雞白介素-18單克隆抗體及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了雞白介素-18單克隆抗體及其制備方法和應用。本發明以原核表達的重組蛋白ChIL-18為免疫原，真核細胞系表達的ChIL-18蛋白為篩選原，細胞融合后以IFA篩選雜交瘤細胞，篩選獲得8株分泌雞白介素-18單克隆抗體的細胞株；其中，雜交瘤細胞株4E11穩定性最好，所分泌的單抗效價最高、特異性最強，其微生物保藏號為CGMCC?NO.7658。本發明進一步提供了雜交瘤細胞株4E11以及所分泌的單克隆抗體在檢測或純化雞白介素-18蛋白中的應用。
【專利說明】雞白介素-18單克隆抗體及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及雞白介素單克隆抗體，尤其涉及雞白介素-18單克隆抗體以及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株，本發明進一步涉及該單克隆抗體在檢測或純化雞白介素-18蛋白中的應用，屬于雞白介素-18單克隆抗體的制備及應用領域。
【背景技術】
[0002]白細胞介素簡稱白介素，是由白細胞產生的、介導細胞間相互作用的細胞因子，在細胞的活化、增殖和分化中起調節作用。隨著分子生物學的發展，有關雞白介素基因和功能的研究已逐漸成為熱點，迄今為止，已從雞中分離出多種白介素，例如:IL-l、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IL-16、IL-18等，這些白介素能夠應用于免疫治療劑、免疫增強劑、構建新型基因工程疫苗等方面，利用白介素等細胞因子增強或調節機體的非特異性免疫，不僅會有效防控畜禽疾病，還能在畜牧業生產中產生巨大的經濟效益。
[0003]目前，用于分泌雞白介素-18單克隆抗體的雜交瘤細胞株存在效價低、穩定性差等缺陷，所分泌的單克隆抗體特異性較差，嚴重制約了生產應用，亟待改進。
【發明內容】
[0004]本發明的目的之一是提供一株穩定、高效分泌雞白介素-18單克隆抗體的雜交瘤細胞株；
[0005]本發明的目的之二是提供由該雜交瘤細胞株分泌的雞白介素-18單克隆抗體；
[0006]本發明的目的之三是將所述的雞白介素-18單克隆抗體應用于檢測或純化雞白介素-18蛋白。
[0007]本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的:
[0008]一株穩定、高效分泌雞白介素-18單克隆抗體的雜交瘤細胞株CHIL-184E11，其保藏編號為=CGMCC N0.7658 ;分類命名為:雞IL-18單克隆抗體雜交瘤細胞株；保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏時間是2013年5月29日:保藏地址:中國北京朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。
[0009]本發明以原核表達的重組蛋白ChIL-18為免疫原，真核細胞系表達的ChIL_18F蛋白為篩選原，細胞融合后以IFA篩選雜交瘤細胞上清，將初步判定為陽性的雜交瘤細胞經2-3次克隆化，獲得8株分泌ChIL-18單抗的細胞株:2G7、2G8、3E5、4E11、5D3、1E8、2C4和2D11。本發明用IFA檢測8株分泌ChIL-18單抗的細胞株培養上清，測定這8株陽性雜交瘤細胞株的效價；4E11效價為1:3200，2G7、2G8、3E5、5D3、1E8、2C4和2D11的效價分別為1:1800、1:1600、1:1900、1:1700、1:2000、1:1400 和 1:1300。從檢測結果來看，4E11 單抗腹水效價要遠遠高出其它7株雜交瘤細胞株單抗效價。
[0010]本發明將陽性雜交瘤細胞株2G7、2G8、3E5、4E11、5D3、1E8、2C4和2D11所分泌的單克隆抗體分別與原核重組蛋白ChIL-18進行Western blot,試驗結果發現，陽性雜交瘤細胞株4E11的單抗只與重組蛋白ChIL-18起反應，而不與空載體菌體反應，說明陽性雜交瘤細胞株4E11分泌的單抗特異性最好；陽性雜交瘤細胞株2G7、2G8、3E5、?3、1E8、2C4和2D11所分泌的單克隆抗體與空載體菌體存在反應，特異性較差。
[0011]本發明雞白介素-18單克隆抗體具有良好的特異性，可制備成檢測或診斷雞體內的IL-18蛋白的診斷試劑，例如，可以將本發明雞白介素-18單克隆抗體制備成診斷或檢測IL-18蛋白的ELISA檢測試劑盒。
[0012]此外，本發明雞白介素-18單克隆抗體還可應用于純化雞白介素-18蛋白；例如，將本發明單克隆抗體吸附在惰性的固相基質上制備成層析柱；當樣品流經層析柱時，待分離的抗原與固相的單克隆抗體發生特異性結合，其余成分不能與之結合。將層析柱充分洗脫后，改變洗脫液的離子強度或PH，欲分離的抗原與抗體解離，收集洗脫液便可得到純化的雞白介素-18蛋白。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1單克隆抗體亞類的鑒定結果；1_8:分別為2G7、2G8、3E5、4E11、5D3、1E8、2C4和2D11的細胞培養液的上清。 [0014]圖24E11腹水的IFA反應結果(100X) ；A:腹水稀釋50倍時的IFA結果；B:腹水稀釋3000倍時的IFA結果；C:陰性對照。
[0015]圖3單抗與原核重組蛋白ChIL-18的western blot的結果；1:原核重組蛋白ChIL-18 ；2:未誘導菌;M:蛋白質分子質量標準。
[0016]圖4雞脾臟中的IL-18蛋白檢測結果；1_5:不同個體雞脾臟；M:蛋白質分子量標準。
【具體實施方式】
[0017]下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
[0018]1.生物材料和試劑
[0019]1.1.1實驗動物和細胞
[0020]BALB/c雌性小鼠由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所實驗動物中心提供；小鼠骨髓瘤細胞系SP2/0由本發明人實驗室保存；感染MDV雞的脾臟由本發明人實驗室保存。
[0021]1.1.2主要試劑
[0022]50XHAT、100XHT 添加劑均購自 GIBCO ;胎牛血清:B10CHR0M, Berlin ；DyLight594標記羊抗鼠IgG購自Jackson ImmunoResearch公司；IRDye?680標記山羊抗鼠IgG購自
L1-COR生命科學公司；IgG抗體亞類試劑盒購自Southern Biotech公司；T-PERk組織裂
解液購自Thermo科技公司；鼠抗β -Actin的單抗購自中杉金橋公司。
[0023]實施例1雞白介素-18單克隆抗體的制備及鑒定
[0024]1.實驗方法
[0025]1.1小鼠的免疫
[0026](I)制備含ChIL-18重組蛋白的SDS-PAGE膠條；[0027](2)免疫前加入少量PBS用研磨棒研磨，加入適量雙抗溶液，以膠粒能夠通過ImL注射器針頭為且，即免疫原；
[0028](3)選取5只6-8周齡清潔級BALB/c小鼠，用制備的免疫原通過腹腔注射對其免疫，每只每次300 μ L,每隔2w免疫一次；
[0029](4)第三次免疫后一周眶下竇采血，然后按照常規方法分離血清；
[0030](5)將免疫鼠的抗血清與CH0-ChIL_18F細胞做IFA驗證試驗，檢測二者能否反應，并測定血清的效價；
[0031](6)選取血清效價最高的小鼠進行加強免疫，72h后做融合。
[0032]1.2細胞融合
[0033]1.21準備飼養層細胞
[0034]進行細胞融合的前一天，按照以下方法準備飼養層細胞:
[0035](I)取8-10周齡BALB/c雌性小鼠，摘除眼球取血，分離血清作為陰性對照，然后頸椎脫臼致死，用75%的酒精浸泡消毒5min ；
[0036](2)移入超凈臺，四肢用ImL注射器針頭固定在已滅菌的泡沫固定板上，腹面向上，無菌操作將小鼠腹部皮膚剪開一小口，鈍性分離皮膚與腹膜，用5mL注射器吸取5mL含HAT的DMEM培養基注入腹腔，用酒精棉球輕輕揉動小鼠腹部，再用注射器緩慢吸出腹腔內的液體，反復操作2次；
[0037](3)加入約90mL HA T培養液輕輕懸浮細胞，按照100 μ L/孔分裝到96孔細胞培養板，置5%C02 , 37 °C培養箱中培養。
[0038]1.2.2骨髓瘤細胞5?2/0的制備
[0039](l)SP2/0于融合前2w復蘇，準備好超凈工作臺，在一小細胞瓶內加入含10%FBS、1%谷氨酰胺的DMEM培養基；
[0040](2)從液氮罐中取出含SP2/0細胞凍存管，迅速放入37°C水浴中，最好在Imin內融化；以75%酒精消毒管口，移入超凈工作臺內，吸出細胞懸液加入到準備好的培養瓶中，置于37°C、5%C02培養箱中培養；
[0041](3) 12h后，更換新的DMEM完全培養基。
[0042]1.2.3脾細胞的制備(研磨法)
[0043](I)選擇血清抗體效價較高的免疫小鼠，眼球采血，收集血清供檢測時陽性對照用；頸椎脫白致死，放入75%酒精浸泡5min進行體表消毒；
[0044](2)將小鼠移入超凈臺，四肢用ImL注射器針頭固定在已滅菌的泡沫固定板上，腹面向上。
[0045](3)無菌操將作將小鼠腹部皮膚剪開一小口，鈍性分離皮膚與腹膜，然后剪開腹膜，暴露脾臟，將脾臟移入一放有IOmL DMEM平皿內，剔除周圍的結締組織，取出脾臟，然后將其放入另一提前倒入IOmL DMEM的平皿中清洗；
[0046](4)然后將其轉移至滅菌的銅網上，銅網放在另外一個盛有空DMEM的平皿上；用注射器的活塞部輕輕地在銅網上研磨，將銅網浸在培養液中使脾細胞被漂洗下來；
[0047](5)將脾細胞懸液轉移到15mL離心管中，1500r/min離心8min。
[0048]1.2.4細胞融合
[0049](I)將生長狀態良好的SP2/0及脾細胞，按照1:5-1:10的比例在50mL尖底離心管中混合，補加空DMEM于一定的體積，輕輕混勻；
[0050](2)于水平離心機1500r/min離心8min，倒干凈上清液，用手指輕彈離心管底部，使兩種細胞松散混勻，放于裝有37°C水的燒杯中保溫；
[0051](3)用移液器沿管內壁在Imin內逐滴加入ImL 50%的PEG335tl，加的同時勻速轉動離心管；
[0052](4)用30mL DMEM培養液終止PEG335tl的作用，90s內加完，靜置IOmin ；
[0053](5) 1500r/min 離心 8min。吸棄上清，加入 50mL 37 °C 保溫的含 HAT、10%FBS 的DMEM,混勻；
[0054](6)在提前鋪好飼養細胞的細胞板上每孔加入100 μ L融合細胞懸液，置于37°C，5%的CO2培養箱中培養；
[0055](7)融合5天后，更換HAT培養液，采用半換液的方式進行換液；
[0056](8)培養至9天左右，觀察培養液顏色，若培養液變為黃色時可進行檢測。
[0057]1.3以IFA篩選陽性雜交瘤細胞的篩選
[0058](I)將CH0-ChIL_18F細胞系按常規方法傳代鋪于96孔細胞培養板上，置于37°C，5%C02培養箱中培養；
[0059](2)當細胞單層長至80%-90%，倒掉培養液，用PBS洗滌3次，每次5min，用室溫的丙酮:甲醇(1:1) (v/v)室溫固定15min，甩掉固定液，敞開培養板自然干燥后待用；
[0060](3)觀察融合細胞的生長情況，當其培養液變黃后，吸取100 μ L上清液加在固定的CHO細胞板上，以免疫鼠血清為陽性對照(1:50稀釋，稀釋液為PBS)，以制備飼養層細胞的小鼠血清為陰性對照，以PBS為空白對照，37°C水浴Ih ；PBS洗滌3次，每次5min ;加入50 μ L DyLight594 標記羊抗鼠 IgG 為二抗(1:300 稀釋，PBS 稀釋)，37°C水浴 40min,PBS 洗滌3次，每次5min ;在熒光倒置顯微鏡下觀察紅色熒光。
[0061](4)選擇紅色熒光最強的孔的細胞進行克隆。
[0062]1.4陽性雜交瘤細胞的單克隆化
[0063]采用有限稀釋法單克隆化，根據實際情況確定克隆的次數。按如下步驟進行:
[0064](I)克隆化的前一天按照4.1.5.1制備飼養層細胞；
[0065](2)用移液器將待克隆的孔內細胞吹打混勻，用含20%血清的HT選擇培養液將孔內細胞稀釋至每個孔內I個細胞；
[0066](4)將細胞稀釋液按照100 μ L/孔加到已有飼養細胞的細胞板，置5%C02、37°C的培養箱中進行培養；
[0067](5)培養至第4天時，在倒置顯微鏡下觀察并記錄細胞單克隆生長孔；培養至第Iw左右，當細胞培養液變黃時，做好標記，吸取100 μ L上清，用先前建立好的IFA方法檢測細胞孔。
[0068](6)隔3天左右待培養液變黃，再次對初檢陽性孔做IFA檢測；
[0069](7)將兩次檢測均為強陽性的孔內細胞進行2-3次亞克隆，直至每孔都能檢測到強紅色突光；
[0070](8)擴大培養并凍存克隆化的強陽性雜交瘤細胞。
[0071]1.5強陽性雜交瘤細胞的穩定性檢測
[0072](I)用彎頭吸管將生長狀態良好的處于對數生長期的陽性雜交瘤細胞輕輕從瓶壁上吹下；
[0073](2) 1000r/min 離心 5min,棄上清；
[0074](3)將細胞沉淀懸浮用凍存液(DMEM培養液:FBS =DMSO為5:4:1)，將細胞分裝至無菌凍存管中，4°C冰箱30min，-20°C冰箱lh，_70°C冰箱過夜，放入液氮罐中長期保存；做好相應記錄。
[0075](4)按照CHO細胞的復蘇方法復蘇。培養后，用IFA檢測細胞培養上清，測定效價。
[0076]1.5單抗腹水的制備
[0077](I)選取10-13周齡BALB/c小鼠4只，腹腔注射液體石蠟0.5mL/只；
[0078](2) 7天后，腹腔接種經PBS稀釋的培養至對數期的4E11陽性雜交瘤細胞，每只小鼠 5Χ105/0.2mL ；
[0079](3)5天后注意觀察小鼠的腹腔，當小鼠腹部明顯膨脹時，用5mL的注射器抽取腹水，每隔3天收集一次，直到小鼠死亡。
[0080](4)將腹水以2000r/min，離心5min ;留上清分裝后_70°C冰箱保存。1.6單抗生物學特性鑒定
[0081]1.6.1單克隆抗 體亞類的鑒定
[0082]利用Southern Biotech公司的抗體亞類鑒定試劑盒按照說明書對篩選出的8株單克隆抗體進行亞類鑒定:
[0083](I)將ChIL-18重組蛋白經SDS-PAGE電泳，膠回收后，切下目的條帶，將其放到EP管中盡可能的碾碎，然后加入適量的PBS，4°C過夜；
[0084](2)次日，離心，5000r/min離心5min ;取上清,測蛋白濃度；
[0085](3)按照4ug/mL包被酶標板，每孔100 μ L，37°C過夜；
[0086](4)次日，甩掉未結合的蛋白，PBST洗滌3次，每次5min ;每孔加入100 μ L的
0.5%BSA 封閉，37°C放置 Ih ；
[0087](5)在封閉好的酶標板中分別加入2G7、2G8、3E5、4E11、5D3、1E8、2C4和 2D11細胞培養液上清，100 μ L/孔，37°C孵育Ih ；PBST洗滌3次，每次5min ；
[0088](6)向酶標板中依次加入用PBSl:250稀釋的HRP標記的羊抗鼠檢測二抗(分別為抗鼠 K、λ、IgM、IgA、IgG1' IgG2a、IgG2b 和 IgG3,100 μ L/ 孔，37°C放置 lh, PBST 洗滌 3 次，每次5min ；
[0089](7)加入 ABTS 底物顯色，100 μ L/孔，孵育 10_15min ;
[0090](8)用酶標儀在405nm波長處讀取吸光值(0D值)。
[0091]1.6.2單抗與原核重組蛋白ChIL-18的western blot的反應性
[0092]分別將原核重組蛋白ChIL-18和未誘導的原核重組菌經SDS-PAGE電泳后，轉印至PVDF膜，以分別以篩選出的8株單抗的細胞培養上清為一抗，以IRDyeTM700DX標記山羊抗鼠IgG (1:5000稀釋)為二抗。
[0093]1.6.3單抗腹水IFA效價的測定
[0094]將腹水用PBS 按照以下比例稀釋，1:50、1:100、1:200、1:400、1:600、1:800、1:1000、1:1200、1:1500、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000 測定 IFA 效價。1.6.4 利用單抗
檢測MDV感染雞脾臟中的IL-18蛋白
[0095](I)利用T-PER組織裂解液裂解5個不同個體的雞脾臟提取蛋白，液氮研磨脾臟，稱取0.1g研磨的脾臟粉末，加入0.5mL T-PER裂解液；
[0096](2)冰上裂解2h，1000Og,離心5min，取上清；
[0097](3)加入5 X SDS裂解液煮沸IOmin ;將蛋白進行SDS-PAGE電泳，上樣體積28 μ L ；
[0098](4)電泳結束后，按照常規方法進行轉膜，其中一抗為4Ε11陽性雜交瘤細胞株的細胞培養上清液及鼠抗β-Actin單抗(1:1000稀釋)，二抗為IRDyeTM700DX標記山羊抗鼠IgG (1:4000稀釋)。具體操作步驟參照3.1.9.30
[0099]2.實驗結果
[0100]2.1 ChIL-18 單抗的篩選
[0101]以原核表達的重組蛋白ChIL-18為免疫原，真核細胞系表達的ChIL_18F蛋白為篩選原，細胞融合后以IFA進行篩選雜交瘤細胞上清，初步判定為陽性的雜交瘤細胞克隆經2-3次克隆化，獲得8株分泌ChIL-18單抗的細胞株。其中2G7、2G8、3E5、4E11和5D3經過了 2次亞克隆，1E8、2C4和2D11經過了 3次亞克隆。
[0102]2.2單抗的亞類鑒定結果
[0103]利用Southern Biotech公司的免疫球蛋白標準亞類鑒定試劑盒進行對獲得的2G7、2G8、3E5、4E11、5D3、1E8、2C4和2D11這8株單抗進行亞類鑒定，其重鏈分別為IgM，輕鏈均為Kappa鏈(圖1)。
[0104]2.3強陽性雜交瘤細胞的穩定性檢測
`[0105]穩定性檢測結果發現，強陽性雜交瘤細胞4E11分泌ChIL-18單抗的穩定性最好；2G7、2G8、3E5、5D3、1E8、2C4 和 2D 11 的穩定性較差。
[0106]2.4單抗腹水IFA效價的測定結果
[0107]用PBS將腹水稀釋作為一抗進行IFA反應，4E11效價為1:3200(圖2)。2G7、2G8、3E5、5D3、1E8、2C4和 2D11 的效價分別為 1:1800、1:1600、1:1900、1:1700、1:2000、1:1400 和1:1300。從效價檢測結果來看，4E11單抗腹水效價要遠遠高出其它7株雜交瘤細胞株單抗效價。
[0108]2.5單抗與原核重組蛋白ChIL-18的western blot的結果
[0109]分別將原核重組蛋白ChIL-18和未誘導的原核重組菌經SDS-PAGE電泳后，轉印至PVDF膜，以分別以篩選出的8株單抗的細胞培養上清為一抗，以IRDyeTM700DX標記山羊抗鼠IgG為二抗。
[0110]圖3為4E11陽性雜交瘤細胞株的細胞培養上清為一抗的western blot結果，表明單抗只與重組蛋白ChIL-18起反應，而不與未誘導的重組菌反應，說明單抗的特異性很好。2G7、2G8、3E5、5D3、1E8、2C4和2D11的單抗除了與重組蛋白ChIL-18起反應外，還與空載體菌體反應，說明特異性較差。
[0111]2.6利用單抗檢測感染MDV雞脾臟中的IL-18蛋白結果
[0112]以T-PER組織裂解液裂解感染MDV雞脾臟提取蛋白，利用4E11株細胞培養液上清及鼠抗3_八(^11單抗(1:1000稀釋)為一抗，以11?76"17000乂標記山羊抗鼠186 (1:4000稀釋)為二抗進行western blot反應，5個不同個體雞脾臟中均檢測到作為內參的43kDa的β -Actin蛋白，在其中4個不同個體雞脾臟中均能檢測到一條28kDa大小的蛋白，其中一只雞的脾臟中條帶較弱，但檢測到的蛋白均與天然ChIL-18蛋白24kDa相比稍大(圖4)。
【權利要求】
1.一株穩定分泌雞白介素-18單克隆抗體的雜交瘤細胞株4E11，其特征在于，其微生物保藏號為:CGMCC N0.7658。
2.由權利要求1所述雜交瘤細胞株4E11分泌的單克隆抗體。
3.權利要求1所述的雜交瘤細胞株4E11在制備檢測或診斷雞體內的IL-18蛋白試劑中的用途。
4.權利要求1所述的雜交瘤細胞株4E11在制備純化雞IL-18蛋白試劑中的用途。
5.權利要求2所述的單克隆抗體在制備檢測或診斷雞體內的IL-18蛋白試劑中的用途。
6.權利要求2所述的單克隆抗體在制備純化雞IL-18蛋白試劑中的用途。
7.按照權利要求4或6所述的用途，其特征在于，包括:將權利要求1雜交瘤細胞株4E11分泌的單克隆抗體吸附在惰性的固相基質上制備成層析柱；當樣品流經層析柱時，待分離的抗原與固相的單克隆抗體發生特異性結合，其余成分不能與之結合；將層析柱充分洗脫后，改變洗脫液的離子強度或PH，欲分離的抗原與抗體解離，收集洗脫液便得到純化的雞白介素-18蛋白。
8.—種診斷或檢測雞IL-18蛋白的ELISA檢測試劑盒，其特征在于:含有權利要求1所述雜交瘤細胞株4E11分泌的單克隆抗體。
【文檔編號】C07K1/22GK103589690SQ201310572459
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月15日 優先權日:2013年11月15日
【發明者】韓凌霞, 文輝強, 廉傳江, 司昌德, 林歡, 陳洪巖 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所, 哈爾濱動物生物制品國家工程研究中心有限公司