一種高純度酪蛋白磷酸肽制備方法
【專利摘要】一種高純度酪蛋白磷酸肽制備方法，是將酪蛋白加水溶解，用胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、凝乳蛋白酶和木瓜蛋白酶任意四中組成的復合蛋白酶和胃蛋白酶進行二次酶解，經殺菌，過濾后再經陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂二次純化處理，用水洗棄去水洗液后，再用濃度為0.5%-1%的鹽酸洗脫，納濾膜脫鹽、干燥而成。本發明可以有效提高酪蛋白磷酸肽的得率（≥17%）和純度（≥90%），所制得的酪蛋白磷酸肽無苦味，水溶性好、20%CPP的水溶液澄清透明，顏色為純白色粉末。本發明制備的乳源性酪蛋白磷酸肽的分子量主要在1000-5000之間，有利于人體吸收，是一種成本低，工藝簡單的制備方法，適合工業化生產。
【專利說明】一種高純度酪蛋白磷酸肽制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種以牛乳中酪蛋白為原料的高純度酪蛋白磷酸肽的制備方法。
【背景技術】
[0002]酪蛋白磷酸肽(CPP)是以牛乳酪蛋白為原料，通過生物技術制得，具有促進鈣、鐵、鋅等二價金屬離子吸收和利用的多肽，可用于各種營養、保健食品。酪蛋白磷酸肽是用胰酶或胰蛋白酶水解的酪蛋白，經過精制、純化制成，其核心結構為:一Se r (P) - Se r(P) — Se r (P) — G lu — G Iu — (Se r:絲氨酸，G Iu:谷氨酸，P:磷酸基)。這一結構中的磷酸絲氨酸殘基(一 Se r (P)—)成簇存在，在腸道PH弱堿性環境下帶負電荷，可阻止消化酶的進一步作用，使酪蛋白磷酸肽不會被進一步水解。酪蛋白磷酸肽能在小腸下端PH7~8環境下與鈣結合而抑制磷酸鈣沉淀的形成，使游離鈣保持較高的濃度，促進鈣的被動吸收。
[0003]盡管早在50年代，國外就開始了對酪蛋白磷酸肽的研究，但工業化制備的研究工作直到近年才真正開始，而我國在酪蛋白磷酸膚的研究方面較少。傳統酪蛋白磷酸肽生產工藝，技術含量低，酪蛋白磷酸肽含量低(最高CPP含量多為20%左右)、產品有苦味、顏偏黃等缺點。中國專利公開的“一種制備酪蛋白磷酸肽的方法”(201310054681.5)，采用在酪蛋白中加入蛋白酶進行酶解反應，利用超濾膜分離出酶解產物酪蛋白磷酸肽，產物酪蛋白磷酸肽經納濾膜脫鹽處理后即得。該方法操作簡單，設備要求低，收率高，產品質量好，而且反應溫度低，能實現產業化生產，但其采用單一蛋白酶酶解，酪蛋白磷酸肽得率和含量較低(最高產品含量為16%左右)、產品沒有進行脫苦。
[0004]本發明在傳統酪蛋白磷酸肽生產技術的基礎上，以牛乳中酪蛋白為原料，經過酶解、分離、純化、脫苦、膜過濾、干燥等工藝生產酪蛋白磷酸肽，促進酪蛋白磷酸肽產品的升級，提聞了廣品附加值。·
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種純度高、無苦味、水溶性好、流動性好、顏色為純白色的、工藝簡單可應用于實際生產、成本較低的酪蛋白磷酸肽的制備方法。
[0006]為解決上述問題，本發明所提供的一種酪蛋白磷酸肽的方法，包括以下步驟:
(1)加酪蛋白6-10倍質量的水，在40°C-50°C條件下攪拌溶解；
(2)加入復合蛋白酶進行酶解，酶解條件為:加酶量為酪蛋白質量的0.05%-0.2%，反應溫度40°C-50°C，反應時間I h -2h，pH 7.0_9.0，所述復合蛋白酶為胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、凝乳蛋白酶和木瓜蛋白酶中的任意四種的混合物，復合蛋白酶酶解之后，再添加酪蛋白質量的0.05%-0.1%的胃蛋白酶在溫度40°C -50°C、pH值4.0-5.0下再酶解lh-2h ；
(3)將溫度調節至8(T90°C，保溫20min-30 min，進行滅菌；(4)調pH值4.0-5.0，過濾除去未酶解的大分子蛋白沉淀；
(5)上清液調整pH為4.0-5.0，使用陽離子交換樹脂吸收純化lh-4h，過濾，濾液調整純化液pH為6.0-7.0,再使用陰離子交換樹脂進行純化lh-4h,先用水洗,棄去水洗液后,再用濃度為0.5%-1%的鹽酸洗脫；
(6)洗脫液利用超濾膜分離出酪蛋白磷酸肽，再用納濾膜脫鹽，得到小于5000D的酪蛋白磷酸肽液；
(7)經過冷凍干燥、噴霧干燥、真空干燥的任意一種，對得到的產物進行干燥成粉。
[0007]步驟(2)中，所述復合蛋白酶中，任意四種蛋白酶的質量配比為I~4:1~4:1~4:1~4。優化的是,胰蛋白酶:中性蛋白酶:堿性蛋白酶:凝乳蛋白酶=4:3:2:1,或胰蛋白酶:堿性蛋白酶:木瓜蛋白酶:中性蛋白酶=2:3:1:4，或中性蛋白酶:堿性蛋白酶:凝乳蛋白酶:木瓜蛋白酶=1:2:3:4。
[0008]步驟(6)中，所述的超濾膜截留分子量為5000D，納濾膜截留分子量為150D。
[0009]本發明采用由胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶制成的復合蛋白酶進行酶解一定時間之后，再用胃蛋白酶酶解，并采用先陽離子交換樹脂吸收純化，再使用陰離子交換樹脂進行純化的純化工藝，可以有效提高酪蛋白磷酸肽的得率
17%)和純度(酪蛋白磷酸肽含量>90%)，所制得的酪蛋白磷酸肽無苦味，水溶性好、20%CPP的水溶液澄清透明，顏色為純白色粉末。本發明制備的乳源性酪蛋白磷酸肽的分子量主要在1000-5000之間 ，有利于人體吸收，是一種成本低，工藝簡單的制備方法，適合工業化生產。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010]圖1為陰陽離子交換樹脂純化處理前所得酪蛋白磷酸肽(CPP)的高效液相色譜圖；
圖2為陽離子交換樹脂純化處理所得酪蛋白磷酸肽(CPP)的高效液相色譜圖；
圖3為陰離子交換樹脂純化處理所得酪蛋白磷酸肽(CPP)的高效液相色譜圖；
圖4為先陽離子交換樹脂純化處理，再陰離子交換樹脂純化處理所得酪蛋白磷酸肽(CPP)的高效液相色譜圖。
【具體實施方式】
[0011]實施例1:一種高純度酪蛋白磷酸肽的制備，包括以下步驟:
向反應釜中加純水150L，開攪拌200rpm，加熱至50°C，向反應釜中緩慢投入酪蛋白25Kg，將pH調至7.8 ;投入胰蛋白酶:中性蛋白酶:堿性蛋白酶:凝乳蛋白酶=4:3:2:1(質量比)混合制成的復合蛋白酶12.5g。酶解Ih后，將料液降溫到37°C，將pH調至4.0，加入12.5g胃蛋白酶，繼續酶解，Ih后酶解結束。調pH4.5滅酶，將溫度調節至90°C，保溫20 min。使用732陽離子交換樹脂吸收純化lh，過濾，濾液調整純化液pH為7.0,使用717陰離子交換樹脂進行純化lh，先用水洗，棄去水洗液后，再用1%的鹽酸洗脫。洗脫液調pH值6.8，采用5000D的超濾膜超濾，得到小于5000D的酪蛋白磷酸肽液，再用150D的納濾膜脫鹽。對濾液進行噴霧干燥，得到酪蛋白磷酸肽成品4.52kg，CPP含量≥90%，分子量為1000D-5000D，無苦味，水溶性好、20%CPP的水溶液澄清透明。[0012]實施例2:—種高純度酪蛋白磷酸肽的制備，包括以下步驟:
向反應釜中加純水200L，開攪拌200rpm，加熱至45°C，向反應釜中緩慢投入酪蛋白25Kg，將pH調至7.5 ;投入胰蛋白酶:中性蛋白酶:木瓜蛋白酶:凝乳蛋白酶=3:2:4:1混合制成的復合蛋白酶25g。酶解1.5h后，將料液降溫到40°C，將pH調至5，加入25g胃蛋白酶，繼續酶解，Ih后酶解結束。調pH4.6，將溫度調節至80°C，保溫30 min,滅酶。過濾除去未酶解酪蛋白等大分子蛋白沉淀，上清液使用001X7陽離子交換樹脂吸收純化lh，過濾，濾液調整純化液PH為6.5，使用美國Amberlite IRA-400陰離子交換樹脂進行純化2h，先用水洗，棄去水洗液后，再用1%的鹽酸洗脫。洗脫液調PH值6.8，采用5000D的超濾膜超濾，得到小于5000D的酪蛋白磷酸肽液，再用150D的納濾膜脫鹽。對濾液進行噴霧干燥，得到酪蛋白磷酸肽成品4.75kg，CPP含量≥90%，分子量為1000D-5000D，無苦味，水溶性好、20%CPP的水溶液澄清透明。
[0013] 實施例3:—種高純度酪蛋白磷酸肽的制備，包括以下步驟:
向反應釜中加純水250L，開攪拌200rpm，加熱至45°C，向反應釜中緩慢投入酪蛋白25Kg，將pH調至8.5 ;投入胰蛋白酶:堿性蛋白酶:木瓜蛋白酶:中性蛋白酶=2:3:1:4混合制成的復合蛋白酶50g。酶解2h后，將料液降溫到37°C，將pH調至4.5，加入12.5g胃蛋白酶，繼續酶解，Ih后酶解結束。調pH4.7，將溫度調節至85°C，保溫30 min，滅酶。過濾除去未酶解酪蛋白等大分子蛋白沉淀，上清液使用羅門哈斯AMBERJET UP6040陽離子交換樹脂吸收純化lh，過濾，濾液調整純化液pH為7.0,使用德國Lewatit M500陰離子交換樹脂進行純化2h，先用水洗，棄去水洗液后，再用0.6%的鹽酸洗脫。洗脫液調pH值5.0，采用5000D的超濾膜超濾，得到小于5000D的酪蛋白磷酸肽液，再用150D的納濾膜脫鹽。對濾液進行真空干燥，得到酪蛋白磷酸肽成品4.63kg，CPP含量≥90%，分子量為1000D-5000D，無苦味，水溶性好、20%CPP的水溶液澄清透明。
[0014]實施例4:一種高純度酪蛋白磷酸肽的制備，包括以下步驟:
向反應釜中加純水175L，開攪拌200rpm，加熱至50°C，向反應釜中緩慢投入酪蛋白25Kg，將pH調至8.0 ;投入中性蛋白酶:堿性蛋白酶:凝乳蛋白酶:木瓜蛋白酶=1:2:3:4混合制成的復合蛋白酶37.5g。酶解1.5h后，將料液降溫到37°C，將pH調至4.5，加入25g胃蛋白酶，繼續酶解，Ih后酶解結束。調pH4.6，將溫度調節至85°C，保溫30 min，滅酶。過濾除去未酶解酪蛋白等大分子蛋白沉淀，上清液使用三菱WK60L陽離子交換樹脂吸收純化2h，過濾，濾液調整純化液pH為6.8，使用SAlOAX陰離子交換樹脂進行純化2h，先用水洗，棄去水洗液后，再用0.8%的鹽酸洗脫。洗脫液調pH值6.0，采用5000D的超濾膜超濾，得到小于5000D的酪蛋白磷酸肽液，再用150D的納濾膜脫鹽。對濾液進行真空干燥，得到酪蛋白磷酸肽成品4.7kg，CPP含量≥90%，分子量為1000D-5000D，無苦味，水溶性好、20%CPP的水溶液澄清透明。
[0015]本發明中，復合蛋白酶和胃蛋白酶的二次酶解，可以有效提高酪蛋白磷酸肽的得率。為此，本發明用單一蛋白酶和實施例1-4所采用的復合蛋白酶和胃蛋白二次酶解作了對比試驗。結果表明，使用胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶或凝乳蛋白酶單一蛋白酶酶解，酪蛋白磷酸肽的得率分別為16 % >14.5% ,15.3%和14.8 %，二使用本發明實施例1_4的方法，酪蛋白磷酸肽的得率分別為18.08%, 18.0%、18.52%、18.88%，均遠遠高于使用單一蛋白酶酶解的酪蛋白磷酸肽的得率。[0016]采用復合蛋白酶酶解，還可以使酪蛋白磷酸肽(CPP)的分子量更小。實驗表明，單一酶水解，所得酪蛋白磷酸肽主要分子量段為3000D-8000D，采用復合蛋白酶(CPP)，酪蛋白磷酸肽(CPP)得率為主要分子量段1000D-5000D。
[0017]本發明實驗表明，陰、陽離子陽離子交換樹脂單獨純化處理和陰陽離子陽離子交換樹脂二次純化處理存在明顯差異。為此，本發明作了對比實驗，其結果見圖1、圖2、圖3、圖4所示。實現表明，采用先陽離子交換樹脂純化處理，再陰離子交換樹脂純化處理所得酪蛋白磷酸肽(CPP)的純度，明顯高于單獨用陰離子交換樹脂或陽離子交換樹脂單獨純化處理多的酪蛋白磷酸肽(CPP)的純度。`
【權利要求】
1.一種高純度酪蛋白磷酸肽制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)加酪蛋白6-10倍質量的水，在40°C-50°C條件下攪拌溶解； (2)加入復合蛋白酶進行酶解，酶解條件為:加酶量為酪蛋白質量的0.05%-0.2%，反應溫度40°C-50°C，反應時間I h -2h，pH 7.0_9.0，所述復合蛋白酶為胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、凝乳蛋白酶和木瓜蛋白酶中的任意四種的混合物，復合蛋白酶酶解之后，再添加酪蛋白質量的0.05%-0.1%的胃蛋白酶在溫度40°C -50°C、pH值4.0-5.0下再酶解lh-2h ； (3)將溫度調節至8(T90°C，保溫20min-30 min，進行滅菌； (4)調pH值4.0-5.0，過濾除去未酶解的大分子蛋白沉淀； (5)上清液調整pH為4.0-5.0，使用陽離子交換樹脂吸收純化lh-4h，過濾，濾液調整純化液pH為6.0-7.0,再使用陰離子交換樹脂進行純化lh-4h,先用水洗,棄去水洗液后,再用濃度為0.5%-1%的鹽酸洗脫； (6)洗脫液利用超濾膜分離出酪蛋白磷酸肽，再用納濾膜脫鹽，得到小于5000D的酪蛋白磷酸肽液； (7)經過冷凍干燥、噴霧干燥、真空干燥的任意一種，對得到的產物進行干燥成粉。
2.根據權利要求1所述的高純度酪蛋白磷酸肽制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述復合蛋白酶中，任意四種蛋白酶的質量配比為I~4:1~4:1~4:1~4:。
3.根據權利要求2所述的高純度酪蛋白磷酸肽制備方法，其特征在于，復合蛋白酶的質量配比為:胰蛋白酶:中性蛋白酶:堿性蛋白酶:凝乳蛋白酶=4:3:2:1，或胰蛋白酶:堿性蛋白酶:木瓜蛋白酶:中性蛋白酶=2:3:1:4，或中性蛋白酶:堿性蛋白酶:凝乳蛋白酶:木瓜蛋白酶=1:2:3:4。
4.根據權利要求1所 述的高純度酪蛋白磷酸肽制備方法，其特征在于，步驟(6)中，所述的超濾膜截留分子量為5000D，納濾膜截留分子量為150D。
【文檔編號】C07K1/36GK103571905SQ201310523826
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年10月30日 優先權日:2013年10月30日
【發明者】曹庸, 李雙祁, 劉飛, 彭維, 郭斌, 吳成順, 黃慧明, 王海波 申請人:廣州綠萃生物科技有限公司