犬、貓長效融合干擾素及其制備方法與應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種由犬、貓血清白蛋白和干擾素組成的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?No1或2所示。本發明的犬、貓長效融合干擾素以延長干擾素半衰期、提高干擾素動物體內生物學活性，可以降低干擾素醫療制劑的成本，應用于犬、貓等動物疾病的防治工作中。
【專利說明】犬、貓長效融合干擾素及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及動物疾病預防治療【技術領域】，具體地涉及犬、貓長效融合干擾素及其制備方法與應用。
【背景技術】
[0002]干擾素(Interferon, IFN)是一類重要的細胞因子,是生物體細胞受到病毒或其它異源物質誘生劑做用而產生的分泌型糖蛋白，具有抗病毒、抑制細胞增殖、免疫調節等多種生物作用，對病毒病、細菌病、腫瘤等疾病都有良好的治療效果。但是干擾素在臨床應中半衰期短、在機體內易發生降解，這些難題限制了干擾素生物作用的完全發揮，直接影響了干擾素在臨床中的有效應用，所以如何延長干擾素半衰期，提高干擾素生物學活性的發揮效果成為研究的重點。目前除了 PEG、微囊緩釋技術等化學、物理修飾方法外，還有利用基因工程方法對干擾素蛋白進行重組改造，這些方法都顯示出了廣泛的應用前景。
[0003]當前已經投入臨床使用的犬、貓干擾素制品，均為原核表達系統表達生產的基因工程重組干擾素。這些產品沒有進行改良，其半衰期短，且成本高，限制了干擾素制品的實際應用。
[0004]目前，已有將人血清蛋白和干擾素α基因融合，通過基因重組表達技術獲得重組人血清白蛋白干擾素α融合蛋白，可以有效延長藥物蛋白的半衰期。但是，利用INFa與HSA融合蛋白是極其復雜的，如何設計融合蛋白的結構，使兩者都能保持相對獨立的生物學活性；如何構建高表達菌株并分離制備高純度的融合蛋白，對獲得的融合蛋白結構和生物學功能鑒定均需要進行充分的研究。目前還未見融合蛋白延長干擾素半衰期的方法在犬、貓干擾素中的應用。
【發明內容】
[0005]本發明目的是提供犬、貓長效融合干擾素，以用于犬、貓類動物疾病的臨床防治。
[0006]本發明另一目的是提供編碼上述犬、貓長效融合干擾素的基因。
[0007]本發明又一目的是提供上述犬、貓長效融合干擾素的制備方法，以適用于工業擴大化生產。
[0008]本發明再一目的是提供上述犬、貓長效融合干擾素在制備治療犬、貓類動物疾病的藥物中的應用。
[0009]本發明的犬長效融合干擾素的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，全長777個氨基酸組成，自氨基末端第I位至第608位為犬血清白蛋白，自氨基末端第614位至第777位為犬干擾素a，自氨基末端第609位至613位為柔性linker，編碼該融合蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0010]本發明的貓長效融合干擾素的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，全長883個氨基酸組成，自氨基末端第I位至第690位為貓白蛋白，自氨基末端第696位至第883位為貓干擾素ct ,自氨基末端第第691位至695位為柔性linker,編碼該融合蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0011]本發明還提供含有上述基因的的表達載體，含有上述融合蛋白或基因或表達載體的工程菌。
[0012]本發明還提供擴增上述基因中任一片段的引物序列。
[0013]本發明的犬、貓長效融合干擾素是用犬、貓血清白蛋白作為干擾素的修飾及穩定保護劑，將血清白蛋白和干擾素基因用柔性Linker基因連接后插入到酵母多拷貝表達載體pPIC3.5k的多克隆酶切位點區，并利用同源重組方法將表達基因重組進酵母基因組中，發酵培養重組酵母、誘導融合蛋白表達，純化得到犬、貓長效融合干擾素融合蛋白。
[0014]具體地，本發明犬、貓長效融合干擾素的制備工藝，包括以下步驟:
[0015]1、基因擴增與質粒構建:根據犬、貓血清白蛋白基因設計引物，PCR擴增得到犬、貓血清白蛋白基因的開放閱讀框，以犬、貓血清白蛋白天然信號肽作為融合蛋白的表達信號肽，在犬、貓血清白蛋白N端引入EcoR I酶切位點基因、C端去除終止密碼子后引入柔性Linker基因及酶切位點BamH I酶切位點基因；
[0016]根據犬、貓干擾素基因設計引物，PCR擴增得到犬、貓干擾素基因的開放閱讀框，去掉干擾素基因起始密碼子，在犬、貓干擾素基因N端與C端分別引入Bgl II, EcoR I酶切位點基因，用T4連接酶對犬、貓血清白蛋白基因與犬、貓干擾素基因在BamH I和Bgl II酶切位點處連接，并將連接的犬、貓血清白蛋白-干擾素融合基因插入經過EcoR I酶切的PPIC3.5k、pPIC9k或其它畢赤酵母表達載體中，分別構建犬、貓血清白蛋白-干擾素融合蛋白重組表達載體質粒；
[0017]2、酵母轉化與誘導培養:用同源重組法將經Sal I酶切線性化的重組表達載體轉化入酵母真菌SMD1168、GS1 15或其它畢赤酵母真菌基因組中，以甘油為唯一碳原和能源的培養基發酵培養重組酵母，以甲醇為唯一碳原和能源的培養基誘導表達融合蛋白；
[0018]3、蛋白純化與活性檢測:表達蛋白產物經SDS-PAGE電泳分析蛋白表達產物，經超濾濃縮、親和層析、脫鹽層析純化，采用體外細胞攻毒和體內接種后相關細胞因子檢測的方法檢測長效融合干擾素蛋白的生物學活性。
[0019]本發明還提供一種用于治療多種腫瘤及病毒性疾病的藥物，所述藥物含有上述融合蛋白。所述藥物還包括加入一種或多種藥學上可接受的載體。所述載體包括藥學領域常規的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑等。
[0020]本發明旨在于利用犬血清白蛋白(CSA)和貓血清白蛋白(FSA)的運輸和穩定性調節功能，使干擾素免受胰蛋白酶等消化酶的降解破壞，也可以降低動物腎小球濾過系統對干擾素融合蛋白代謝排除率，分別對犬干擾素(cIFN)、貓干擾素(HFN)進行融合修飾，分別制備犬血清白蛋白-干擾素(CSA-cIFN)融合蛋白、貓血清白蛋白-干擾素(FSA-flFN)融合蛋白，不僅延長了動物干擾素的半衰期，還有效的提高了干擾素動物機體內的治療及免疫調節功能，并充分發揮干擾素的生物學活性，達到更好的對動物疾病的防治目的。
[0021 ] 本發明的積極效果在于:選用了犬、貓血清白蛋白與干擾素進行融合表達制備犬長效融合干擾素、貓長效融合干擾素，以延長干擾素半衰期、提高干擾素動物體內生物學活性和治療效果。本發明獲得的犬、貓長效融合干擾素制劑以酵母表達制備融合蛋白，下游的蛋白純化工藝簡便，產品成本降低，也更利于融合干擾素制品的推廣，應用于犬、貓等動物疾病的防治工作中。【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1為pPIC3.5k-CSA-cIFN載體構建示意圖；
[0023]圖2為pPIC3.5k_FSA-fIFN載體構建示意圖；
[0024]圖3為犬、貓重組干擾素融合蛋白SDS-PAGE鑒定圖。
【具體實施方式】
[0025]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。
[0026]若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0027]實施例1犬、貓長效融合干擾素的制備
[0028]分別以CSA、FSA、cIFN、fIFN，進行重組犬、貓血清白蛋白-干擾素融合蛋白表達載體的構建。
[0029]犬、貓血清白蛋白-干擾素融合蛋白的制備步驟:
[0030]1、參照犬血清白蛋白(CSA)基因(NM_001003026.1 )、貓血清白蛋白(FSA)基因(NM_001009961.1)序列開放閱讀框及酵母表達載體pPIC3.5k物理圖譜設計引物并引入酶切位點，其間保留血清白蛋白天然信號肽，去除血清白蛋白終止密碼子，去除干擾素信號肽、起始密碼子。
[0031](I) CSA 上游引物:
[0032]CSAl:
[0033]5' -GCGAATTCGCCATGAAGTGGGTAACTTTTATTTCCCTCTTCTTTC-3',其中 5' 端含有EcoR I酶切位點；
[0034]CSA下游引物:
[0035]CSA2:
[0036]5' -TAGGATCCACCACCACCGACTAAGGCAGCTTGAGCAGCAGCAACGAG-3' ,其中 5' 端含有BamH I酶切位點和柔性Linker基因；
[0037](2)犬α干擾素(Μ28624.1)上游引物:
[0038]a -cIFNl:
[0039]5' -GCAGATCTAATATAGCGCAGCCAGGCCCAC-3'，其中 5' 端含有 Bgl II 酶切位點；
[0040]犬α干擾素下游引物:
[0041]a -cIFN2:
[0042]5' -GCCTTAAGGGTCTCATTTCCTCCTCCTGATTCT-3' ,其中 5' 端含有 EcoR I 酶切位點；
[0043](3) FSA 上游引物:
[0044]FSAl:
[0045]5'-GCGAATTCGCCATGGTCGACTTTGGCACAATGAAGT-3'，其中 5' 端含有 EcoR I 酶切位點.[0046]FSA下游引物:
[0047]FSA2:
[0048]5' -TAGGATCCACCACCACCGCAGCTGAGAGTCCCATCCGACTCTTA-3',其中 5' 端含有BamH I酶切位點和柔性Linker基因；
[0049](4)貓α干擾素(DQ220469.1)上游引物:
[0050]a -fIFNl:
[0051 ] 5' -GCAGATCTGCGCTGTCCTCTTCCTT-3'，其中 5' 端含有 Bgl II 酶切位點；
[0052]貓α干擾素下游引物:
[0053]a -fIFN12: [0054]5' -GCGAATTCTCATTTCTCGCTCCTTAA-3' ,其中 5' 端含有 EcoR I 酶切位點；
[0055]2、利用上述引物序列進行PCR反應
[0056]犬、貓血清白蛋白基因PCR體系:pfu530聚合酶0.2 μ 1，Buffer4 μ 1,2.5mMdNTPl.6μ 1，0.5μΜ上下游引物各1.6 μ 1，模板DNA200ng，二餾水補充體系至20 μ I ；
[0057]犬、貓干擾素基因PCR 體系:pfu530 聚合酶 0.2 μ 1，Buffer4 μ 1,2.5mMdNTPl.6μ 1，0.5μΜ上下游引物各0.5μ 1，模板DNA30ng，二餾水補充體系至20 μ I ；
[0058]PCR 反應條件:犬、貓 PCR 反應通用參數:95 V 5min ；95 V 30s, 60 V 30s，72°C lmin，35個循環后于72°C延伸IOmin ；
[0059]將各個PCR產物純化回收后，分別聯入pEASY-Tl載體(購自北京全式金生物技術有限公司)，并測序及酶切鑒定。分別將CSA與cIFN酶切產物連接、FSA與fIFN酶切產物連接，純化回收后再分別連入經EcoR I酶切的pPIC3.5k載體(購自Invitrogen公司),制備CSA-cIFN融合蛋白酵母表達載體pPIC3.5k_CSA_cIFN (圖1所示)，及FSA-flFN融合蛋白酵母表達載體PPIC3.5k-FSA-fIFN (圖2所示)，酶切和測序鑒定后，用Sal I分別線性化兩種表達載體，同源重組法分別轉化入畢赤酵母菌株SMDl 168中，G418抗生素梯度抗性篩選，得到高效表達的優勢表達菌株畢赤酵母菌。
[0060]2、以甘油為唯一碳原和能源的培養基發酵培養重組酵母，以甲醇為唯一碳原和能源的培養基誘導表達融合蛋白。
[0061]以甘油為唯一碳原和能源的培養基，即Buffered Glycerol-complexMedium(BMGY)培養基，配制方法如下:
[0062]1%酵母提取物
[0063]2%蛋白胨
[0064]IOOmM磷酸鹽緩沖液，pH6.0
[0065]1.34%YNB
[0066]4X10_5% 生物素
[0067]1% 甘油
[0068]以甲醇為唯一碳原和能源的培養基，即Buffered Methano 1-comp lexMedium(BMMY)培養基，配制方法如下:
[0069]1%酵母提取物
[0070]2%蛋白胨
[0071]IOOmM磷酸鹽緩沖液，ρΗ6.0
[0072]1.34%ΥΝΒ
[0073]4X10、生物素
[0074]0.5% 甲醇[0075]用BMGY培養基250~300轉/分鐘，震蕩發酵培養重組酵母菌至濃度0D600=2~6之間，3000轉/分鐘常溫離心收集重組酵母菌，改換BMMY培養基重懸重組酵母菌至濃度0D600=1，250~300轉/分鐘，震蕩培養重組酵母菌，誘導表達融合蛋白。
[0076]3、采用超濾濃縮、親和層析和脫鹽層析純化長效融合干擾素蛋白。
[0077]超濾濃縮用30KD的超濾膜，4000轉/分鐘水平離心超濾，100倍濃縮。
[0078]親和層析采用HiTrap Blue Hp柱,特異性親和層析血清白蛋白-干擾素融合蛋白。
[0079]脫鹽層析，用HiTrap Desalting柱脫鹽處理血清白蛋白_干擾素融合蛋白。經純化后得到犬、貓長效融合干擾素蛋白，結果如圖3所示，目的蛋白的純度在最初原液中為51.2%，純化后的蛋白純度達到88.7%，犬長效融合干擾素蛋白分子量約為95KD，貓長效融合干擾素蛋白分子量約為92KD，均與經過一定糖基化修飾后的蛋白分子量大小相符。
[0080]實施例2犬、貓長效融合干擾素的活性檢測
[0081]1、體外生物學活性檢測:采用WISH-VSV微量細胞病變抑制法檢測犬、貓長效融合干擾素體外生物學活性，將細胞計數為2.5 X 105~3.5 X 105個/ml的WISH細胞懸液接種于96孔細胞板，每孔100μ 1，37°C，5%C02條件下培養4~6h。準備完全培養液:10%牛血清MEM，測定培養液:7%牛血清MEM，攻毒培養液:3%牛血清MEM。用測定培養液稀釋標準樣品至103IU/ml，再將標準樣品稀釋液和待測誘導培養上清液做4倍倍比稀釋，共稀釋至412倍。將倍比稀釋的陽性對照標準品和待測的誘導培養上清液按濃度梯度對應加入已經鋪被WISH細胞的96孔板中，每孔 100μ 1，37°C 5%C02培養18~24h。棄上清，每孔加入100 μ I的VSV，攻毒劑量100TCID50，37°C，5%C02培養24h，顯微鏡觀察病變情況。經檢測犬長效融合干擾素效價為25X 104IU/ml，貓長效融合干擾素效價為22X 104IU/ml。
[0082]綜上所述本發明的犬、貓長效融合干擾素蛋白有較好的體外抗病毒活性。
[0083]2、體內生物學活性檢測:由于動物體內2'，5'-寡腺苷酸合成酶含量水平是檢測干擾素含量的一種指標，采用熒光定量PCR法，分別檢測接種犬、貓長效融合蛋白的實驗動物體內2'，5' -寡腺苷酸合成酶含量水平，檢測時間分別為O天，0.5天，I天，2天，3天，4天，5天,6天,7天,8天,9天，10天，11天，12天，13天，14天，15天，16天,得出結論兩種長效融合干擾素蛋白在動物體內可持續13天，具有較長的半衰期和較好的體內生物學活性。所得到的融合干擾素的長效結果明顯優于已經廣泛報道的非長效犬或貓干擾素制劑。
[0084]雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
【權利要求】
1.一種由犬、貓血清白蛋白和干擾素組成的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID Nol或2所示。
2.編碼權利要求1或2所示融合蛋白的基因。
3.根據權利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQID No3或4所示。
4.含有權利要求2或3所述基因的表達載體。
5.含有權利要求1所述融合蛋白的宿主細胞。
6.含有權利要求2或3所述基因的宿主細胞。
7.一種制備權利要求1所述融合蛋白的方法，包括以下步驟:將權利要求4所述的表達載體導入宿主細胞，誘導表達得到融合蛋白。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述宿主細胞為畢赤酵母，優選SMDl168或GSl 15，所述表達載體為畢赤酵母表達載體，優選pPIC3.5k或pPIC9k，更優選地，將SEQID N0.3或4所示的核苷酸序列插入pPIC3.5k的EcoR I酶切位點。
9.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，以甲醇為唯一的碳原和能源的培養基誘導表達，表達產物經過超濾濃縮、親和層析、脫鹽層析純化得到融合蛋白。
10.一種預防和/或治療腫瘤，和/或抑制病毒的藥物，其特征在于，含有權利要求1所述的融合蛋 白。
【文檔編號】C07K19/00GK103613668SQ201310566546
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月14日 優先權日:2013年11月14日
【發明者】夏振強, 鄭文文, 夏曉紅, 段旖 申請人:長春西諾生物科技有限公司