平衡緩沖液稀釋經(jīng)0.22um微孔濾膜脫氣緩慢進(jìn)樣，線性梯度洗脫，線速度lml/min,最后收集的洗脫峰_20°C保存。
[0042]1.5IgY的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)非還原型SDS-PAGE檢測(cè)IgY的純度和相對(duì)分子質(zhì)量，其濃縮膠濃度5%，分離膠濃度10%，4°C下電泳，結(jié)束后凝膠用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。還原型SDS-PAGE鑒定IgY，其濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%，常溫下電泳,結(jié)束后同上法染色。
[0043]1.6 蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)鑒定 Western blotting是將 IgY經(jīng) 12%還原型SDS-PAGE電泳后，采用半干濕轉(zhuǎn)印法將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，3%BSA4°C封閉過夜，PBST洗滌3次，加入二抗驢抗雞HRP-1gY室溫孵育lh，重復(fù)洗滌，cECL Western Blot Kit顯色。[0044]1.7抗原特異性結(jié)合活性用間接ELISA法檢測(cè)IgY的抗原結(jié)合活性。將Sjp4032ug/ml包被并4°C過夜，PBST洗滌3次，3%BSA封閉Ih，重復(fù)洗滌，加入梯度稀釋的抗Sjp40IgY和抗Sjp40鼠單克隆抗體(McAb，制備方法見CN1618965A)，起始濃度為0.06ug/ul，37°C溫育lh，洗滌后加入相應(yīng)二抗分別為驢抗雞HRP-1gY，羊抗鼠HRP-1gG，37°C溫育Ih0以包被抗原的碳酸鹽緩沖液為空白對(duì)照，以碳酸鹽緩沖液為陰性對(duì)照。以TMB溶液為底物，顯色lOmin，2mol/L硫酸終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上讀取波長(zhǎng)為450nm的OD值。
[0045]1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
[0046]2 結(jié)果
[0047]2.1IgY滴度檢測(cè)如圖1所示，間接ELISA法檢測(cè)不同免疫次數(shù)IgY的滴度結(jié)果顯示，初次免疫即有抗體產(chǎn)生，隨著免疫次數(shù)的增加效價(jià)逐漸上升，到第四次免疫的IgY效價(jià)最聞。
[0048]2.2SDS-PAGE和Western blotting鑒定結(jié)果如圖2所示，透析袋純化的IgY經(jīng)10%非還原型SDS-PAGE和12%還原型SDS-PAGE鑒定結(jié)果顯示，IgY全分子量為180KD，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。如圖3所示，IgY裂解后除有兩條主帶，其相對(duì)分子質(zhì)量約為65KDa和28KDa，分別為IgY的重鏈和輕鏈外，還有其他較多相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白條帶。如圖4所示，用DEAE-FF柱進(jìn)一步純化的IgY經(jīng)12%還原型SDS-PAGE鑒定結(jié)果顯示，IgY純度較高，無其他雜帶，只有兩條主帶。如圖5所示，Western blotting結(jié)果顯示,制備的IgY可與Sjp40特異性結(jié)
八
口 ο
[0049]2.3抗原特異性結(jié)合活性檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，制備的純化抗Sjp40IgY和抗Sjp40鼠McAb —樣可以識(shí)別Sjp40，且OD值均隨著抗體稀釋度降低而減小，具有很好的抗原濃度依賴性，但抗Sjp40IgY識(shí)別Sjp40抗原的敏感性高于抗Sjp40鼠McAb。不同梯度下純化的Sjp40IgY和抗Sjp40鼠McAb相比均有差異，除梯度為1:105無顯著性差異，其余各組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0050]本發(fā)明的有益效果分析:
[0051]IgY的分子結(jié)構(gòu)哺乳動(dòng)物的IgG類似，由于種系發(fā)生距離較遠(yuǎn)，IgY不會(huì)與哺乳動(dòng)物免疫球蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)，所以在日本血吸蟲病的檢測(cè)IgY比IgG更具優(yōu)勢(shì)性。本發(fā)明制備的抗日本血吸蟲Sjp40雞卵黃抗體，提純后經(jīng)SDS-PAGE分析后發(fā)現(xiàn)有2條分子量為65KDa和28KDa蛋白條帶，分別為IgY的重鏈和輕鏈，表明采用水稀釋硫酸銨鹽沉淀法結(jié)合DEAE-FF陰離子交換柱制備得到了純度高的抗日本血吸蟲Sjp40的特異性IgY，與水稀釋，氯仿萃取以及凝膠過濾色譜法相比，該方法簡(jiǎn)單，高效，安全。與單克隆抗體相比它具有產(chǎn)量大，提取方便，性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。
[0052]透析袋純化的IgY經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)除了兩條重鏈和輕鏈外，還有其他雜帶，純度較高,Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Sjp40抗原可被透析純化的IgY識(shí)別。表明本發(fā)明制備的IgY可與Sjp40發(fā)生抗原反應(yīng)`。Sjp40抗原濃度稀釋至30ug/ul時(shí)應(yīng)用間接ELISA檢測(cè)IgY具有高度敏感性，且高于抗Sjp40單抗。
[0053]綜上，抗Sjp40IgY的制備為日本血吸蟲病的早期免疫診斷檢測(cè)提供了一個(gè)優(yōu)秀的候選分子，也為日本血吸蟲病的早期診斷和防治提供新的思路，可在制備膠體金診斷試紙條或診斷試劑盒中進(jìn)行應(yīng)用。
[0054]上述參照【具體實(shí)施方式】對(duì)該抗日本血吸蟲Sjp40雞卵黃抗體及其制備方法與應(yīng)用進(jìn)行的詳細(xì)描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個(gè)實(shí)施例，因此在不脫離本發(fā)明總體構(gòu)`思下的變化和修改，應(yīng)屬本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.抗日本血吸蟲Sjp40雞卵黃抗體，其特征在于:可與Sjp40特異性結(jié)合，其抗原特異性結(jié)合活性檢測(cè)中可識(shí)別Sjp40，且OD值隨著抗體稀釋度降低而減小，具有抗原濃度依賴性，所述抗體是由下述方法得到的: (1)收集用純化的SjP40抗原初次免疫的健康SPF級(jí)產(chǎn)蛋雞的雞蛋，采用水稀釋硫酸銨沉淀法從雞蛋中初步提取IgY ； (2)再依次經(jīng)透析袋、DEAE-FF陰離子交換柱進(jìn)一步純化IgY； (3)用聚丙烯酰胺凝膠電泳、Westernblotting及ELISA對(duì)IgY進(jìn)行分析鑒定。
2.權(quán)利要求1所述的抗日本血吸蟲Sjp40雞卵黃抗體的制備方法，其特征在于:具體步驟為: (1)收集用純化的SjP40抗原初次免疫的健康SPF級(jí)產(chǎn)蛋雞的雞蛋，采用水稀釋硫酸銨沉淀法從雞蛋中初步提取IgY ； (2)再依次經(jīng)透析袋、DEAE-FF陰離子交換柱進(jìn)一步純化IgY； (3)用聚丙烯酰胺凝膠電泳、Westernblotting及ELISA對(duì)IgY進(jìn)行分析鑒定。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗日本血吸蟲Sjp40雞卵黃抗體的制備方法，其特征在于:具體步驟為: (1)收集用純化的SjP40抗原初次免疫的健康SPF級(jí)產(chǎn)蛋雞的雞蛋，取卵黃與蒸餾水按I: 8稀釋，鹽酸調(diào)PH至4.2-4.4，攪勻4°C靜置過夜后，4°C，12000r/min離心30min收集上清得水溶性組分。向WSF中滴`加等體積40%硫酸銨鹽析，再同上法4°C靜置過夜并離心； (2)用適量IXPBS重懸沉淀，置常規(guī)處理過的透析袋中，4°C下PBS透析48h，每隔4h換次透析液，最后聚乙二醇20000濃縮至2ml，_20°C保存?zhèn)溆?；采用HiTrap DEAE-FF陰離子交換預(yù)裝柱進(jìn)一步純化，上樣平衡緩沖液為0.01mol/L、PH=7.4的磷酸鹽緩沖液，洗脫緩沖液為含終濃度為lmol/L NaCl的PH=7.4的磷酸鹽緩沖液，抗Sjp40IgY用上樣平衡緩沖液稀釋經(jīng)0.22um微孔濾膜脫氣緩慢進(jìn)樣，線性梯度洗脫，線速度lml/min，最后收集的洗脫峰-20°C保存； (3)用聚丙烯酰胺凝膠電泳、Westernblotting及ELISA對(duì)IgY進(jìn)行分析鑒定。
4.權(quán)利要求1所述的抗日本血吸蟲Sjp40雞卵黃抗體在識(shí)別Sjp40方面的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗日本血吸蟲Sjp40雞卵黃抗體在制備膠體金診斷試紙條或診斷試劑盒中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K16/02GK103554257SQ201310589411
【公開日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月20日
【發(fā)明者】趙小玲, 陳偉強(qiáng), 閆俊, 王儷蒙, 王尚, 王濤, 王軍, 孫思明 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所