干擾素α突變體及其聚乙二醇衍生物的制作方法
【專利摘要】本發明屬于生物醫藥領域，涉及復合干擾素半胱氨酸突變體、其聚乙二醇衍生物，后者的制備方法、藥物組合物和兩者在制備治療病毒性疾病的藥物中的用途。所述的復合干擾素半胱氨酸突變體是將復合干擾素氨基酸序列中從N端計的第82位的氨基酸突變為半胱氨酸；所述的復合干擾素半胱氨酸突變體的聚乙二醇衍生物是由所述的復合干擾素半胱氨酸突變體與聚乙二醇修飾劑連接得到，所述的聚乙二醇修飾劑的分子量在5KDa-40KDa之間。本發明的復合干擾素半胱氨酸突變體及其聚乙二醇衍生物有更高的生物學活性，更好的藥理作用與穩定性，并具有更可靠的安全性。
【專利說明】干擾素Cl突變體及其聚乙二醇衍生物[0001]本申請是申請日為2012年2月23日，申請號為201210043385.0，發明名稱為“干擾素α突變體及其聚乙二醇衍生物”的分案申請。
【技術領域】
[0002]本發明一般的涉及干擾素α突變體、其聚乙二醇衍生物，后者的制備方法、藥物組合物和兩者在制備治療病毒性疾病的藥物中的用途，特別的涉及復合干擾素半胱氨酸突變體、其聚乙二醇衍生物，后者的制備方法、藥物組合物和兩者在制備治療病毒性疾病的藥物中的用途。
【背景技術】
[0003]干擾素(interferon，IFN)是一種最初由動物機體產生的具有廣譜抗病毒作用的細胞因子類藥物，根據其產生部位與作用機理不同可以分為α、β、Y、λ等大的類型，而每種大的類型又可分為若干小的亞型，同一大的類型中不同的亞型間在一級結構上差異很小，在二級以上高級結構上非常接近。在幾種大的類型中，α型是應用最廣的一種，目前臨床應用的此型干擾素主要包括干擾素a 2a、干擾素a 2b、干擾素a lb、復合干擾素等。其中復合干擾素(consensus interferon或integrated interferon)是在對已知的α型干擾素進行序列比對后，把出現頻率最高的氨基酸分配到各自相應的位置，并對個別位置進行修改后得到的非天然氨基酸序列的人工設計α型干擾素，包括多種氨基酸序列的分子，但彼此間同源性高，它們的生物學活性為天然α型干擾素的10倍以上。
[0004]雖然各種α型干擾素在當前治療病毒性感染疾病的過程中發揮著越來越廣泛的療效，但是其自身穩定性差、半衰期短的特點也限制了其進一步的臨床推廣應用，給病人用藥帶來了一些麻煩。鑒于此原因，國內外開展了很多長效干擾素方面的基礎研究與產品開發，包括對干擾素分子自身進行改造、研發包括干擾素分子氨基酸序列的融合蛋白、對干擾素分子進行化學修飾、選擇適宜的藥物輸送體系優化干擾素分子的體內輸送與藥效發揮過程等，其中聚乙二醇修飾干擾素(屬于化學修飾的干擾素)的上市是在這一領域取得的最大成功。
[0005]聚乙二醇(polyethelene glycol, PEG)是一種線性高分子化合物，由于其良好的生物相容性和既親水又親酯的雙親特性，得以從眾多的化學修飾劑中脫穎而出成為目前研究與應用最廣的蛋白多肽類藥物的修飾劑。經過多年的研究開發，目前已有兩個PEG修飾的干擾素α產品成功上市，分別是美國先靈葆雅(Schering-Plough)公司(現已被默沙東公司收購)的PEG修飾的干擾素a2b (商品名為“佩樂能”)和瑞士羅氏(Roche)公司的PEG修飾的干擾素a2a (商品名為“派羅欣”)，分別于2001年和2002年在美國上市，在2003年同時進入中國內地銷售。關于先靈葆雅公司的PEG修飾的干擾素a2b，在中國專利申請CN00808452.1中對其配方組成有所描述；而羅氏公司的PEG修飾的干擾素a 2a則在中國專利CN97113049.3中有詳細描述。除此之外，還有更多的PEG修飾的干擾素α產品正在研究開發中，其中最接近上市階段的是Intermune公司開發的PEG修飾的復合干擾素。[0006]縱觀PEG修飾干擾素α技術的發展，主要是伴隨著PEG修飾技術的發展。早期的研究和開發主要圍繞非特異性位點PEG修飾技術，所選用的PEG修飾劑純度低、分子量小(一般在IOKDa以下)且分布范圍寬、修飾位點種類和數量多且形成的修飾衍生物不穩定，造成修飾產物組成不均一、純度相對較低(85%左右)、質量控制不易實現、長效作用不明顯且仍有一定的毒副作用。上述先靈葆雅公司的PEG修飾的干擾素a 2b產品就屬于此類型。伴隨著PEG修飾劑的發展出現了特異性位點PEG修飾技術，由于所選用的PEG修飾劑的純度得到了很大提高，分子量可達20KDa以上且分布范圍大幅縮窄，且修飾機理的改善使修飾位點種類和數量減少，形成的修飾衍生物穩定性提高，從而使上述非特異性位點PEG修飾技術的缺點得到了很大程度的改善。 [0007]特異性位點PEG修飾技術又可分為三種類型，一種是用具有分支結構的PEG修飾劑修飾目標蛋白分子，借助分支結構PEG修飾劑較強的空間位阻效應達到減少修飾位點數量的目的。上述羅氏公司的PEG修飾的干擾素a2a產品就屬于此類型。但是由于這種所謂的“特異性位點”修飾技術從修飾機理上既不能做到只修飾單一種類的氨基酸，也不能做到只修飾單一位點的氨基酸，所以修飾位點的種類與數目依然眾多，如中國專利CN200380103341.1公開了分支結構PEG修飾的干擾素a 2a (包括羅氏公司的PEG修飾干擾素a 2a產品“派羅欣”)具有12個修飾位點的異構體。
[0008]第二種是修飾蛋白質分子N末端氨基酸的自由α-氨基，原理是蛋白質N末端氨基酸的自由α-氨基與蛋白質其它位點中賴氨酸的自由ε-氨基相比具有更低的pKa值，可以在更低的PH下與氨基修飾劑發生修飾反應。但是由于這種pH選擇反應的特異性并不是太高，即使在較低的PH下仍可發生賴氨酸的自由ε -氨基上的修飾反應，且修飾過程可能遮蔽蛋白質分子的活性位點，造成修飾產物活性大大降低，因此這種修飾技術在實際應用中也受到限制。
[0009]第三種是用巰基修飾劑修飾蛋白質分子半胱氨酸上的巰基，由于蛋白質分子中的半胱氨酸數量很少，且多數半胱氨酸上的巰基用于形成分子內或分子間二硫鍵，只有極少的游離巰基可供修飾，所以這種修飾反應的特異性很高。如中國專利申請CN200510076676.X公開了一種巰基PEG修飾劑修飾的干擾素a lb，利用了干擾素a Ib分子中只有一個自由巰基的特點用巰基PEG修飾劑對其進行修飾。但是此種技術實際拓展應用的最大問題是天然蛋白質分子中基本上沒有游離的半胱氨酸殘基，即使有也會因非常明顯的影響蛋白質分子的穩定性和純化過程(容易形成分子內或分子間二硫鍵)而使用于修飾的蛋白質純品不易得到，使修飾過程無法實現(因為一旦形成分子內或分子間二硫鍵就沒有可供修飾的游離半胱氨酸)；且選擇天然位點的半胱氨酸進行修飾同樣可能遮蔽蛋白質分子的活性位點，造成修飾產物活性大大降低。上述PEG修飾的干擾素a Ib就因干擾素a Ib自身較低的生物活性和修飾后活性殘留率也較低，從而使最終的PEG修飾產物活性更低，實際應用效果有待論證。
[0010]另外干擾素α種類亞型眾多，序列中有許多位點可供改變以產生活性更高的突變干擾素α產物，如美國專利US4695623、US4897471、US5372808就公開了一種活性為天然序列干擾素α 10倍以上的復合干擾素分子。所以也可利用干擾素α的這一特點選擇活性高、穩定性好與毒性低的突變干擾素α進行PEG修飾，以提高或改善修飾產物的藥效、藥代與安全性，前述Intermune公司的PEG修飾的復合干擾素就屬于此類型,又如中國專利申請CN02159951.3也公開了一種分支結構PEG修飾劑修飾的復合干擾素。但是單一利用此種技術依然不能解決修飾產物組成不均一、純度差、質量控制不易實現、長效作用不明顯且仍有一定毒副作用的問題。
【發明內容】
[0011]本發明的首要目的是提供一種復合干擾素的半胱氨酸突變體，以解決現有的干擾素α中沒有游離的半胱氨酸殘基可供特異性位點巰基PEG修飾劑修飾或所具有或突變的游離半胱氨酸殘基位點不理想，造成蛋白質分子不穩定、活性低、分離純化困難而不利于特異性位點PEG修飾劑修飾的問題。
[0012]為實現此目的，在基礎的實施方案中，本發明的復合干擾素的半胱氨酸突變體將復合干擾素氨基酸序列中從N端計的第80-82位之一的氨基酸突變為半胱氨酸，分別具有SEQ ID N0.1-3所示的氨基酸序列。
[0013]本發明選擇將復合干擾素氨基酸序列中從N端計的第80-82位之一的氨基酸突變為半胱氨酸基于突變前后分子計算機空間結構預測結果、已知的干擾素α與受體結合原理及己知的干擾素a 2a與干擾素α 2b的空間結構。
[0014]為了獲得復合干擾素半胱氨酸突變體，需要先后進行表達復合干擾素半胱氨酸突變體分子的基因工程菌或基因工程細胞的構建、基因工程菌或基因工程細胞的發酵和發酵產物的純化，優選進行表達復合干擾素半胱氨酸突變體分子的大腸桿菌工程菌的構建、發酵和發酵產物的純化。
[0015]在基因工程菌或基因工程細胞的構建過程中，首先需要獲得并擴增表達復合干擾素半胱氨酸突變體的基因，采用的方法優選本領域技術人員公知的PCR法，并更加優選本領域人員公知的重疊延伸PCR法。在大量獲得表達復合干擾素半胱氨酸突變體的基因后選擇適宜的載體，用本領域技術人員公知的構建重組載體的方法將表達復合干擾素半胱氨酸突變體的基因轉入所述載體從而構建重組載體。所述載體和重組載體優選質粒載體，該質粒載體應具有一組或多組雙酶的各自單一的酶切位點，并適宜被轉入對應的宿主菌或宿主細胞。
[0016]然后首先制備感受態的宿主菌或宿主細胞，再利用電穿孔法、PEG法等本領域技術人員公知的方法將重組載體轉入宿主菌或宿主細胞構建表達復合干擾素半胱氨酸突變體的基因工程菌或基因工程細胞。所述的宿主菌或宿主細胞優選大腸桿菌、畢赤酵母和CHO細胞，并更優選大腸桿菌。
[0017]工程菌或工程細胞的發酵應選擇適宜其生長的培養基組成、pH、溫度、通氣量、培養時間與補料操作等條件。對于大腸桿菌工程菌的發酵，優選LB培養基，培養過程中的溫度控制在30-37°C之間，pH控制在6.0-8.0之間(必要時選擇pH調節劑控制pH，所述的pH調節劑包括但不限于NaOH、氨水及各種各種有機氮源，優選氨水)，通氣量應滿足菌體或細胞的生長需要及產物表達合成的需要，培養時間與補料操作的方式相關，在采取適宜的補料操作條件的情況下培養時間為6-48小時之間。
[0018]復合干擾素半胱氨酸突變體蛋白如果表達在工程菌或工程細胞內，需要對發酵培養收獲的菌體或細胞進行破碎處理以釋放出其中的復合干擾素半胱氨酸突變體蛋白。而對于大腸桿菌等原核的工程菌，更需要破碎處理以釋放出以包涵體形式表達的復合干擾素半胱氨酸突變體蛋白。常用的破碎方法包括但不局限于超聲波破碎、球磨機破碎、溶菌酶處理
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[0019]對于以包涵體形式表達的復合干擾素半胱氨酸突變體蛋白，需要對破碎處理得到的粗包涵體進行洗滌操作以盡可能除去其中含有的少量菌體蛋白、膜蛋白等雜蛋白。洗滌過程中使用的緩沖液包括但不局限于Tris-HCl、PB，洗滌過程的pH值應控制在7.0-9.0之間。為了溶解較難溶解的疏水蛋白質雜質，可在洗滌緩沖液中加入一定量的鹽，常用的為NaCl，濃度范圍在0.05-0.5mol/L之間；為了溶解疏水性更強的膜蛋白，可在洗滌緩沖液中加入一定量的表面活性劑，常用的此類表面活性劑包括但不限于吐溫-80、十二烷基磺酸鈉(SDS)、TritonX-100，濃度在 0.01-5%之間。[0020]由于在破碎過程中菌體或細胞會釋放出一些蛋白水解酶，從而有可能降解復合干擾素半胱氨酸突變體，因此需要在破碎過程中及破碎后的洗滌過程中加入一些物質來抑制這些蛋白水解酶的活性，最直接的方法是加入蛋白酶抑制劑，如胰蛋白酶抑制劑，間接的方法也可加入金屬離子螯合劑，如EDTA，因為金屬離子螯合劑可以螯合這些蛋白水解酶發揮水解作用所必須依靠的金屬離子。
[0021]洗滌得到的包涵體變性溶解可以使用7-10mol/L的尿素或5_8mol/L的鹽酸胍，必要時還需要加入巰基試劑以提高變性劑的溶解效力，所述的巰基試劑包括但不局限于巰基乙醇、二硫蘇糖醇。溶解所采用的包涵體/變性劑的質量/體積比(g/ml)可以在1:3到1:50之間，優選的在1:5到1: 30之間，最佳的在1:7到1:20之間。變性溶解時間應該在2小時以上。
[0022]包涵體復性可以采用稀釋復性法、透析復性法或柱上復性法。稀釋復性法是通過一步或多步稀釋用復性液將變性劑的濃度稀釋到0.5mol/L以下，以使蛋白質分子在擺脫變性劑影響的情況下逐漸復性；透析復性法是用10倍以上體積的復性液對變性液進行透析以使變性劑的濃度降低到0.5mol/L以下，同樣起到復性的作用；柱上復性法是將變性液直接上離子交換、疏水、分子排阻(凝膠)色譜柱，然后用含不斷降低變性劑濃度的洗脫溶液進行梯度洗脫以同時實現目標蛋白的分離純化與復性。
[0023]復性液的基本組成是pH在5.0-10.0之間的緩沖溶液，以保證復性所需的基本堿性環境，可以滿足這種要求的緩沖溶液包括但不局限于Tris-HCl、硼酸鈉緩沖液。為了防止復性過程中復性速度過快形成二硫鍵錯配，需要在復性液中加入一些氧化型和還原型巰基試劑對組成的氧化還原平衡體系物質，如氧化型谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽組成的氧化還原平衡體系。同時為了防止復性速度過快造成蛋白質折疊不完全、二硫鍵錯配，可以在上述基本組成的復性液中添加一些其它物質，如精氨酸、EDTA、金屬離子及各種分子伴侶物質等。這些物質的選擇及加量在現有技術中有很多報道，這里不再贅述。
[0024]上述稀釋復性法和透析復性法得到的復性液，以及通過破碎直接得到的含有可溶性形式表達的復合干擾素半胱氨酸突變體的離心上清，以及以可溶性形式表達的復合干擾素半胱氨酸突變體的發酵培養液離心上清，都需進行進一步的色譜分離純化。利用復合干擾素半胱氨酸突變體分子與雜質分子在親和性質、電荷性質、疏水性質、分子量大小上的差異可以先后選擇親和色譜、離子交換色譜、疏水色譜、凝膠分離色譜中的一種或幾種的組合進行純化。為了更好的達到分離作用，在色譜分離純化前可對待分離液進行濃縮處理，可以選擇的方法包括但不局限于有機溶劑沉淀后反溶、鹽析后反溶、聚乙二醇濃縮、超濾及色譜處理等。
[0025]色譜分離純化獲得的復合干擾素半胱氨酸突變體分子可用本領域技術人員公知的SDS-PAGE電泳加考馬斯亮藍染色法或高效液相色譜法確定純度；用質譜法確定分子量；用《中華人民共和國藥典2010版(三部)》附錄部分規定的“干擾素活性測定法”和“蛋白質含量測定法”，以測定得到的干擾素活性除以蛋白質濃度確定復合干擾素半胱氨酸突變體的比活性。
[0026]其中高效液相色譜純度檢測法可以采用反相高效液相色譜法或分子排阻高效液相色譜法，但優選分子排阻高效液相色譜法，因為此種方法更為方便、準確、快捷。采用分子排阻高效液相色譜法時要求色譜柱的理論板數大于10000，上樣量在5-100 μ I之間，優選10-50 μ I之間，色譜分離時間為主峰出峰時間的3倍。
[0027]穩定性考察是將色譜分離純化得到的復合干擾素半胱氨酸突變體溶液在20_45°C的環境下長期存放3-6個月，在此過程中定期取樣觀察外觀的變化，并檢測純度、活性等主要質量控制指標的變化。
[0028]色譜分離純化獲得的復合干擾素半胱氨酸突變體分子還需進行動物藥代試驗評價與動物急性毒性試驗評價。
[0029]在一種優選的實施方案中，本發明的復合干擾素半胱氨酸突變體將復合干擾素氨基酸序列中從N端計的第80位的氨基酸突變為半胱氨酸，其具有SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列。
[0030]在一種優選的實施方案中，本發明的復合干擾素半胱氨酸突變體將復合干擾素氨基酸序列中從N端計的第81位的氨基酸突變為半胱氨酸，其具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。
[0031]在一種優選的實施方案中，本發明的復合干擾素半胱氨酸突變體將復合干擾素氨基酸序列中從N端計的第82位的氨基酸突變為半胱氨酸，其具有SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列。
[0032]本發明的第二個目的是提供如上所述的復合干擾素半胱氨酸突變體的聚乙二醇修飾衍生物，以解決現有干擾素α聚乙二醇衍生物組成不均一、純度活性低、質量控制不易實現或長效作用不明顯且仍有一定毒副作用等問題。
[0033]為實現此目的，在基礎的實施方案中，本發明的聚乙二醇衍生物由所述的復合干擾素半胱氨酸突變體與聚乙二醇修飾劑連接得到，所述的聚乙二醇修飾劑的分子量在5KDa-40KDa 頓之間。
[0034]在一種優選的實施方案中，所述的聚乙二醇修飾劑是巰基聚乙二醇修飾劑，選自馬來酰亞胺PEG修飾劑、乙烯砜基PEG修飾劑、碘乙酰胺PEG修飾劑或鄰吡啶基二硫化物PEG修飾劑中的一種。
[0035]為獲得所述的聚乙二醇衍生物進行的PEG修飾反應主要受修飾劑的種類、溫度、蛋白質濃度、pH、蛋白質/修飾劑質量/摩爾比、攪拌速度、添加劑及修飾反應時間等因素的影響。
[0036]用于特異性位點巰基修飾的PEG修飾劑根據PEG活化基團與修飾反應機理的不同主要有馬來酰亞胺PEG修飾劑(mPEG-maleimide, mPEG-MAL)、乙烯砜基PEG修飾劑(mPEG-vinylsulfone, mPEG-VS)、碘乙酸胺 PEG 修飾劑(mPEG-1odoacetamide，mPEG-1A)與鄰批卩定基二硫化物PEG修飾劑(mPEG-orthopyridyl disulfide，mPEG-OPSS)，結構分別如下(作為示例性結構主要給出活化基團的結構，但活化基團不局限于與一個mPEG連接)。
【權利要求】
1.復合干擾素突變體，其特征是將復合干擾素氨基酸序列中從N端計的第82位的氨基酸突變為半胱氨酸，氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
2.根據權利要求1所述的復合干擾素突變體的聚乙二醇衍生物，其特征是所述的聚乙二醇衍生物由所述的復合干擾素突變體與聚乙二醇修飾劑連接得到，所述的聚乙二醇修飾劑的分子量在5KDa-40KDa之間。
3.根據權利要求2所述的聚乙二醇衍生物，其特征是所述的聚乙二醇修飾劑是巰基聚乙二醇修飾劑，選自馬來酰亞胺PEG修飾劑、乙烯砜基PEG修飾劑、碘乙酰胺PEG修飾劑或鄰吡啶基二硫化物PEG修飾劑中的一種。
4.根據權利要求2所述的聚乙二醇衍生物，其特征是所述的聚乙二醇修飾劑的分子量在 10KDa-20KDa 之間。
5.根據權利要求2-4之一所述的聚乙二醇衍生物的制備方法，包括如下步驟: 1)制備濃縮的所述的復合干擾素突變體溶液，使其濃度達到2.0-20mg/ml，并使所述的復合干擾素突變體所處的緩沖溶液體系轉換為適宜進行聚乙二醇修飾反應的緩沖溶液體系; 2)將上述得到的濃縮的復合干擾素突變體溶液與所述的聚乙二醇修飾劑接觸進行修飾反應； 3)對修飾反應后得到的混合物進行色譜分離純化，以除去其中未參與修飾反應的聚乙二醇修飾劑和未參與修飾反應的所述的復合干擾素突變體，并除去連接有多個聚乙二醇分子的復合干擾素聚乙二醇衍生物。
6.根據權利要求2-4之一所述的聚乙二醇衍生物的藥物組合物，其特征是含有治療有效量且安全量的所述的聚乙二醇衍生物和適宜量的可藥用載體。
7.根據權利要求1-4之一所述的復合干擾素突變體或其聚乙二醇衍生物在制備治療病毒性疾病的藥物中的用途。
【文檔編號】C07K14/56GK103467592SQ201310468337
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2012年2月23日 優先權日:2012年2月23日
【發明者】周敏毅, 劉金毅, 程永慶 申請人:北京三元基因工程有限公司