一種改造的trail基因序列、表達方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種改造的TRAIL基因序列，改造后的野生型TRAIL編碼cDNA序列見SEQ?ID?NO2；改造后的突變體TRAIL編碼cDNA序列見SEQ?ID?NO3；改造后的突變體TRAIL基因編碼氨基酸序列見SEQ?ID?NO4。將上述的改造的TRAIL基因序列的編碼cDNA克隆于表達載體pTWIN1上。本發明還公開了將上述的改造的TRAIL基因編碼氨基酸序列用作抗腫瘤藥物的用途。本發明與現有TRAIL表達載體構建及表達分析文獻對比，以非融合方式表達TRAIL蛋白，可溶性表達比例最高為90%以上；本發明方法構建的工程菌具有好的放大和產業化前景。
【專利說明】—種改造的TRAIL基因序列、表達方法及應用【技術領域】[0001]本發明主要涉及基因工程藥物領域，特別是涉及到調整蛋白質N端編碼氨基酸序列，改造TRAIL胞膜外段蛋白質編碼基因堿基序列，得到一改造后的TRAIL胞膜外段野生型序列及一改造后的TRAIL胞膜外段突變體序列；采用經NdeI和PstI雙酶切的去除了 Intein區域(約1549bp)的pTWINl載體連接，得到了幾乎完全可溶的目的蛋白表達。將表達宿主菌大規模培養，采用三步層析方法純化，制備出純度超過95%的目的蛋白，目的蛋白在體外具有較強的抗腫瘤活性。新方法表達的TRAIL野生型及突變體蛋白極具發展潛力和優勢，可能發展成為新型誘導腫瘤細胞凋亡藥物。【背景技術】[0002]腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TNF-relatedapoptosis-1nducing ligand, TRAIL)為腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor, TNF)超家族的成員，其基因序列分別于 1995 年由 Wiley 等人(Wiley et al.1995)和 1996 年由 Pitti 等人(Pitti et al.1996)獨立克隆獲得，后者將其命名為凋亡素2配體(Apo21igand, Apo2L)。后來的研究證實Apo2L 與TRAIL實為同一種蛋白，因此習慣上可將其稱為Apo2L/TRAIL。[0003]人Apo2L/TRAIL 的編碼基因定位于染色體 3q26 (Miriani and Krammer.1998), 完整的Apo2L/TRAIL的cDNA序列編碼全長為281個氨基酸的前體蛋白，其相對分子質量為32.5kDa。天然的Apo2L/TRAIL蛋白表現為II型跨膜蛋白，分細胞外C端區域、跨膜區、 細胞內N端區域等三部分。Apo2L/TRAIL的N端l_14aa為短小的胞內段，無信號肽序列； 第15-40位aa為疏水區，形成跨膜結構；C端第41-281位aa為胞外區，保守性強。C端能形成幾個β折疊，再形成典型的β夾心結構，進而形成同源三聚體的亞單位，胞外區為蛋白發揮功能的主要結構區。Apo2L/TRAIL前體蛋白在特定的蛋白酶作用下水解形成可溶性 TRAIL,其第 114_281aa 為蛋白質的可溶性片段(Miriani and Krammer.1998)。[0004]人Apo2L/TRAIL的C端(胞外區)序列與TNF和Fas配體一樣高度保守，人TRAIL 分子的胞外區與Fas配體、腫瘤壞死因子α、淋巴毒素-α和淋巴毒素-β的同源性分別為 28%、23%和22% (Wiley et al.1995)。TRAIL與TNF家族其他成員最獨特的區別在于其第 137-152位形成一個12-16個aa的插入環(AA’ loop)，此結構可插入受體的TRAIL結合位點，保證受體與TRAIL的特異性結合。結構突變研究證實，此插入環在TRAIL細胞毒性中起著關鍵的作用。晶體結構研究表明，Apo2L/TRAIL分子為一個同源三聚體分子，內部含有一個Zn原子，Zn原子同時與三個配體亞單位的第230位半胱氨酸連接，通過相互作用以維持分子的穩定(Hymowitz，et al.2000)。TRAIL是TNF家族中唯一的具有一個Cys殘基的成員，Zn原子的結合對于同源三聚體的穩定性和生物活性至關重要(Bodmer et al.2000 ； Hymowitz, et al.2000)。Jean等研究證實,如將第230位半胱氨酸(Cys)突變 為絲氨酸或丙氨酸后，TRAIL將形成無活性的二聚體結構，與受體的親和力將下降200倍，嚴重影響TRAIL 誘導細胞凋亡的活性(Jean et al.2000)。[0005]TRAIL的功能首先是作為生物體先天性或獲得性免疫的調節劑，其次在細胞外源性凋亡途徑過程中發揮重要作用，作為免疫監視在抗腫瘤過程中發揮重要作用。TRAIL的最大優點是可以選擇性地誘導多種腫瘤細胞凋亡而對正常細胞幾乎沒有毒性。研究資料表明，Apo2L/TRAIL無論在體外，還是體內對于各種來源的人腫瘤細胞系，包括結(直)腸癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、腎癌、中樞神經系統腫瘤、甲狀腺癌、淋巴瘤、白血病以及多發性骨髓瘤等都具有誘導凋亡的作用(Ashkenazi et al.1999 ;Ashkenazi2002)。[0006]從TRAIL發現至今近20年時間里，TRAIL —直被作為一個重要的潛在抗腫瘤藥物開發，TRAIL的臨床試驗在國外已 進入II期，在國內已完成III期。大量體內外試驗均證實， TRAIL具有腫瘤特異性細胞毒性，尤其當它與小劑量化療藥物聯用時即表現出明顯的協同和增效作用。相反，研究發現機體中凋亡機制的缺失導致的TRAIL耐受與腫瘤細胞的快速生長和轉移明確相關。[0007]長期以來，大腸桿菌一直是外源蛋白的首選表達系統。但由于外源蛋白在表達過程中容易被宿主細胞蛋白酶降解或者形成包涵體，其應用受到了限制。在很多情況下，表達蛋白形成非可溶性形式并聚集成所謂的“包涵體”，包涵體的形成妨礙有活性、結構正確的蛋白質獲得，這種情況尤其發生在高水平蛋白表達的情況下。特定目的蛋白的可溶性與多種因素相關。首先影響蛋白質可溶性表達的因素是這個蛋白的氨基酸構成(WWW.biotech.0u.edu)。在大多數情況下，蛋白質表達的可溶性并不是“全或無”的現象。載體、宿主菌或發酵條件都可以用以調整可溶性目的蛋白和包涵體的比例。其中正確選擇載體、宿主菌和發酵條件對于提高活性目的蛋白的量和比例會有顯著幫助。[0008]TRAIL重組表達載體的構建及表達分析已經大量見諸報道，但表達產物大部分以包涵體形式存在，可溶性表達產物的比例較低。TRAIL蛋白需采用包涵體變性、復性方法純化，包涵體純化方法不僅操作繁瑣、目的蛋白回收率低，而且不能直接獲得具有正確構象的目的蛋白，目的蛋白復性困難，生物活性較低。這些不足之處使得TRAIL的生產效率較低、 生產工藝復雜、成本過高，大大影響了 TRAIL的應用開發。[0009]表1TRAIL原核表達研究文獻分析[0010]
【權利要求】
1.一種改造的TRAIL基因序列，其特征在于，改造后的野生型TRAIL編碼cDNA序列見 SEQ ID N02。
2.根據權利要求1所述的改造的TRAIL基因序列，其特征在于，改造后的突變體TRAIL 編碼cDNA序列見SEQ ID N03。
3.根據權利要求1所述的改造的TRAIL基因序列，其特征在于，改造后的突變體TRAIL 編碼氨基酸序列見SEQ ID N04。
4.根據權利要求1至3任一所述的改造的TRAIL基因序列的改造方法，其特征在于，包括以下步驟:設置連續或不連讀的多個精氨酸序列；避免在編碼一氨基酸三聯密碼子的后兩位出現連續相同的兩個堿基；提高編碼前10個氨基酸基因序列堿基中GC含量的比例，使其處于 40-70%范圍內。
5.根據權利要求1至3任一所述的改造的TRAIL基因序列，其特征在于，將其編碼cDNA 克隆于表達載體PTWINl上。
6.根據權利要求5所述的改造的TRAIL基因序列，其特征在于，所述表達載體pTWINl 中切除Intein內含肽序列。
7.根據權利要求5所述的改造的TRAIL基因序列，其特征在于，表達的誘導溫度為 20。。。
8.根據權利要求5所述的改造的TRAIL基因序列，其特征在于，所述表達載體采用 BL21 (DE3)宿主菌表達。
9.根據權利要求1至3任一所述的改造的TRAIL基因序列，其特征在于，所述改造的 TRAIL基因編碼氨基酸序列分離純化采用Ni+親和層析、陽離子交換層析或陰離子交換層析。
10.一種權利要求1至3任一所`述的改造的TRAIL基因編碼氨基酸序列用作抗腫瘤藥物的用途。
【文檔編號】C07K14/705GK103555729SQ201310479275
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月14日 優先權日:2013年10月14日
【發明者】陳守春, 潘鳳, 閆娟, 徐琦, 胡海洋, 黃先洲 申請人:成都華創生物技術有限公司