一種單克隆抗體與抗原和基因以及它們的用途
【專利摘要】本發明公開了一種新的狂犬病病毒單克隆抗體、相應能夠用于制備高效價的單克隆抗體的抗原蛋白與編碼它們的基因以及它們的用途。本發明的單克隆抗體具有氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示的輕鏈可變區以及氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示的重鏈可變區，可以由保藏號為CGMCC?No.7956的雜交瘤細胞產生。本發明公開的抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：3所示，可以由堿基序列如SEQ?ID?NO：4所示的基因編碼。本發明的單克隆抗體與國外同類產品的效價相當，用于RFFIT檢測中時能夠表現出熒光強度和持久性均較高的特性。此外，以本發明的抗原蛋白作為抗原進行免疫而制得的單克隆抗體的效價較高。
【專利說明】一種單克隆抗體與抗原和基因以及它們的用途
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種狂犬病病毒單克隆抗體、狂犬病病毒的抗原蛋白、編碼它們的基 因以及它們的用途。
【背景技術】
[0002] 目前國際上通用的檢測狂犬病病毒（rabies virus)的快速熒光灶抑制試驗 (Rapid fluorescence focus inhibition test，RFFIT)方法：將固定量的病毒與系列稀釋 的待測血清和已知滴度的對照血清一起37°C溫育，加入敏感細胞懸液。再經溫育后，細胞 形成單層，這時用冷的丙酮固定，用熒光標記的狂犬病病毒核蛋白（NP)單克隆抗體染色，以 檢測未被中和的病毒的存在(熒光灶)，繼而計算每種待測血清中的抗體的效價。進行RFFIT 檢測都需要熒光標記的NP抗體，敏感高效的熒光標記狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體診斷 試劑是該技術的關鍵因素。
[0003] 狂犬病病毒在細胞培養中的產量較低，不易從狂犬病病毒顆粒獲得大量純化的 NP，加之狂犬病病毒的NP不含糖基，本身免疫較弱，不易制備抗NP抗體。目前這種關鍵試 劑在國內尚無獲得正式批準文號的熒光標記的狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體診斷試劑，而 進口產品則價格昂貴、周期長，所以快速檢測狂犬病病毒抗原和抗體的方法在國內一直未 能建立，嚴重影響了狂犬病的臨床診斷、疫苗質量控制和流行病學調查等項工作的進行。因 此，獲取新的狂犬病病毒抗體具有重大的意義。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種新的狂犬病病毒單克隆抗體、相應能夠用于制備高效價 的單克隆抗體的抗原蛋白與編碼它們的基因以及它們的用途。
[0005] 為了實現上述目的，第一方面，本發明提供了一種單克隆抗體，該單克隆抗體具有 氨基酸序列如SEQ ID N0 :1所示的輕鏈可變區以及氨基酸序列如SEQ ID N0 :2所示的重鏈 可變區。
[0006] 第二方面，本發明提供了一種雜交瘤細胞，該雜交瘤細胞的保藏號為CGMCC No.7956。
[0007] 第三方面，本發明提供了一種單克隆抗體，該單克隆抗體由保藏號為CGMCC No. 7956的雜交瘤細胞產生。
[0008] 第四方面，本發明提供了第一方面和/或第三方面所述的單克隆抗體在制備檢測 狂犬病病毒的試劑中的用途。
[0009] 第五方面，本發明提供了第一方面和/或第三方面所述的單克隆抗體在制備檢測 狂犬病病毒抗體的試劑中的用途。
[0010] 第六方面，本發明提供了一種用于檢測待檢樣本中狂犬病病毒抗體的試劑盒，該 試劑盒含有熒光標記的單克隆抗體和固定液，所述單克隆抗體為第一方面和/或第三方面 所述的單克隆抗體。 toon] 其中，所述待檢樣本一般為血清。
[0012] 所述固定液可以為75-85% (v/v)的丙酮水溶液。
[0013] 所述熒光標記可以為本領域常用的各種熒光標記,例如異硫氰酸熒光素（FITC)、 四乙基羅丹明（RB200)和羧基四甲基羅丹明（TAMRA)等。
[0014] 本發明的試劑盒還可以含有抗體稀釋液、洗液、標準品和封閉液等，本領域技術人 員能夠根據需要對此進行選擇，在此不再贅述。
[0015] 第七方面，本發明提供了一種抗原蛋白，該抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0 :3 所示。
[0016] 第八方面，本發明提供了一種編碼第七方面所述的抗原蛋白的基因。優選地，本發 明中編碼上述抗原蛋白的基因的喊基序列如SEQ ID N0 :4所不。
[0017] 第九方面，本發明提供了一種重組載體，該重組載體具有第八方面所述的基因。
[0018] 第十方面，本發明提供了一種轉化子，該轉化子含有第九方面所述的重組載體。
[0019] 第十一方面，本發明還提供了編碼第一方面所述的單克隆抗體的輕鏈和/或重鏈 的基因。
[0020] 編碼第一方面所述的單克隆抗體的輕鏈的基因的堿基序列可以如SEQ ID N0 :11 所示。
[0021] 編碼第一方面所述的單克隆抗體的重鏈的基因的堿基序列可以如SEQ ID N0 :12 所示。
[0022] 本發明的單克隆抗體與國外同類產品的效價相當，用于RFFIT檢測中時能夠表現 出熒光強度和持久性均較高的特性。此外，以本發明的抗原蛋白作為抗原進行免疫而制得 的單克隆抗體的效價較高。
[0023] 本發明的其他特征和優點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。
[0024] 生物保藏
[0025] 本發明的雜交瘤細胞為鼠雜交瘤細胞（Mouse Hybridoma)，于2013年7月12日被 保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(縮寫為CGMCC，地址：北京市朝陽 區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼：100101)，保藏編號為CGMCC No.7956。
【具體實施方式】
[0026] 以下對本發明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體 實施方式僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。
[0027] 實施例中，使用的狂犬病病毒由中國疾病預防控制中心從北京市患狂犬病的病犬 大腦中分離得到，DMEM和胎牛血清（fetal serum of bovine，FBS)均購自Thermo公司。實 施例中，未注明具體條件的實驗方法的，均按照常規條件進行。
[0028] 實施例1
[0029] (1)抗原蛋白的制備
[0030] 參照《分子克隆實驗指南》第三版（J.薩姆布魯克等人，科學出版社，2002)第7-8 章，提取狂犬病病毒感染細胞的全RNA (該操作委托中國疾病預防控制中心完成)、逆轉錄得 到相應的cDNA、以逆轉錄得到的cDNA為模板進行PCR擴增，PCR使用的上游引物如SEQ ID NO :5所示，下游引物如SEQ ID NO :6所示。
[0031] 上游引物：5' -GAACCATATGGATGCCGACAAGATTGTG-3'（SEQ ID NO :5)
[0032] 下游引物：5' -ACCTCGAGTTATGAGTCATTCGAATACG-3'（SEQ ID NO :6)
[0033] 委托華大基因對PCR擴增獲得的基因進行測序，得到其堿基序列如SEQ ID NO :4 所示。
[0034] TTATGAGTCATTOGAATAOGTCTTGTTTAGAAACTCGGCGAATGAGTTTGGACGGGCTTGATGATTGGAACT
[0035] GACTGAGACATATCTCOGTATATGOGATCTTTTTAGTOGACCTCCATTCATCATAATTCGAGCATAAACAGC
[0036] TTCTGGACCTCTGGTTTCACOGGAGAAGTAGTCTTCGTCATCAGAGTTGACAGTTCCATCATCTGCCAATGC
[0037] CAOGTCAGTCTTTGTCAGTTCAGCTGCCTCGTATTCTTGAAGTTCTTTCTCATCTCTGAAGAATCTTCTTTC
[0038] GAATGTTCCTCTCCCAAAGAATTCCTCCCCTAGATAGCCCCCTAGAACAGACATCTCATGAGGAGCACATGC
[0039] GGCAATAACTGTTGCATTTAGGGATCTGATTTGACCCATATAGCATCCAACAAAGTGAATAAGATTGAACAC
[0040] ATGACCAAOGGCATTCGATGAATAAGGAGACTTCCCACTCAAGCCTAGTGAACGGAAGTGAATGAAATAAGA [0041 ] GTGAGGAACAGCOGTCTCCTGCCCTGGCTCGAACATTCTTCTTATCTCTTCCTCAAAGTTCTTATGGAAGAA
[0042] GTACAATATTGCTTCTCTTGOGGTGAGATTGATCTGCTTTATGAACCCAGTAAACGATACCAGCCCTGAACA
[0043] GTCTTCATAAGCAGTAACAACTGTGCCCGCTCTGATTGCTGAATATAGATGCTCAATCCGAGAGAAAAACAT
[0044] GTOGTAGGTTCCGGCCAAAAATCTGAAGTTOGGTATGGTACTCCAATTAGCACACATTTTGTGAGTTGTCAT
[0045] TAGAGTATGGTGCTCCACGATTTTAACAAAAGGAGCTGTTTCAAAAATCTGCTCTATCCTATCTGCAATGTT
[0046] TGTTTTATAGTTACOGGTGTTTTGTCCTGATATTTTGCTCAACCTATACAGACTTAGGAGAAGACCAACCAA
[0047] AGATGCATGCTCAGAGACGGTGGGGTCCCTTGTCATCTCCATGCCTCCTGTCAGAGCCCAATTCCCTTCTAC
[0048] ATCATTACGTTTTATTTCCACCAGAGAATTTGGGGTGATCTTGTCTCCTTTTCGTGCAATCACGATTCCATA
[0049] GCTGGTCCAGTCTTCCGGACACGTCCCCTCAAAGAACTGCATTGCTGCTGCCAAGTAGGAACATACATCGTC
[0050] GGGATCAAGTTTGGOGGCATTCATGCCTGATAAAACTGATTTGTATGCTTTGTTCAAGTOGGGGGCTTTCCC
[0051] TAGGGTTATACAGGGCTTTTTCAAATCTTTGATAGCAGGGTACTTGTACTCATATTGATCCGCGATAATCTC
[0052] AGGCCTCAAAGAGACCACCTGATTATTAGCTCTGAACACAATCTTGTOGGCATCCAT (SEQ ID NO ：4)
[0053] 參照《分子克隆實驗指南》第三版（J.薩姆布魯克等人，科學出版社，2002)第1章 和第15章，將堿基序列如SEQ ID NO :4所示的基因連接到pET28a+(帶有His-tag)的Ndel 酶切位點與Xhol酶切位點之間，得到重組質粒pET28a+-RV，將重組質粒pET28a+-RV轉化入 原核表達菌株大腸桿菌BL21中，篩選陽性克隆并通過PCR(引物如SEQ ID N0:5和SEQ ID NO :6所示)驗證目的基因的成功導入，從而制備能夠表達上述基因的轉化子，培養轉化子并 超聲破碎菌體而獲得含有抗原蛋白的溶液，純化后得到濃度為12. 5mg/ml的抗原蛋白（氨 基酸序列如SEQ ID N0 :3所示)溶液，-80°C保存備用（純化的具體操作為：取含有抗原蛋白 的溶液，〇. 45um濾膜過濾后用DEAE離子親和層析對相應的抗原蛋白做純化處理，純化后對 樣品進行SDS-PAGE電泳檢測，選擇含有抗原成分的最佳的洗脫溶液，進一步進行鎳柱親和 純化)。
[0054] MDADKIVFRANNQWSLRPEIIADQYEYKYPAIKDLKKPCITLGKAPDLNKAYKSVLSGMNAAKLDPDDVCS
[0055] YLAAAMQFFEGTCPEDWTSYGIVIARKGDKITPNSLVEIKRNDVEGNWALTGGMEMTRDPTVSEHASLVGLL
[0056] LSLYRLSKISGQNTGNYKTNIADRIEQIFETAPFVKIVEHHTLMTTHKMCANWSTIPNFRFLAGTYDMFFSR
[0057] IEffi,YSAIRAGTWTAYEDCSGLVSFTGFIKQINLTAREAILYFFHKNFEEEIRRMFEPGQETAVPHSYFIH
[0058] FRSLGLSGKSPYSSNAVGHVFNLIHFVGCYMGQIRSLNATVIAACAPHEMSVLGGYLGEEFFGRGTFERRFF
[0059] RDEKELQEYEAAELTKTDVALADDGTVNSDDEDYFSGETRGPEAVYARIMMNGGRLKRSHIRRYVSVSSNHQ
[0060] ARPNSFAEFLNKTYSNDS (SEQ ID NO ：3)
[0061] (2)雜交瘤細胞的獲得
[0062] 根據《精編免疫學實驗指南》（科利根等人，科學出版社，2009)中第2章記載的方 法，用步驟（1)得到的抗原蛋白對雌性Balb/c小鼠進行免疫，采用有限稀釋法進行亞克隆， 并通過ELISA (可以參照《精編免疫學實驗指南》（科利根等人，科學出版社，2009)第1章單 元1. 1的基本方案部分）篩選陽性克隆子，最終選取陽性結果最好，即抗體表達量最佳的克 隆細胞株，經培養后保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號為CGMCC No. 7956， 保藏日期為2013年7月12日。
[0063] (3)單克隆抗體的制備
[0064] 參照《精編免疫學實驗指南》（科利根等人，科學出版社，2009)第1章培養步驟 (2)獲得的雜交瘤細胞CGMCC No. 7956,并參照《精編蛋白質科學實驗指南》（科利根等人， 科學出版社，2007)第8章從培養液中提取純化單克隆抗體，獲得純化的單克隆抗體(或參 照CN101560255A中權利要求2記載的方法獲得)。
[0065] (4)單克隆抗體可變區氨基酸序列的確定
[0066] 參照《分子克隆實驗指南》第三版（J.薩姆布魯克等人，科學出版社，2002)第7-8 章或《精編免疫學實驗指南》（科利根等人，科學出版社，2009)中記載的方法，從雜交瘤細胞 中提取mRNA，采用逆轉錄PCR方法分析編碼單克隆抗體的基因序列，進而分析相應的單克 隆抗體的氨基酸序列，使用的引物如表1所示，測得cDNA序列分別如表2中的SEQ ID N0 : 11 (輕鏈)和SEQ ID NO :12 (重鏈)所示，從而獲得單克隆抗體可變區氨基酸序列分別如表 2中的SEQ ID N0 :1 (輕鏈）和SEQ ID N0 :2 (重鏈）所示。
[0067] 表 1
[0068]
【權利要求】
1. 一種單克隆抗體，該單克隆抗體具有氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示的輕鏈可變區 以及氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的重鏈可變區。
2. -種雜交瘤細胞，該雜交瘤細胞的保藏號為CGMCC No. 7956。
3. -種單克隆抗體，該單克隆抗體由保藏號為CGMCC No. 7956的雜交瘤細胞產生。
4. 權利要求1或3所述的單克隆抗體在制備檢測狂犬病病毒的試劑中的用途。
5. 權利要求1或3所述的單克隆抗體在制備檢測狂犬病病毒抗體的試劑中的用途。
6. 用于檢測待檢樣本中狂犬病病毒抗體的試劑盒，該試劑盒含有熒光標記的單克隆抗 體和固定液，所述單克隆抗體為權利要求1或3所述的單克隆抗體。
7. -種抗原蛋白，該抗原蛋白的氣基酸序列如SEQ ID NO :3所不。
8. -種編碼權利要求7所述的抗原蛋白的基因。
9. 根據權利要求8所述的基因，其中，該基因的堿基序列如SEQ ID NO :4所示。
10. -種重組載體，該重組載體具有權利要求8或9所述的基因。
11. 一種轉化子，該轉化子含有權利要求10所述的重組載體。
12. -種編碼權利要求1所述的單克隆抗體的輕鏈和/或重鏈的基因。
13. 根據權利要求12所述的基因，其中，編碼輕鏈的基因的堿基序列如SEQ ID NO :11 所示，編碼重鏈的基因的堿基序列如SEQ ID NO :12所示。
【文檔編號】C07K14/145GK104109205SQ201310516761
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2013年10月28日 優先權日:2013年10月28日
【發明者】紀軍 申請人:紀軍